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彼禹
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1 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY 研究报告 BULLETIN 1年第9期毕赤酵母表达重组葡萄糖氧化酶的发酵条件王帅坤郝杰清王振伟师慧孟延发四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室成都 1 摘要对甲醇诱导重组 Pichia pastoris GS11 mut+ 高效表达黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的条件进行了研究拟建立一条高效低成本的生产重组葡萄糖氧化酶的工艺路线通过摇瓶试验对发酵培养基诱导时机 ph 诱导温度甲醇诱导浓度等进行了优化随后进行了 L 发酵罐扩大化培养结果表明最适发酵培养基为 YEPD 培养基甲醇诱导产酶的最佳时机为菌体对数生长末期最佳诱导浓度为 1% 最适诱导 ph 范围为 -. 最适诱导温度按优化的条件用 L 发酵罐分批培养酵母 1 h 甲醇诱导培养 h 后生物量和酶活性达到最高菌体终密度达到 OD 为每升发酵液中产酶 1 ku 发酵液上清蛋白含量为 1 mg/l 关键词葡萄糖氧化酶毕赤酵母诱导表达高密度发酵 Studies on Fermentation Conditions for r-god Production by Pichia pastoris GS11 Wang Shuaikun Hao Jieqing Wang Zhenwei Shi Hui Meng Yanfa Key Laboratory of Bio-Resources and Eco-Environment Ministry of Education College of Life Science Sichuan University Chengdu 1 Abstract: Using methanol to induce the expression of Aspergillus niger glucose oxidase gene cloned in Pichia pastoris GS11 mut+ was deeply investigated for establishing a high-performance but low-cost method of recombinant glucose oxidase production. The medium, the ph, the time point of induction, the temperature and the methanol concentration for induction were optimized and studied in detail by shake flask experiment. The results of optimization were verified by enlarged fermentation in L fermentor. Results suggested that the best medium culturing the Pichia pastoris were YEPD medium, the optimum time for induction was the mid-anaphase of logarithmic phase, the optimum inducing concentration of methanol was 1%, and the optimum ph and temperature conditions were ph-. and. According to the optimum conditions, the highest biomass and glucose oxidase expression level were obtained in L fermentor with batch culture for 1 h and induced by 1% methanol for h. The final cell density OD was, 1 ku enzyme activity and 1 mg protein were obtained in 1 L fermentation broth. Key words: Glucose oxidase Pichia pastoris Inducible expression 葡萄糖氧化酶 glucose oxidase 简称 GOD EC 是一种需氧脱氢酶于有氧条件下能高 High density fermentation 基因工程技术是解决工业化产酶的有效方法之一不但能大大降低生产成本而且容易获得高产量度专一地将 β-d-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢世纪 7 年代建立的以巴斯德毕赤酵母作为重组其在食品工业医疗诊断生物传感器等方面都有蛋白生产菌的高密度发酵方法已经成熟毕赤酵母着广泛的应用年被我国农业部批准为是一类真核表达系统它具有真核表达系统所共有种允许使用的饲料添加剂之一目前葡萄糖氧的优点表达产物分泌至胞外杂蛋白少易于纯化化酶的工业化生产一般采用青霉属菌株和黑曲霉两从而有利于降低成本国内外已有将葡萄糖氧化酶种但是野生菌产酶水平低后续纯化困难等问题会提高工业化生产成本在一定程度限制其应用基因克隆到毕赤酵母并成功表达的报道 -7 但有关优化发酵生产条件的报道较少主要集中于摇瓶收稿日期 1--7 基金项目十一五国家科技支撑计划重点项目 BAIB7 作者简介王帅坤男硕士研究生研究方向酶工程 wangshkn@.com 通讯作者孟延发男教授研究方向蛋白质工程与酶工程 yfmeng9@scu.edu.com

2 1 年第 9 期王帅坤等 : 毕赤酵母表达重组葡萄糖氧化酶的发酵条件 17 培养规模因此开展重组葡萄糖氧化酶大规模生产研究就显得很有必要本研究主要以表达葡萄糖氧化酶基因毕赤酵母工程菌为出发菌, 通过系统地优化发酵培养条件, 旨在提高重组葡萄糖氧化酶的表达量 1 材料与方法 1.1 材料菌种与培养基表达黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的重组 Pichia pastoris GS11 mut + 按参考文献构建 [7], 由本室保存种子培养基 (L -1 ): 酵母膏 1 g, 蛋白胨 g, 葡萄糖 g ; 发酵培养基配方和作用如下 :YEPD(L -1 ): 酵母膏 1 g, 蛋白胨 g, 葡萄糖 g, 溶于 1 L ph.,.1 mol/l K HPO - KH PO 缓冲液, 用于毕赤酵母的初始培养与诱导产酶 ;BMGY(L -1 ): 酵母膏 1 g, 蛋白胨 g, 甘油 1 ml, 酵母基本氮源培养基 (YNB)1. g, 生物素. g, 溶于 1 L ph.,.1 mol/l K HPO - KH PO 缓冲液, 用于发酵初始培养 ;BMMY(L -1 ): 酵母膏 1 g, 蛋白胨 g, 甲醇 ml,ynb 1. g, 生物素. g, 溶于 1 L ph.,.1 mol/l K HPO - KH PO 缓冲液, 用于诱导产酶 ;MD(L -1 ): 葡萄糖 g,ynb 1. g, 硫酸铵 g, 生物素. g, 用于发酵初始培养 ;MM(L -1 ): 甲醇 ml,ynb 1. g, 硫酸铵 g, 生物素. g, 用于诱导产酶诱导用甲醇含 ml/l PTM1 PTM1 配方按 Invitrogen 公司毕赤酵母表达手册配置 1.1. 试剂蛋白胨 (Peptone, 北京奥博星 ), 酵母膏 (Yeast Extract, 湖北安琪 ), 酵母基本氮源培养基 (YNB,DIFCO 公司 ), 丙烯酰胺 (Acr) 及甲叉双丙烯酰胺 (Bis) 购自 Fluka 公司, 过氧化物酶 (POD) - 氨基安替比林 (-AA) N- 乙基 -N-(- 羟基 -- 磺丙基 )-- 甲基苯胺钠盐 (TOOS) 和十二烷基硫酸钠 (SDS) 购自 Sigma 公司其余试剂均为国产分析纯 1.1. 仪器 Dansence K 型发酵罐 ( 鼎兴生物工程设备有限公司 );HZQ-C 型空气浴振荡器 ( 哈尔滨市东明医疗仪器厂 ); 高速冷冻离心机 (Eppendorf R); 电泳仪 (Bio-Rad 公司 Power PAC); 凝胶成像分析仪 (Bio-Rad 公司 Power PAC); 紫外可见分光光度计 (Unico TM UV-);71 分光光度计 ( 上海第三分析仪器厂 ) 1. 方法 1..1 重组葡萄糖氧化酶基因工程菌的摇瓶培养摇瓶生长曲线的绘制挑取斜面保存菌种于试管种子培养基, r/min 培养 h 以 % 的接种量接种于三角瓶种子培养基, 同样条件培养每隔 h 取样, 用培养基作空白对照, 测其在 nm 处的吸光值以培养时间和 OD 值为横纵坐标, 绘制生长曲线发酵培养基的筛选以 % 的接种量将种子液接入发酵培养基 :YEPD BMGY 和 MD, r/min 培养 h 后, 补加甲醇到 YEPD 培养基至浓度.% ; 对 BMGY MD 发酵液离心, 弃上清, 并分别用 BMMY MM 培养基悬浮菌体然后于诱导培养, 每 h 补加一次甲醇, 诱导培养 7 h 后, 检测生物量和葡萄糖氧化酶表达量, 确定最佳发酵培养基最佳诱导时机的确定 r/min 分别培养毕赤酵母 1 和 h 后, 补加甲醇至浓度.%, 温度降到, 进行诱导培养每隔 h 补加一次甲醇, 诱导培养 7 h 后根据生物量和目的蛋白表达量确定最佳诱导时机培养基 ph 对诱导产酶的影响用不同 ph (.. 7 和 ).1 mol/l K HPO -KH PO 缓冲液配置发酵培养基, 培养毕赤酵母 h 后, 补加甲醇至浓度.%, 于进行诱导培养每隔 h 补加一次甲醇, 诱导培养 h 分析目的蛋白表达量, 确定最适诱导 ph 诱导温度对目的蛋白表达的影响培养毕赤酵母 h 后, 补加甲醇至浓度.%, 分别于条件下诱导葡萄糖氧化酶的表达每隔 h 补加一次甲醇, 诱导培养 h 后确定最佳诱导温度甲醇最佳诱导浓度的确定培养毕赤酵母 h 后, 分别用.% 1% 1.% % 和 % 的甲醇于诱导培养每隔 h 补加甲醇, 并取样分析酶活性生物量诱导培养 1 h, 确定最佳甲醇诱导浓度

3 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 1.. 重组葡萄糖氧化酶基因工程菌的发酵罐培养分批诱导培养 1年第9期对数生长期 h 进入对数末期约 h 后进入稳 L 发酵罐装入 L 发酵定期用不同发酵培养基培养毕赤酵母诱导产酶培养基 11 灭菌 min 以 % 的接种量接入种结果如表 1 所示在相同条件下用 BMGY/BMMY 子液 r/min 培养溶氧维持在 % 流 YEPD 培养基培养工程菌均获得了高产酶量约是加 % 的氨水和 % 磷酸控制 ph 在.-. 定时 MM/MD 培养基的两倍但 YEPD 培养基成分简单取样测 OD 和葡萄糖含量当葡萄糖消耗完时价格低廉适宜于大规模发酵罐培养使用因此选饥饿. h 将发酵罐温度降到开始诱导培养择 YEPD 为最适发酵培养基在菌体生长不同阶段甲醇最初浓度.% 使酵母细胞适应甲醇待检测诱导产酶由图可知初始培养毕赤酵母 h 后甲醇消耗完时流加甲醇至浓度 1% 每隔 1- h 取 OD 为 1 用甲醇诱导培养获得最高生物量和样检测甲醇含量探索甲醇消耗规律以便及时补加产酶量菌体初始培养低于或者超过 h 生物量每隔 h 取样分析生物量和目的蛋白表达量当葡和酶活力均有所减少萄糖氧化酶表达量持续 h 停止增长或下降时发 1 酵结束 1... 分批补料诱导培养分批培养阶段按上述过程进行当葡萄糖消耗为时补加葡萄糖至 % 萄糖含量当消耗完时及时补加持续补料培养 -7 Anm 进行补料培养补料培养阶段每隔 1 h 取样检测葡 h 之后进入甲醇诱导培养阶段诱导培养过程同上 1.. 生物量目的蛋白表达量葡萄糖含量和甲醇浓度分析生物量的测定采用光电比浊计数法用分光光度计测发酵液 OD 表示菌体浓度该重组葡萄糖氧化酶为胞外酶其表达量分析方法如下取发酵液离心检测上清酶活性蛋白含量并进行 1% SDS-PAGE 样品处理方法发酵液上清不稀释直接用 SDS-PAGE loading buffer 处理图1 表1 比活力 U/mg 文献 YEPD BMGY/BMMY MD/MM 定采用 Bradford 法以 BSA 作为标准蛋白酶活力测定参照 Toyobo 方法 1 并有所改进取适当稀释酶液 μl 加入 1. ml 79 mmol/l ph. MES-Na 11 mmol/l 葡萄糖. mmol/l -AA. mmol/l TOOS 和 U/mL POD 的反应液中反应 min 加入 1 ml % SDS 终止反应测定 nm 吸光值在上述条件下每分钟催化生成 1 μmol/l HO 所需的酶量定义为一个酶活力单位.1 结果酶活力 U/mL OD 9 蛋白含量 mg/ml 培养基蛋白含量测重组 Pichia pastors GS11 mut+ 摇瓶生长曲线法甲醇浓度分析采用品红-亚硫酸比色法参考蛋白含量和酶活力测定方法 Time h 不同培养基培养毕赤酵母所得生物量和葡萄糖氧化酶活性葡萄糖含量分析采用 DNS 法 -二硝基水杨酸 1.. 由图可知在 ph- 培养毕赤酵母诱导产酶表达量随着 ph 的增大而提高但酶活性测定结果显示在 ph.-. 时酶活性最高因此选择最适诱导 ph 为 -. 在不同温度条件下诱导产酶由图可知条件下诱导培养葡萄糖氧化酶表达量最高高于或者低于时表达量均有所下降不同浓度甲醇诱导产酶试验结果图和图摇瓶培养优化结果显示甲醇浓度为 1% 时诱导产酶效果最好在相如图 1 所示毕赤酵母在摇瓶培养 h 后进入同的诱导时间内葡萄糖氧化酶表达量约是.% 甲

4 醇诱导的两倍甲醇浓度高于 1% 时葡萄糖氧化 A nm A nm U/mL OD OD/ U/mL 酶表达量随甲醇浓度的增大而出现不同程度的下降 19 王帅坤等毕赤酵母表达重组葡萄糖氧化酶的发酵条件 1年第9期图 1 1 U/mL A 7 Temperature 温度对葡萄糖氧化酶表达量的影响.% methanol 1% methanol 1.% methanol % methanol % methanol % methanol Induction time h 图不同生长点诱导培养 7 h 葡萄糖氧化酶的表达量和菌体生物量 1 图 Protein cont mg/ml. Protein cont 不同浓度甲醇诱导葡萄糖氧化酶表达动力学 1 Time d U/mL B 分别代表.% 1% 1.% % % 和 % 的甲醇诱导 ph 7 A 1- 分别代表在 ph.. 7 和条件下诱导产酶每道点样 μl 图不同 ph 条件下诱导培养 h 葡萄糖氧化酶的表达量和酶活性产酶每道点样 μl 图不同浓度甲醇诱导 1 h 葡萄糖氧化酶的表达量养在毕赤酵母适应甲醇之后约 h 消耗 1% 的甲醇因此约每 h 补加 1% 的甲醇生物量和葡萄糖氧化酶表达量随诱导时长的增加而增加诱导培养. 发酵罐培养结果 h 后葡萄糖氧化酶表达量达到最高菌体终密度采用分批诱导培养的方法诱导葡萄糖氧化酶的达到 OD 为每升发酵液中产酶 1 ku 发酵表达结果图 7 和图显示发酵罐培养 1 h 时液上清蛋白含量为 1 mg/l 采用分批补料诱导检测葡萄糖消耗为 OD 为 17 开始甲醇诱导培培养的方法补料培养 7 h 后诱导培养诱导前获

5 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 1 1年第9期得了较大的生物量 OD 在以上但诱导产酶 1 和 h 分别对应于菌体生长延滞期对数速率降低诱导培养 h 后生物量和酶活性趋于稳生长初期对数生长中期对数生长末期和稳定期定 OD 为 1 发酵液上清酶活性仅 U/mL 远稳定期之前产酶量随着初始培养时间的增长而增低于分批诱导培养的表达水平怀疑缺乏氮源故加在对数生长末期菌体生物量大且细胞活力强配置了酵母膏蛋白胨浓缩液灭菌后补加进发酵罐诱导产酶效果最好菌体进入稳定期后发酵液中继续培养 h 目的蛋白表达量未见增长甲醇也营养消耗代谢产物积累菌体活力受到抑制在未被利用调节补料培养时长为 h 然后诱导培养此条件下诱导产酶量降低毕赤酵母生长 ph 范 9 h 后获得了最高产酶量发酵液上清酶活性为围较广在 ph- 均能生长而诱导阶段最适 ph U/mL 但仍不及分批诱导培养效果因表达的外源蛋白的稳定性而异在 ph- 诱导表达葡萄糖氧化酶表达量随着 ph 的增大而增高 A nm OD A nm 但酶活性在 ph.-. 时最高这可能与葡萄糖氧 1 OD/ U/mL 1 图7 Time h 7 OD 变化曲线代表葡萄糖的消耗 L 发酵罐培养毕赤酵母结果 1 7 化酶的酸碱稳定性有关当 ph>. 时葡萄糖氧化酶结构可能受到了一定的损害导致酶活性的损失据 Jahic 等报道毕赤酵母诱导产酶阶段一定范围内降低培养温度可提高 AOX 的活力增强甲醇利用速率本研究不同温度诱导产酶的试验结果与之相符在条件下诱导培养获得了最高产酶量诱导阶段甲醇浓度影响外源蛋白的表达速率和酵母细胞的活力浓度过低限制酵母的生长与产酶浓度过高则对细胞产生毒害作用抑制细胞产酶甲醇浓度为 1% 时葡萄糖氧化酶表达量最高浓度高于 1% 时酵母细胞受到不同程度的毒害产酶量随甲醇浓度的增大而下降溶氧是酵母生长所需的重要营养成分之一可直接影响酵母的生长和代谢本试验根据 Jahic 1 在发酵罐培养过程中选择了控制溶氧在 % 的培养条件酵母生长正常接种量也是影响发酵的因素之一在前期已通过摇瓶培养研究了接种量对毕赤酵母诱导产酶 1-7 分别代表甲醇诱导培养 9 h h 7 h h h 的影响在本研究中没有讨论而是直接选用了 % h 和 h 每道点样 μl 接种量图甲醇诱导不同时间的 SDS-PAGE 分析讨论有效控制生产成本是实现大规模生产葡萄糖氧化酶的重要因素朱华等 11 曾通过摇瓶试验筛选了产葡萄糖氧化酶工程菌的培养基用豆粕粉代替酵母膏蛋白胨作为氮源降低了发酵成本而本研究采用的 YEPD 培养基所用成分均为国产生产成本也较低且进行了 L 发酵培养在较短的培养周期内获得了高产酶量初始培养毕赤酵母采用分批诱导培养方法进行 L 发酵罐扩大化培养获得了较好效果在相同诱导培养时间内是摇瓶发酵水平的倍采用分批补料式培养方法在诱导表达之前虽然获得了高密度菌体但诱导阶段甲醇利用率低产酶效果差可能是补料培养导致菌体浓度增长迅速消耗了大量营养物质同时产生过多代谢废物抑制了酵母对甲醇的利用结论采用重组 Pichia pastors GS11 mut+ 发酵生产重

6 1 年第 9 期王帅坤等 : 毕赤酵母表达重组葡萄糖氧化酶的发酵条件 11 组葡萄糖氧化酶, 通过摇瓶培养, 最适发酵培养基为 YEPD 培养基, 最适诱导 ph 范围为 -., 最适诱导温度, 甲醇诱导最佳时机为菌体对数生长末期, 最佳诱导浓度为 1% 采用分批式培养方法和分批补料式培养方法进行了 L 发酵罐扩大化培养采用分批式培养方法, 初始培养 1 h, 诱导培养 h, 获得最高产酶量, 为 1 ku/l 在相同诱导培养时间内是摇瓶发酵水平的倍而采用分批补料式培养方法, 在诱导表达之前虽然获得了高密度菌体, 但产酶量不及分批式诱导培养结果参考文献 [1] Bankar SB, Bule MV, Singhal RS, et al. Glucose oxidase An overview[j]. Biotechnology Advances, 9, 7():9-1. [] Wong C, Wong K, Chen X. Glucose oxidase :natural occurrence, function, properties and industrial applications[j]. Appl Microbiol Biotechnol,, 7():97-9. [] Courjean O, Mano N. Recombinant glucose oxidase from Penicillium amagasakiense for efficient bioelectrochemical applications in physiological conditions[j]. Journal of Biotechnology, 11, 11 (1):-9. [] 刑良英, 王远山, 郑裕国. 葡萄糖氧化酶的生产及应用 [J]. 食品科技, 7():-. [] Guo Y, Lu F, Zhao H, et al. Cloning and heterologous expression of glucose oxidase gene from Aspergillus niger Z- in Pichia pastoris[j]. Appl Biochem Biotechnol, 1, 1 :9-9 [] Crognale S, Pulci V, Brozzoli V, et al. Expression of Penicillium variabile P1 glucose oxidase gene in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme[j]. Enzyme and Microbial Technology,, 9():-. [7] 周亚凤, 张先恩, 刘虹. 黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其在酵母中的高效表达 [J]. 生物工程学报, 1, 17():-. [] 周薇, 羊语梅. 品红 - 亚硫酸比色法测定酒中甲醇的方法改进 [J]. 中国卫生检验杂志,, 1(1):7. [9] 汪家政, 范明. 蛋白质技术手册 [M]. 北京 : 科学出版社,. [1] Toyobo Co. Lid. Toyobo enzymes[m]. Japan :Biochemical Operations Department, 199. [11] 朱华, 于宏伟, 郭润芳. 产葡萄糖氧化酶工程菌培养基筛选及发酵条件优化 [J]. 河北农业大学学报,, ():7-1. [] Jahic M, Wallberg F, Bollok M, et al. Temperature limited fed-batch technique for control of proteolysis in Pichia pastoris bioreactor cultures[j]. Microbial Cell Factories, ():1-11. [1] Jahic M. Process techniques for production of recombinant proteins with Pichia pastoris[d]. Sweden :of Biotechnology, Royal Institute of Technology, :91. ( 责任编辑马鑫 )

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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