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右懿钟离
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1 中国组织工程研究第 18 卷第 18 期出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research April 30, 2014 Vol.18, No.18 体外受精 - 胚胎移植的助孕效果 : 胚胎体外培养和低温保存王芳, 陈绍威 ( 四川省泸州医学院附属医院生殖医学技术部, 四川省泸州市 ) 文章亮点 : 文章特点在于从临床实际应用出发, 结合作者的治疗经验, 详细介绍了体外受精胚胎移植过程中卵母细胞采集胚胎培养的方法, 重点讨论了胚胎接触微环境的控制 ; 同时, 介绍了胚胎的低温保存技术的应用, 重点讨论冷冻保护剂及载体的选择关键词 : 实验动物 ; 组织构建 ; 体外受精 ; 胚胎移植 ; 不孕 ; 胚胎 ; 体外培养 ; 低温保存 ; 促排卵 ; 临床妊娠率主题词 : 受精, 体外 ; 胚胎移植 ; 低温保存 ; 妊娠 ; 生殖技术, 辅助摘要背景 : 从第一例试管婴儿诞生至今已二十余年, 体外受精 - 胚胎移植技术在世界范围内得到蓬勃发展目的 : 回顾性分析体外受精 - 胚胎移植的助孕效果, 探讨体外受精胚胎的培养及低温保存技术的应用方法 :2013 年泸州医学院附属医院生殖医学技术部接受体外受精 - 胚胎移植或卵细胞浆内单精子注射助孕的不孕患者 131 例, 共 147 个取卵周期,124 个移植周期, 患者平均年龄岁有 131 个取卵周期应用标准长方案促排卵,4 个取卵周期应用超长方案促排卵 10 个取卵周期应用超短方案促排卵,2 个取卵周期为自然周期排卵 ; 应用新鲜胚胎移植 93 例, 冷冻胚胎移植 28 例观察不同促排卵方案新鲜或冷冻胚胎移植患者的临床妊娠率胚胎植入率和流产率等结果与结论 : 应用标准长方案超长方案及超短方案促排卵患者的临床妊娠率为 34.7%,50%,20%; 植入率分别为 19.1%,22.2%,30%; 流产率为 21.7%,50%,33.3%; 以上指标自然周期排卵患者均为 0 新鲜胚胎移植临床妊娠率 33.6%, 植入率 18.1%, 流产率 20.1%; 冷冻胚胎移植临床妊娠率 53.8%, 植入率 22.3%, 流产率 20.7% 提示应用标准长方案促排卵效果好, 新鲜及冷冻胚胎移植的疗效相当, 胚胎的体外培养及低温冷冻是辅助生殖技术中重要步骤, 需进一步深入研究王芳, 女,1969 年生, 重庆市人, 汉族,1991 年泸州医学院毕业, 副主任医师, 主要从事辅助生殖临床研究 doi: /j.issn [ 中图分类号 :R318 文献标识码 :B 文章编号 : (2014) 稿件接受 : 王芳, 陈绍威. 体外受精 - 胚胎移植的助孕效果 : 胚胎体外培养和低温保存 [J]. 中国组织工程研究,2014, 18(18): Reproductive effects of in vitro fertilization-embryo transfer: in vitro culture and cryopreservation of embryos Wang Fang, Chen Shao-wei (Department of Reproductive Medicine, Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou , Sichuan Province, China) Abstract BACKGROUND: Since the first successful birth of a "test tube baby", in vitro fertilization-embryo transfer technology has been greatly developed within 20 years. OBJECTIVE: To retrospectively analyze the assisted reproductive effects of in vitro fertilization-embryo transfer, and to explore the culture of embryos in vitro and the application of cryopreservation technology. METHODS: A total of 131 infertile patients received in vitro fertilization-embryo transfer or intracytoplasmic sperm injection in Department of Reproductive Medicine, Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, China. There were 147 oocyte retrieval cycles and 124 transfer cycles, the mean age of the patients was years. Standard long-protocol ovulation induction was given to 131 oocyte retrieval cycles, super-long-protocol ovulation induction was given to 4 oocyte retrieval cycles, and super-short-protocol ovulation induction was given to two oocyte retrieval cycles; 93 cases were transplanted with fresh embryos and 28 cases with frozen embryos. The clinical pregnancy rate, embryo implantation rate and abortion rate of patients receiving different ovulation induction protocols and fresh or frozen embryo transfer were observed. RESULTS AND CONCLUSION: In the patients receiving standard long, super-long and super-short protocols for ovulation induction, the clinical pregnancy rate was respectively 34.7%, 50%, 20%; the embryo implantation rates were 19.1%, 22.2%, 30%; and abortion rate was 21.7%, 50%, 33.3%; in those patients, no case exhibited natural cycle of ovulation. In the patients receiving fresh embryo transfer, the clinical pregnancy rate was 33.6%, embryo implantation rate was 18.1%, and abortion rate was 20.1%; in frozen embryo transferred patients, the clinical pregnancy rate was 53.8%, embryo implantation rate was 22.3%, and abortion rate was 20.7%. Experimental findings indicate that, standard long-protocol ovulation induction has good effects, the efficacy of fresh embryo transfer is equivalent to that of frozen embryo transfer, in vitro culture and cryopreservation of the embryos are important steps in assisted reproductive technology and deserver further study. Wang Fang, Department of Reproductive Medicine, Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou , Sichuan Province, China Accepted: ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 2939

2 Subject headings: fertilization in vitro; embryo transfer; cryopreservation; pregnancy; reproductive technology, auxiliary Wang F, Chen SW. Reproductive effects of in vitro fertilization-embryo transfer: in vitro culture and cryopreservation of embryos. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(18): 引言 Introduction 体外受精 - 胚胎移植 (IVF-ET) 技术, 又称试管婴儿, 是指从活体卵巢内取出成熟卵子, 在体外放入模拟人体内的试管或培养皿内, 和精子经体外受精, 使卵子与精子进行结合, 待受精卵发育成胚胎后, 再移植到女性子宫内着床, 发育成胎儿, 分娩体外受精 - 胚胎移植发展到今天, 从常规试管婴儿技术到单精子注射技术 [1-2] 胚胎遗传病诊断技术至卵浆置换技术, 世界范畴内的成功率已从原来的 20% 提高到了 60%, 而且遗传病的发生率也大为降低 [3-4] 体外受精 - 胚胎移植技术融合了生殖医学胚胎学内分泌学遗传学以及显微镜操作等技术, 其中胚胎体外培养是辅助生殖技术中的关键性步骤, 旨在获得高质量的胚胎 [5-7] ; 而在体外受精 - 胚胎移植技术实施过程中, 经常需要运输或临时保存新鲜的卵母细胞或胚胎, 细胞一旦活体开始原代培养, 它的生物特性都将逐渐发生变化, 需要及时冻存细胞, 在有必要时再进行细胞复苏, 以达到维持和保存细胞系的目的, 因此低温冷冻保存已经成为人类辅助生殖技术 (ART) 中必不可少的一个环节 [8-9] 近年来, 胚胎的体外培养及低温冷冻保存技术已经成为体外受精 - 胚胎移植领域研究的热点 [10-11], 本文报道 2013 年在泸州医学院附属医院生殖医学技术部进行体外受精 - 胚胎移植或卵细胞浆内单精子注射的不孕患者 131 例的资料, 在此基础上, 结合本院的具体临床经验, 重点讨论体外受精胚胎移植过程中卵母细胞采集培养以及胚胎的低温保存技术的应用 1 对象和方法 Subjects and methods 设计 : 病例回顾性分析时间及地点 :2013 年 1 月 8 日至 12 月 10 在泸州医学院附属医院生殖医学技术部完成对象 :2013 年 1 月 8 日至 12 月 10 在泸州医学院附属医院生殖医学技术部接受体外受精 - 胚胎移植或卵细胞浆内单精子注射 (ICSI-ET) 助孕的不孕患者 131 例, 共 147 个取卵周期,124 个移植周期, 患者平均年龄岁不孕类型 : 盆腔及输卵管因素 104 例, 占 79.4%; 子宫内膜异位症 6 例, 占 4.6%; 排卵障碍 26 例, 占 19.8%; 原因不明性不孕 4 例, 占 3.0%; 男方梗阻性无精症 4 例, 占 3.0%; 男方严重少弱畸精症 19 例, 占 14.5% 患者纳入标准 :1 年龄 40 岁 2 基础促卵泡生长激素 5-15 U/L 3 超声证实宫腔正常, 子宫肌瘤或子宫腺肌症病灶直径 3 cm, 治疗前均进行了模拟移植 4 患者对治疗均知情同意, 并签署知情同意书患者排除标准 :1 年龄 >40 岁 2 基础促卵泡生长激素 > 15 U/L 3 子宫肌瘤或子宫腺肌症病灶直径 >3 cm, 子宫内膜病变或先天性子宫发育异常 147 个取卵周期中 131 例为第 1 次助孕,16 例为第 2 次助孕 ; 移植 1 个胚胎的共 10 例患者 10 个移植周期, 移植 2 个胚胎的共 94 例患者 98 个周期, 移植 3 个胚胎的共 15 例患者 16 个周期 ; 新鲜胚胎移植 93 例 95 个移植周期, 冷冻胚胎移植 28 例患者 29 个移植周期方法 : 取卵前临床检查 : 女方行常规体检和妇科检查不孕症病因学相关检查生殖内分泌检查重要系统功能检查感染性疾病或性传播性疾病检查卵泡监测及性激素测定男方行常规体格检查和男科检查精液检查生殖内分泌检查染色体核型检查健康检查及病原学检查促排卵方案 : 方案 n 实施方法标准长方案 131 个取卵周期, 于治疗周期前的黄体中期或口服避孕药占 89.1% 17 d 时开始降调节, 降调节 14 d 后达到降调标准即启动 Gn( 促性腺激素 ) 超长方案 4 个取卵周期, 占 2.72% 应用促性腺激素释放激素激动剂 (GnRH-a, 曲普瑞林 )3.75 mg,28 d 给药 1 次, 连续 3 次, 最后一次注射第天查血促卵泡生长激素促黄体生成素雌二醇, 达 Gn 启动标准则开始 Gn 超短方案 10 个取卵周期, 占 6.8% 月经第 2 天 GnRH-a 0.1 mg/d 3 d, 月经第 3 天注射 HMG 或促卵泡生长激素 3-5 支至 HCG 日自然周期方案 2 个取卵周期, 占 1.36% B 超监测卵泡接近成熟时予以 HCG ( 重组绒促性素 ) 体外受精及培养 : 取卵后三四个小时, 将精子和卵子放在一起进行体外受精或进行单精子卵细胞浆内注射从培养箱中取出卵子预培养皿和已调整好精子密度的精子制备液向卵子预培养皿中根据卵子的多少, 按照每个卵子 (3-5) 10 4 个精子的比例加入精子将受精培养皿放回体积分数 5%CO 2 37 培养箱中继续培养 4-9 h 动作尽量要快, 以避免 ph 值及温度的改变胚胎质量评价标准 : 胚胎的卵裂球均匀无碎片为 Ⅰ 级胚胎 ;Ⅱ 级胚胎 : 胚胎的卵裂球均匀伴小碎片 ;Ⅲ 级胚胎 : 胚胎的卵裂球不均匀无碎片胚胎移植方法 : 经过 h 的培养, 选择 1-3 个质量好的胚胎在 B 超监测下放入女方子宫内, 剩余质量好的胚胎将予以冷冻保存备用移植后 14 d 左右, 检查尿或血 HCG 确定是否妊娠胚胎冷冻方法 : 培养 72 h 的卵裂期胚胎, 根据女方年龄,<35 岁的按 2 枚胚胎 / 管进行冷冻, 35 岁的 3 枚胚胎 / 管进行冷冻 ; 采用日本加藤公司玻璃化冷冻试剂盒, 冷冻 2940 P.O. Box 10002, Shenyang

3 试剂包括平衡液 (Equilibration Solution,ES) 冷冻液 (Vitrification Solution,VS), 取 0.5 ml 平衡液 ES 冷冻液 VS 于 Falcon 3037 皿内 24 室温下平衡, 将胚胎移入平衡液 ES 中 5-20 min, 然后移入冷冻液 VS 中, 充分混匀后迅速将胚胎置于冷冻载体 Cryotop 顶端, 并立刻投入液氮中, 时间控制在 60 s 内胚胎解冻方法 : 采用日本加藤公司玻璃化解冻试剂盒, 解冻试剂含有解冻液稀释液洗液 1 和洗液 2; 将 0.5 ml 解冻试剂取出在室温下平衡, 并取解冻液 TS 于 Falcon 3653 皿中置于 37 预温, 将要解冻患者的胚胎从液氮中取出, 迅速将 Cryotop 顶端置于解冻液中 1 min, 然后在室温下依次将胚胎转入稀释液洗液 1 洗液 2 中 3 min 5 min 和 5 min 最后将胚胎移入平衡过的培养液中, 置于 37 体积分数 5%CO 2 的培养箱中培养 2 h 等待移植临床妊娠诊断标准 : 指标评价标准植入率着床胚胎总数 / 移植胚胎总数妊娠率妊娠数 / 移植周期数应用标准长方案促排卵患者的临床妊娠率为 34.7%, 植入率为 19.1%, 流产率为 21.7%; 应用超长方案促排卵患者的临床妊娠率为 50%, 植入率为 22.2%, 流产率为 50%; 应用超短方案促排卵患者的临床妊娠率为 20%, 植入率为 30%, 流产率为 33.3%; 按自然周期排卵患者的临床妊娠率植入率及流产率均为 0( 图 1) 2.3 新鲜胚胎移植与冷冻胚胎移植患者移植后临床指标观察应用新鲜胚胎移植 93 例, 冷冻胚胎移植 28 例, 两组基本情况见表 2 百分率 (%) 临床妊娠率植入率流产率标准长方案超长方案超短方案自然周期流产率临床妊娠率多胎妊娠率生化妊娠率流产数 / 妊娠数临床妊娠例数 / 治疗周期数多胎妊娠例数 / 临床妊娠例数仅血或尿 HCG 阳性而未达临床妊娠的例数 / 妊娠数图 1 采用不同促排卵方案患者的妊娠结果 Figure 1 Pregnancy of the involved patients 表 2 新鲜胚胎移植与冷冻胚胎移植患者基本情况 Table 2 Baseline information of patients receiving fresh or frozen embryo transfer 主要观察指标 : 临床妊娠率, 胚胎植入率和多胎妊娠率等 2 结果 Results 2.1 参与者数量分析按意向性处理分析,131 例的资料均进入结果分析 2.2 不同促排卵方案患者基本情况及妊娠结果应用标准长方案促排卵 131 个取卵周期, 应用超长方案促排卵 4 个取卵周期, 应用超短方案促排卵 10 个取卵周期, 自然周期排卵 2 个取卵周期, 不同促排卵方案患者的基本情况见表 1 表 1 不同促排卵方案患者的一般情况比较 Table 1 Comparison of baseline information of involved patients 项目标准长方案超长方案超短方案自然周期取卵周期年龄 ( 岁 ) 不孕年限 ( 年 ) 基础卵泡 ( 个 ) 9.8± ± ±1.8 3±2 基础促卵泡生长激素 (U/L) 7.3± ± ± ±2.9 Gn 天数 Gn 总剂量 (U) 内膜厚度获卵数可用胚胎数 , 优质胚胎数项目新鲜胚胎移植冷冻胚胎移植例数年龄 ( 岁 ) 不孕年限 ( 年 ) 基础促卵泡生长激素 (U/L) 8.9± ±1.8 Gn 天数 ( 前一取卵周期 ) Gn 总剂量 (U) ( 前一取卵周期 ) 内膜厚度获卵数 ( 前一取卵周期 ) 可用胚胎数 ( 前一取卵周期 ) 优质胚胎数 ( 前一取卵周期 ) 表注 : 本院均采用自然周期或替代周期冷冻胚胎移植百分率 (%) 新鲜胚胎移植冷冻胚胎移植临床妊娠率植入率流产率图 2 新鲜胚胎移植与冷冻胚胎移植患者的妊娠结果 Figure 2 Pregnancy of patients receiving fresh or frozen embryo transfer ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 2941

4 新鲜胚胎移植 93 例 95 个周期, 移植胚胎数 171 个, 临床妊娠率 33.6%, 植入率 18.1%, 流产率 20.1%; 冷冻胚胎移植 28 例 29 个周期, 移植胚胎数 67 个, 临床妊娠率 53.8%, 植入率 22.3%, 流产率 20.7%( 图 2) 2.4 不同胚胎移植数量患者临床指标比较移植 1 个胚胎的 10 个周期中有 1 例临床妊娠, 移植 2 个胚胎的 98 个周期中有 34 例临床妊娠, 其中 4 例为多胎妊娠 ; 移植 3 个胚胎的 16 个周期中有 2 例临床妊娠, 无多胎妊娠移植 1 个胚胎的胚胎植入率为 10%, 移植 2 个胚胎的胚胎植入率为 23.5%, 移植 3 个胚胎的胚胎植入率为 8.3% 见表 3, 图 3 表 3 不同移植胚胎数量患者各临床指标比较 Table 3 Clinical index of patients receiving different embryos transfer 项目移植胚胎数量 n 平均年龄 ( 岁 ) 移植周期数 (n) 临床妊娠率 (%) 胚胎植入率 (%) 多胎妊娠率 (%) 生化妊娠率 (%) 百分率 (%) 移植 1 个胚胎移植 2 个胚胎移植 3 个胚胎临床妊娠率胚胎植入率多胎妊娠率生化妊娠率图 3 不同移植胚胎数量患者的妊娠结果 Figure 3 Pregnancy of patients receiving different embryos transfer 多胎妊娠的发生是影响胚胎移植结局的重要因素, 减少胚胎移植数量会降低多胎妊娠的发生率, 而不降低临床妊娠率, 移植 2 个胚胎的临床妊娠率较高, 但与移植 3 个胚胎相比, 移植 2 个胚胎多胎妊娠的发生率较高, 但移植 3 个胚胎生化妊娠的发生率较高, 因此移植 1 个胚胎即单胚胎移植没显著降低临床妊娠率, 还可以避免多胎妊娠的发生, 达到提高临床妊娠率和胚胎植入率的目的 3 讨论 Discussion 3.1 胚胎体外培养胚胎体外培养成功的关键在于胚胎接触微环境的控制, 即人工环境的控制, 培养环境试剂以及耗材等卵母细胞采集体外受精胚胎移植过程中首先要进行卵母细胞采集, 最常用的方法是卵巢超促排卵, 以提高取卵成功率, 以获得多个成熟高质量的卵母细胞超促排卵常用药物包括克罗米酚, 促性腺激素 (GnRH) 人绒毛膜促性腺激素 (hcg) 注射促性腺激素后可使其排出比自然情况下多几倍到十几倍的卵子, 之后从卵巢取卵子, 直接与获能的精子在体外受精, 由于个体对这些药物的反应不同, 因为卵巢刺激需要个性化处理取卵的方法常采用 B 超下用采卵针经阴道穿刺卵泡, 去除卵泡洲, 卵细胞在严格条件下置培养液中培养也有超声波引导法, 如借助超声波探头和屏幕的引导, 从活体卵巢采集卵母细胞精子的制备及获能精子获能是指精子获得穿透卵子透明带的能力的过程精子获能的方法有与血清白蛋白的溶液长时间孵育, 改变精子质膜的稳定性, 导致精子获能同时在培养液中加入一定浓度的卵泡液将有可能诱发精子获能胚胎培养方式取卵后三四小时, 将精子和卵子放在一起进行体外受精或进行单精子卵细胞浆内注射从培养箱中取出卵子预培养皿和已调整好精子密度的精子制备液, 按照 (3-5) 10 4 个精子 / 每个卵子的比例加入精子, 将受精培养皿放回体积分数 5.0%CO 2 37 培养箱中继续培养 4-9 h 体外培养的胚胎需在恒温的环境中生存, 适宜的温度为 35-37, 适宜 ph 值为 ,pH 值低于 6.8 或高于 7.6 都可能对细胞造成伤害, 要通过观察培养液的颜色及时更换新鲜培养液应用人工创造条件, 对获取的早期胚胎进行体外培养, 培养液的成分包括盐类, 如无机盐和有机盐, 营养物质包括氨基酸, 苷酸, 调节物质包括维生素和激素, 特有物质, 如动物血清常用的培养方式包括悬滴培养法 ( 盖玻片或凹载片 ), 微滴培养法 ( 培养皿 ), 旋转管培养法 ( 管状培养器皿 ) 灌注小室培养法( 两个盖玻片或金属圈 ) 培养瓶培养法和培养板培养法目前应用较多的是培养板培养法, 如四孔培养板和微滴培养板, 四孔培养板为群体培养, 即在每孔加入 500 µl 受精液和枚体外成熟的卵母细胞, 然后加入获能处理的精子 ( ) 10 9 L -1, 在培养箱中孵育 6-24 h 微滴法为单卵培养, 是在塑料培养皿中用受精液做成 µl 的微滴, 上覆蜡油, 然后每滴放入体外成熟的卵母细胞枚及获能处理的精子 ( ) 10 9 L -1, 在培养箱中孵育 6-24 h 有研究认为群体培养有助于胚胎的发育, 但也有研究认为多胚胎共同培养相互间作用会导致发育速度较单独培养缓慢经过 h 的培养, 选择 1-3 个质量好的胚胎在 B 超监测下放入子宫内, 剩余的质量好的胚胎将予以冷冻保存备用 3.2 胚胎低温保存技术胚胎低温保存是将胚胎保存在 -196 液氮 -216 液氮或 -79 干冰中做长期保存 2942 P.O. Box 10002, Shenyang

5 储存在液氮中的细胞代谢活动停止, 理论上可以做到无限期保存, 是细胞冻存的理想方法, 可使胚胎移植不受时间地点的限制, 从而达到提高胚胎移植效率胚胎低温保存研究的历程见表 4 表 4 胚胎低温保存研究历程 Table 4 Research on the cryopreservation of the embryos 时间 ( 年 ) 作者事件 1972 [12] Whittingham,et al. 首次用慢速冷冻法成功保存小鼠胚胎 1973 [13] Wilmut,et al. 成功冷冻保存牛卵母细胞 1976 [14] Willadsen,et al. 成功冷冻保存绵羊卵母细胞 1976 [15] Whittingham,et al. 成功冷冻保存兔卵母细胞 1976 [16] Bilton,et al. 成功冷冻保存山羊卵母细胞常用的冷冻方法有慢速冷冻法超快速冷冻法 ( 即玻璃化法 ) 慢速冷冻法也称程序冷冻法, 但是此方法需要昂贵的仪器耗时, 并且对于囊胚冷冻效果差玻璃化法冷冻法因简单效率高不需要昂贵仪器等优点应用较广泛是近年来发展起来的一种新方法玻璃化保存现在已经被广泛的应用, 它的主要目的是最大限度的减少冰晶对细胞的损伤当胚胎细胞被玻璃化冷冻保存的时候, 通过用冷冻保护剂来防止冰晶的产生在低温保存胚胎过程中 -5,-15 是一个致死温度区, 在这个温度区的细胞容易形成大的冰晶, 目前认为冷冻过程中为了避免冰晶形成起关键性作用的是冷冻保护剂的种类及浓度以及载体的选择冷冻保护剂为了避免冰晶形成损伤细胞, 向细胞培养液中加入甘油 (GL) 乙二醇(ethylene glycol,eg) 丙二醇 (PROH) 二甲基亚砜(dimethylsulphoxide,DMSO) 等冷冻保护剂后, 由于他们对细胞无明显毒性, 相对分子质量小, 溶解度大, 易穿透细胞, 可使冰点降低, 提高细胞膜对水的通航性在冻结条件下, 能使细胞内水分在冻结前秀出细胞外, 在细胞外形成冰晶, 减少细胞内损伤甘油乙二醇丙三醇丙二醇二甲基亚砜甲醇丁二醇 (butadiene, BD) 等属于渗透性冷冻保护剂, 其中常用的为是乙二醇和二甲基亚砜, 普遍认为 EFS 溶液 ( 乙二醇 +F 聚蔗糖 ) 为最好的玻璃化冷冻保护剂此类保护剂属于细胞内冷冻保护剂, 为小分子物质, 易与溶液中的水分子结合, 在 0 以上易于穿透细胞, 在进行胚胎冷冻时, 保护剂使水分子从细胞内渗透出, 减少了细胞内冰晶形成带来的细胞损伤糖类为非渗透性冷冻保护剂, 糖类如葡萄糖果糖山梨露醇蔗糖海藻糖和棉子糖, 目前应用较多的为蔗糖研究发现单纯的甘油和乙二醇作为冷冻保护剂, 其保护细胞的能力明显低于单纯的二甲基亚砜, 相比较下, 单纯用二甲基亚砜作为冷冻保护剂的细胞存活率可达到 55%-60% 而混合冷冻保护剂的冷冻效果较单纯的应用甘油和乙二醇效果好而不同的冷冻保护剂其适合的血清浓度各不相同最早使用的玻璃化液组成是,205 g/l DMSO,155 g/l 乙酰胺 100 g/l 丙二醇和 60 g/l 乙二醇, 处理 5-10 min, 装管之后立即投入液氮 [17-19],20% 甘油 +250 g/l 丙二醇 [20-22] ; 体积分数 40% 乙醇 +30% 水溶性聚蔗糖 +0.5 mol 蔗糖 ( 均使小鼠胚胎冷冻成功 ) [20] 本院常用到的试剂包括 Quinn s M-HTF (Sage 1023), Quinn s HSA 100 g/l(sage 3001), DMSO (Sigma D2650),EG (Sigma E9129),Sucrose (Sigma S1888), Ficoll (M W ) (Sigma F1418) 基础液的配制包括 A 液 :9.5 ml MHTF+0.5 ml HAS,B 液 :9.5 ml MHTF+3.4 g Sucrose+0.5 ml HAS,C 液 :9.5 ml MHTF+3.4 g Sucrose +0.5 ml HSA+0.1 g Ficoll 冷冻保护液的配制为孔 1:A 液, 孔 2:75 g/l DMSO+ 7.5%EG+ A 液, 孔 3:150 g/l DMSO+15%EG+0.7 mol/l Sucrose+1%Ficoll+ A 液解冻液的配制为孔 1:0.8 ml A 液 +0.4 ml B 液, 孔 2:0.8 ml A 液 +0.2 ml B 液, 孔 3:1 ml A 液载体的选择玻璃化冷冻常用的载体包括麦管 (Straw) 闭合式拉长塑料细管法(closed pulled straw, CPS) 开放拉长的塑料吸管法(open pulled straw,ops) 开放式玻璃微细管法 (glassmicropipette,gmp) 电子显微镜铜网法 (electron microscopic grids,emg) 冷冻环法 (Cryo loop) 以及微滴法 (droplets) 等 1998 年,Vajta 等首次采用开放拉长的塑料吸管法进行进行细胞胚胎的玻璃化冷冻 OPS 管来自冻精细管, 将冻精细管拉制为原内径一半, 利用毛细将胚胎和微量玻璃化吸入管后, 直接投入液氮保存, 与传统细管玻璃冷冻法相比,OPS 在冷冻和解冻过程中的速度高十倍速, 使细胞快速通过危险温区, 减少冷冻损伤, 操作简便, 减少保护剂毒性, 提高降温速率开放式玻璃微细管法效果与开放拉长的塑料吸管法无明显差别, 但毛细玻管可自行拉制, 内径范畴远比 OPS 管宽, 降低细胞胚胎的毒性玻璃化冷冻法研究历程见表 5 表 5 玻璃化冷冻法研究历程 Table 5 Research on the vitrification method 时间 ( 年 ) 作者事件 1977 [23] Willadsen,et al 建立了快速冷冻法 1985 [17] Rall,et al 建立了玻璃化冷冻法 1989 [24] Nakagata,et al 采用二甲基亚砜乙酰胺为主要冻保护剂制成玻璃化液 1990 [20] Kasai,et al 利用化学毒性较低的乙二醇 (EG) 为主体冷冻保护剂 1992 [25] Fuku,et al 以丙二醇为主要冷冻剂 1993 [26] Otoil,et al 利用 1.6 mol/l 的丙二醇丙三醇和二甲基亚砜冷冻牛卵母细胞 [27] Vajta,et al 首次采用开放拉长的塑料吸管法 (OPS) 法冷冻牛卵母细胞 2002 [28] Abe,et al 结合微滴法和超低温液氮的方法, 取得了 20% 小结 : 胚胎在超低温冷冻前, 必须进行冷冻保护剂 (cryoprolectant) 处理, 在逐步降温的情况下, 于 -196 保 ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 2943

6 存, 一般来说, 在 -80 以上时, 细胞则逐渐失去活力, 到 -130 以下, 细胞内的水分是微细冰晶样或玻璃样结构, 细胞内所有需要能量的反应停止, 细胞的活动也几乎停止玻璃化技术可明显减少细胞内冰晶的形成, 最大限度的降低细胞损伤, 但该技术尚不完善, 卵细胞与卵巢组织的冷冻仍未达到令人满意的效果, 很多问题还有待进一步的深入研究作者贡献 : 试验设计为王芳作者, 实施为王芳及陈绍威作者, 评估为王芳作者, 王芳作者撰写本文, 审校并对文章负责利益冲突 : 文章及内容不涉及相关利益冲突伦理要求 : 所有患者及家属均签署知情同意书泸州医学院附属医院于 2010 年经四川省卫生厅现场评审授予开展人工受精资质,2012 年经卫生部批准开展试管婴儿技术学术术语 : 体外受精 - 胚胎移植 (IVF-ET) 技术 - 又称试管婴儿, 是指从活体卵巢内取出成熟卵子, 在体外放入模拟人体内的试管或培养皿内, 和精子经体外受精, 使卵子与精子进行结合, 待受精卵发育成胚胎后, 再移植到女性子宫内着床, 发育成胎儿, 分娩作者声明 : 文章为原创作品, 无抄袭剽窃, 无泄密及署名和专利争议, 内容及数据真实, 文责自负 4 参考文献 References [1] 丘映, 谭秀群. 卵胞浆内单精子显微注射 - 胚胎移植的研究进展 [J]. 广西医学,2002,24(3): [2] Tomás C, Orava M, Tuomivaara L, et al.low pregnancy rate is achieved in patients treated with intracytoplasmic sperm injection due to previous low or failed fertilization in in-vitro fertilization.hum Reprod. 1998;13(1): [3] Merchant R, Gandhi G, Allahbadia GN.In vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection for male infertility. Indian J Urol. 2011;27(1): [4] Basille C, Frydman R, El Aly A,et al.preimplantation genetic diagnosis: state of the art.eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2009;145(1):9-13. [5] 唐莉, 彭林. 人体外受精 - 胚胎移植中体外培养改良的研究进展 [J]. 国外医学 : 计划生育分册,2001,20(4): [6] Gardner DK.Changes in requirements and utilization of nutrients during mammalian preimplantation embryo development and their significance in embryo culture. Theriogenology. 1998;49(1): [7] Gruber I, Klein M.Embryo culture media for human IVF: which possibilities exist?j Turk Ger Gynecol Assoc. 2011;12(2): [8] 张梦苑, 陈柯屹, 腊晓琳, 等. 新鲜胚胎与冷冻胚胎移植在体外受精周期中疗效比较的 Meta 分析 [J]. 中国组织工程研究,2013,17(53): [9] Labarta E,Martinez-Conejero JA, Alama P,et al.endometrial receptivity is affected in women with high circulating progesterone levels at the end of the follicular phase:a functional genomics analysis.hum Reprod.2011;26(7): [10] Aflatoonian A,Oskouian H,Ahmadi S,et al.can fresh embryo transfers be replaced by cryopreserved-thawed embryo transfers in assisted reproductive cycles?a randomized controlled trial.j Assist Reprod Genet,2010;27(7): [11] Shapiro BS,Daneshmand ST,Garner FC,et al.evidence of impaired endometrial receptivity after ovarian stimulation for in vitro fertilization:a prospective randomized trial comparing fresh and frozen-thawed embryo transfer in normal responders. Fertil Steril,2011;96(2): [12] Whittingham DG, Leibo SP, Mazur P.Survival of mouse embryos frozen to -196 degrees and -269 degrees C.Science. 1972;178(4059): [13] Wilmut I, Rowson LE.The successful low-temperature preservation of mouse and cow embryos.j Reprod Fertil. 1973;33(2): [14] Willadsen SM, Polge C, Rowson LE,et al.deep freezing of sheep embryos.j Reprod Fertil. 1976;46(1): [15] Whittingham DG, Adams CE.Low temperature preservation of rabbit embryos.j Reprod Fertil. 1976;47(2): [16] Bilton RJ, Moore NW.In vitro culture, storage and transfer of goat embryos.aust J Biol Sci. 1976;29(1-2): [17] Rall WF, Fahy GM.Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196 degrees C by vitrification.nature. 1985;313 (6003): [18] Liebermann J, Nawroth F, Isachenko V, et al.potential importance of vitrification in reproductive medicine.biol Reprod. 2002;67(6): [19] Woods SE, Qi P, Rosalia E, Chavarria T,et al.laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups.plos One. 2014;9(3): e [20] Kasai M, Komi JH, Takakamo A,et al.a simple method for mouse embryo cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.j Reprod Fertil. 1990;89(1): [21] Dasiman R, Rahman NS, Othman S, et al.cytoskeletal alterations in different developmental stages of in vivo cryopreserved preimplantation murine embryos.med Sci Monit Basic Res. 2013;19: [22] Kasai M, Mukaida T. Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.reprod Biomed Online. 2004;9(2): [23] Willadsen SM.Factors affecting the survival of sheep embryos during-freezing and thawing.ciba Found Symp. 1977;(52): [24] Nakagata N.High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification.j Reprod Fertil. 1989;87(2): [25] Fuku E, Fiser PS, Marcus GJ, et al.the effect of supercooling on the developmental capacity of mouse embryos. Cryobiology. 1992;29(3): [26] Otoi T, Tachikawa S, Kondo S,et al.developmental capacity of bovine oocytes frozen in different cryoprotectants. Theriogenology. 1993;40(4): [27] Vajta G, Holm P, Kuwayama M,et al.open Pulled Straw (OPS) vitrification: a new way to reduce cryoinjuries of bovine ova and embryos.mol Reprod Dev. 1998;51(1): [28] Abe H, Yamashita S, Satoh T,et al.accumulation of cytoplasmic lipid droplets in bovine embryos and cryotolerance of embryos developed in different culture systems using serum-free or serum-containing media.mol Reprod Dev. 2002;61(1): P.O. Box 10002, Shenyang

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NONE 中国农业大学学报 1999, 4(3): 109~113 Journal of China Agricultural University 小鼠桑棍胚玻璃化冷冻前后生物频谱处理对体外发青的影晌 1 朱士恩 2 王海彦曾申明王永胜张忠诚 ( 中国农业大学动物科技学院 ) 周林陈银 (