016,3(3) 王晓云等 : 毕赤酵母表达重组牛胰脏羧肽酶 A 的响应面法优化 191 食品和饲料中赭曲霉素的去除 [] [3] 用作脱苦味剂等动物来源的羧肽酶主要存在于猪牛等的胰

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苍没闵
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1 研究报告生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 016, 3(3): 毕赤酵母表达重组牛胰脏羧肽酶 A 的响应面法优化王晓云徐诗涵梁志宏黄昆仑 ( 中国农业大学食品科学与营养工程学院, 北京 ) 摘要 : 采用 Central Composite Design(CCD) 实验设计及响应面分析相结合的方法, 对毕赤酵母表达牛胰脏羧肽酶 A 的表达条件进行优化, 旨在获得牛胰脏羧肽酶 A 的最佳表达条件单因素实验结果显示, 诱导时间为 96 h 时, 最佳甲醇含量为 0.5% 最佳 ph 值为 4 诱导时最佳菌体 OD 600 值为 7 在此基础上, 利用 CCD 实验设计及响应面分析法进行回归分析, 获得最优表达参数为 : 甲醇含量 0.5% 诱导 ph 为 5.90 接种前种子培养基 OD 600 为 6.54 在优化后的条件下进行验证实验, 得到牛胰脏羧肽酶 A 的表达量为 5 mg/ml, 与理论值 (6 mg/ml) 相比, 相对误差较小, 为 8% 同时, 对表达产物进行了 Western Blot 鉴定研究表明, 采用响应面法分析优化牛胰脏羧肽酶 A 的表达条件准确可靠, 有助于找出最佳条件, 为指导其在发酵罐中进行高密度发酵生产牛胰脏羧肽酶 A 奠定基础关键词 : 牛胰脏羧肽酶 A; 毕赤酵母 ; 响应面 DOI : /j.cnki.biotech.bull Optimization of Expression Conditions of Recombinant Bovine Pancreatic Carboxypeptidase A in Pichia pastoris by Response Surface Method WANG Xiao-yun XU Shi-han LIANG Zhi-hong HUANG Kun-lun (College of Food Science & Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing ) Abstract: Central composite design(ccd)and response surface methodology(rsm)were used to optimize the expression conditions of bovine pancreatic carboxypeptidase A. The results of single-factor test showed that the optimal conditions as following :the inducible expression time was 96 hours,the methanol content was 0.5% every 4 h,the initial induction ph4,and OD 600 before induction expression was 7. Based on the above result,ccd was used to design the tests,and RSM to have regression analysis. The optimal parameters for the expression were obtained as :methanol content was 0.5% every 4 hours,the induction ph 5.90,OD 600 before inducible expression was 6.54, the expression level after 96 h reached 5 mg/ml. Compared with the theoretical value(6 mg/ml),the small relative error was 8%. Also,the expression of the target protein was confirmed by Western blot. Conclusively,using RSM for optimizing the expression condition of bovine pancreatic carboxypeptidase A was accurate and reliable,and conducive to seek the optimal condition,thus this lays a foundation for guiding the high-density fermentation production of bovine pancreatic carboxypeptidase A in fermenter. Key words: bovine pancreatic carboxypeptidase A ;Pichia pastoris ;response surface method 羧肽酶 (carboxypeptidases,cps) 是一种专一性地从肽链的 C 端逐个降解释放游离氨基酸的一类肽链外切酶主要分为丝氨酸羧肽酶 (EC ) 金属羧肽酶 (EC ) 和半胱氨酸羧肽酶 (EC )3 个亚类羧肽酶广泛应用于医药食品等工业领域在食品工业, 可用于制备高 F 值寡肽 [1], 收稿日期 : 基金项目 : 国家高技术研究发展计划 ( 863 计划 )(01AA ) 作者简介 : 王晓云, 女, 硕士研究生, 研究方向 : 微生物脱毒与食品安全 ; @qq.com 通讯作者 : 梁志宏, 女, 博士, 副教授, 研究方向 : 微生物与食品安全 ; lzh01@cau.edu.cn

5% 最佳 ph 值为 4 诱导时最佳菌体 OD 600 值为 7 在此基础上, 利用 CCD 实验设计及响应面分析法进行回归分析, 获得最优表达参数为 : 甲醇含量 0.5% 诱导 ph 为 5.90 接种前种子培养基 OD 600 为 6.

2 016,3(3) 王晓云等 : 毕赤酵母表达重组牛胰脏羧肽酶 A 的响应面法优化 191 食品和饲料中赭曲霉素的去除 [] [3] 用作脱苦味剂等动物来源的羧肽酶主要存在于猪牛等的胰脏中, 如羧肽酶 A/B(carboxypeptidaseA/B), 其数量非常有限价格昂贵导致其应用受到限制微生物来源的羧肽酶存在于酵母曲霉等真菌的液泡中, 具有广阔的应用前景, 但后期纯化及大量获得仍然存在困难因此, 借助基因工程策略采用微生物为宿主大量生产重组羧肽酶, 有助于进一步降低生产成本提高产品质量深化酶学性质研究扩展应用范围 [4] 赵莹完成了猪羧肽酶 A1 酶原在毕赤酵母中的表 [5] 达, 易静等完成了人羧肽酶 A1 的毕赤酵母可溶表达, 为进一步研究 CPA1 在抗体导向酶 - 前体药物疗法中的应用奠定了基础赭曲霉毒素 A(Ochratoxin A,OTA) 是由曲霉属 (Aspergillus spp.) 和青霉属 (Penicillium spp.) 等霉菌产生的次级代谢产物, 属于聚酮类化合物, 主要存在于谷物及其副产品中 [6] OTA 具有强烈的肾脏毒性和肝脏毒性, 并有致畸致突变和致癌作用 [7], 对动物和人体健康有很大的潜在危害, 研究 OTA 的脱毒对人类健康生活至关重要 1969 年 Pitiou [8] 用薄层层析和光谱方法就发现羧肽酶 (CPA) 能将赭曲霉毒素 A 降解为 OTα 和 L- 苯丙氨酸 Deberghes [9] 在含有赭曲霉的液体培养基 (50 ml) 中分别加入 100 μl 的 1 5 U 的牛胰脏羧肽酶 A, 结果发现 1 U 羧肽酶 A 降解率为 17%, U 羧肽酶 A 降解率为 49%,5 U 羧肽酶 A 降解率达了 100% [10] 本实验所用菌由师磊等证明具有降解赭曲霉毒素 A 效果巴斯德毕赤酵母表达系统是应用广泛而成功的蛋白表达系统与其他真核蛋白及原核蛋白表达系统相比, 具有以下优点 [11] :(1) 生长速度快, 易实现高密度发酵 ;() 可生产分泌型蛋白, 方便收集及纯化 ;(3) 可避免内毒素及噬菌体污染 ;(4) 可进行蛋白的翻译后修饰, 包括多肽的折叠糖基化甲基化等 ;(5) 有良好的酵母表达载体, 如 ppic 9K ppiczα pmet B 等外源蛋白的表达条件如诱导时间 ph 碳源诱导剂浓度等对目标蛋白的产量及活性影响较大优化培养条件可有效提高外源蛋白含量响应面法 (Response surface methodology,rsm) 是以多元二次回归数学模型为工具, 描述相互作用的实验因子与响应值之间的关系的数据处理方法响应面法能有效地找到因素间的最优组合, 相比于传统的全因子实验设计, 该法能在更为经济的试验次数下, 得到精确的统计结果, 具有周期短精确度高等优点因此, 本研究利用单因素实验, 初步优化了培养基成分, 诱导 ph 值诱导前菌体 OD 600 值和甲醇含量在单因素实验的基础上, 利用响应面法优化实验对初始诱导 ph 值诱导前菌体 OD 600 值和甲醇含量三因素对牛胰脏羧肽酶 A 表达量的影响进行研究, 分析各因素的变化规律, 以期获得牛胰脏羧肽酶 A 表达的最佳条件 1 材料与方法 1.1 材料重组巴斯德毕赤酵母 Pichia pastoris(gsll5/ ppic9k/procpa,his +,Mut +, 本实验室构建保存 ( 牛胰脏 ProCPA 基因 (Accession No.NM_174750) 由北京奥科鼎盛有限公司依据 P.pastoris 对密码子的偏爱性进行密码子优化 );Werstern Blot 实验中的 His 标签小鼠单克隆抗体 AP 标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体均购自 Abcam ;BCIP/NBP 显色液购自 Amresco ; 培养基试剂购自北京奥博星生物技术有限责任公司 ; 其余试剂均为分析纯 1. 方法 1..1 菌株活化将毕赤酵母重组菌株在新鲜 YPD 平板上划线, 于 30 倒置培养 d 1.. 种子培养从 YPD 平板挑取单菌落接种到 50 mlypd 培养基中,30 和 00 r/min 振荡培养过夜, 然后接入 50 ml BMGY 培养基中继续培养至 OD 600 达牛 procpa 基因的表达 50 μl 种子培养液接种于 5 ml BMGY(13. 4 g /L YNB, g /L 生物素,100 ml /L 磷酸缓冲液,10 ml /L 甘油 ) 培养液中于 8,50 r /min 的速度振摇至菌浓度为所需的 OD 600 离心收集菌体弃去 BMGY 培养液, 用 5 ml 改良 BMMY(13. 4 g /L YNB, g /L 生物素,100 ml /L 磷酸缓冲液,1% 山梨醇, 所需的甲醇浓度 ) 培养液于 8,50 r /min 的速度振摇, 开始诱导表达, 每 1 h 或 4 h 补充甲醇于

生产成本提高产品质量深化酶学性质研究扩展应用范围 [4] 赵莹完成了猪羧肽酶 A1 酶原在毕赤酵母中的表 [5] 达, 易静等完成了人羧肽酶 A1 的毕赤酵母可溶表达, 为进一步研究 CPA1 在抗体导向酶 - 前体药物疗法中的应用奠定了

3 生物技术通报 Biotechnology Bulletin h 分别取 1 ml 上清液 1..4 发酵产物分析每天收集 1 ml 的发酵上清 016,Vol.3,No M kd 7 液测量 OD 值 r/min 离心 5 min 取出上清 -0 保存备检 1..5 表达上清检测对上清中的蛋白进行 SDS PAGE Western Blot 验证及纯化利用 Bradford 法结合标准曲线对表达上清中的蛋白含量进行分析 μl 考马斯亮蓝 G50 中加入 0 μl 的表达上清充分混匀室温反应 min 测定 595 nm 处的吸光值依据标准曲线计算蛋白浓度 M 蛋白质 marker 1 1.0% 甲醇含量每 4 h 补加 0.5% 甲醇含量每 4 h 补加 3 1.0% 甲醇含量每 1 h 补加图1 SDS-PAGE 分析配制 1% 分离胶和 5% 浓缩胶取上述样品 40 μl 加入 10 μl 5 Loading 1 目的蛋白的 SDS-PAGE 验证 3 M Buffer 混合制样每孔上样 30 μl 浓缩胶电压 80 V 分离胶电压 10 V 电泳结束后 ddho 冲 55 洗后在考马斯亮蓝染色液中振荡染色 40 min 然后用 ddho 反复冲洗放入脱色液 10% 的乙酸 43 中脱色直至背景清晰此过程需不定时更换脱色液 34 Western Blot 验证将 SDS-PAGE 电泳结束后未染色的胶电转至 NC 膜上加入封闭液 5% 的 M 蛋白质 marker 1 1.0% 甲醇含量每 1 h 补加 1.0% 甲醇含量每 4 BSA 溶于 TBST 中室温振荡孵育 1 h TBST 振荡 h 补加 3 0.5% 甲醇含量每 4 h 补加图洗涤 6 次每次 5 min 加入 TBST 溶液稀释的 His 目的蛋白的 Western Blot 验证标签的鼠源一抗 4 孵育过夜 1-16 h TBST 振荡洗涤 6 次每次 5 min 加入 TBST 溶液稀释的.3 AP 标记的羊抗鼠二抗室温振荡孵育 1 h TBST 振.3.1 荡洗涤 6 次每次 5 min 加入 BCIP/NBP 显色液醇含量分别为 1% 每 4 h 补加 0.5% 甲醇每 4 h 补避光显色 5-10 min 肉眼观察结果加 1% 甲醇每 1 h 补加时蛋白的表达量当甲醇浓度为 0.5% 时蛋白浓度最大且在第 4 天后涨势.1 结果目的蛋白SDS-PAGE Western Blot验证及纯化含重组质粒 ppic9k/procpa His+ Mut+ 的巴斯德毕赤酵母 GS115 菌株经甲醇诱导后在 47 kd 左右有明显的蛋白条带图 1 与目的蛋白大小符合经 Western Blot 分析为目的蛋白图. 单因素实验结果甲醇诱导浓度对蛋白表达量的影响考察甲缓慢第 6 天时浓度最大图 3-A 考虑到工业生产的时间成本问题诱导表达时间为 4 d.3. 诱导 ph 值对蛋白表达量的影响考察诱导 ph 分别为时目的蛋白的表达量发现诱导 ph 值为 4 时第 4 天目的蛋白表达量均较高图 3-B 因此单因素实验中的最适诱导 ph 值为 4 标准曲线.3.3 用 BSA 制作蛋白标准液根据不同蛋白浓度绘察诱导时菌体 OD600 值分别为时目的蛋白制蛋白浓度 mg/ml - 吸光度 A 的标准曲线经的表达量诱导时菌体 OD600 值为 7 时目的蛋白表数据处理分析获得蛋白质标准曲线回归方程为达量最高图 3-C 因此选择菌体 OD600 值为 7 y=0.4837x R = 作为诱导表达时的最适的菌体 OD600 值诱导时菌体 OD600 对蛋白表达量的影响考

4 A 表1 0 㳻ⲭ ᓖ mg ml 王晓云等毕赤酵母表达重组牛胰脏羧肽酶 A 的响应面法优化 016,3(3) 响应面旋转中心组合设计因素水平编码表水平因素 % 䞷4 h㺕甲醇添加量 %/4 h 0.5% 䞷诱导 ph % 䞷1 h㺕 OD B 䰤 h 根据表结果计算各项回归系数以这些回 1 归系数建立牛胰脏羧肽酶 A 表达量与诱导 ph 值 ph 诱导表达前培养基 OD600 OD 和甲醇添加㳻ⲭ ᓖ mg ml ph ph ph 6 出二次回归方程式为牛胰脏羧肽酶 A 表达量 M ph OD M ph M OD E ph OD M ph e 㳻ⲭ ᓖ mg ml-1 量 M 三个因素的数学回归模型由表可以得 C 模型方程的建立及显著性检验 003 OD M ph 变量的正系数表明该变量的正䰤 h 10 向变化能引起响应值的增加 OD 变量负系数表明 144 该变量的正向变化能引起响应值的减少负的二次 5 项系数表明方程的抛物面开口向下具有极大值点 3 能够进行最优分析 1 OD600=6 0.7 OD600=7 OD600=8 0.5 表响应面旋转中心组合设计与结果实验号 M ph OD600 蛋白浓度 / mg ml 根据 CCD 实验设计原理综合单因素影响实验结果以诱导 ph 值 ph 诱导表达前培养基图䰤 h 144 甲醇浓度 A 初始诱导 ph 值 B 及诱导时菌体 OD600 C 对蛋白表达量的影响响应面法实验设计 OD600 OD 和甲醇添加量 M 三因素为自变量以牛胰脏羧肽酶 A 表达量为响应值利用 CCD 组合设计实验方案并以 -1 0 和 1 分别代表变量的因素编码表 1 进行毕赤酵母菌表达牛胰脏羧肽回归模型方差分析表 3 显示实验选用的酶 A 的优化采用 Design Expert 软件进行实验模型显著 P<0.05 说明模型是合适的方差分析设计中的确定系数 R= 校正确定系数 RAdj=0.6

07479 M+0.18464 ph-0.08985 OD0.05555 M ph-0.043 M OD-3.15950E- 0.19 003 ph OD-.5376 M-0.011486 ph-3.4090e- 0.15 㳻ⲭ ᓖ mg ml-1 量 M 三个因素的数学回归模型由表可以得 0.1 0.

5 194 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 016,Vol.3,No.3 表 3 回归模型方差分析方差来源平方和自由度均方 F 值 P 值显著性模型 * A-M B-pH * C-OD AB AC BC A ** B C 残差失拟项误差总和注 :*0.01 < P < 0.05 ;**P < 0.01 R = ,R Adj = R Adj 可显示所选模型的拟合程度, 即预测值与实测值之间的相关性,Jalgeker 和 May 建议个拟合较好的模型 R 至少应为 0.80 [1] 由表 3 可知模型的一次项 B 影响显著,A,C 影响不显著从 F 值可以看出, 单因素对提取率的影响顺序依次是 B>A>C, 即 ph> 甲醇添加量 >OD 交互项影响不显著, 二次项 A 影响极显著, 表明该影响因素对表达量的影响不是简单的线性关系.6 响应面交互作用分析与工艺优化对诱导 ph 值 (ph) 诱导表达前培养基 OD 600 (OD) 和甲醇添加量 (M) 三因子, 两两作交互作用分析, 对其作响应面图, 分别见图 4- 图 6 等高线的形状反映交互效应的强弱大小, 圆形表示两因素交互作用不显著, 而椭圆形则表示两因素交互作用显著 3 张图中等高线均呈椭圆形, 故 3 个因素两两之间交互作用显著, 其中交互作用显著程度初始诱导 ph 值与甲醇添加量 < 诱导 ph 值与诱导表达前培养基 OD 600 < 甲醇添加量与诱导表达前培养基 OD 600 在求取最优提取条件时 RSM 能够综合考虑各因素对个响应值不同的影响程度及趋势进行综合评价可得最佳工艺参数为 : 甲醇每 4 h 含量 0.5% 诱导 ph 为 5.90 诱导表达前培养基 OD 600 为 6.54, 在此优化条件下, 牛胰脏羧肽酶 A 蛋白表达量为 6 mg/ml 为了进一步验证响应面分析法的可靠性, 采用上述最优条件进行蛋白表达,3 组平行, 测得牛胰脏羧肽酶 A 蛋白表达量分别为 :4 mg/ml 4 mg/ml 和 6 mg/ml, 取平均值为 5 mg/ml, 与理论值相比, 相对误差较小, 为 8% 因此, 采用响应面法分析优化得到的牛胰脏羧肽酶 A 的参数准确可靠, 可用于实际操作 3 讨论本研究利用毕赤酵母表达系统成功实现了牛胰脏羧肽酶 A 的可溶性表达及纯化, 对表达产物进行了 SDS-PAGE 及 Western Blot 验证通过单因素及响应面法优化了表达条件羧肽酶作为一大类水解酶, 应用及其广泛, 而其来源有限价格昂贵使其应用受到了限制借助基因工程手段可以实现羧肽酶的大量生产, 有助于摆脱来源有限, 价格昂贵的限制毕赤酵母表达系统是一种应用成熟的表达系统, 其分泌型表达使表达产物实现可溶状态, 广泛用于各 [13] 类酶的表达 Damaso 等在毕赤酵母中优化表达 [14] 了耐热木聚糖,Minning 等在毕赤酵母中优化表达了米根霉脂肪酶外源蛋白的表达量受到许多因素的调节由于毕赤酵母对所使用的氨基酸密码子具有明显的偏爱性, 同义密码子的表达效率差别明显 [15] 故在表达外源蛋白时, 应进行密码子优化和 GC 含量的调整 [16] 本研究中所使用的表达载体在构建时已进行了密码子的优化, 且表达量有显著提高宿主

001901 1 0.001901 4.64 0.0566 C 0.0001671 1 0.0001671 0.41 0.5373 残差 0.004095 10 0.0004095 失拟项 0.004905 5 0.0008190 误差 0.000 5 0.000 总和 0.01 19 注 :*0.01 < P < 0.05 ;**P < 0.01 R = 0.

6 B: ph 王晓云等毕赤酵母表达重组牛胰脏羧肽酶 A 的响应面法优化 016,3(3) B: ph A: M A: M 图4 甲醇添加量和诱导 ph 值的响应曲面和等高线图 c: od C: od A: M A: M 图5 甲醇添加量和诱导表达前培养基 OD600 的响应曲面和等高线图 c: od C: od B: ph B: ph 图6 诱导 ph 值和诱导表达前培养基 OD600 的响应曲面和等高线图菌的选择也至关重要目前用于外源基因表达的 SMD1163 pep4-prb1- 也被广泛使用 17 此外菌株种类众多如 GS115 X-33 KM71 等为了表达载体的选择表达载体导入酵母菌基因组多防止外源蛋白被同时表达的蛋白酶酶解蛋白酶缺拷贝菌株的筛选信号肽的选择和改造也至关重要陷型菌株 SMD1168 pep4- SMD1165 prb1- 和发酵条件的优化如溶氧 ph 温度甲醇浓

58 A: M A: M 图5 甲醇添加量和诱导表达前培养基 OD600 的响应曲面和等高线图 8.3 4 6 0 6.3 c: od 7.3 5.3 4.3 4.9 5.9 0.6 0.4 8.30 0.6 3.9 6.9 7.

7 196 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 016,Vol.3,No.3 度碳源诱导时间等都是影响蛋白产量的重要条件 ph 值影响细胞的生物量蛋白表达量活性及稳定性在 ph5.0 时, 重组人生长激素的生物量为 4 g/l, 蛋白表达量为 71 mg/l, 而当培养基 ph 达 6.0 时, 虽然细胞生物量最高可达 53 g/l, 但是蛋白表达量仅为 4 mg/l [18] 低温诱导或许可以通过降低蛋白酶活力, 增加外源蛋白稳定性来提高外源蛋白的产量合适的甲醇浓度是维持细胞高活性, 促进蛋白高表达的关键因素过低的甲醇浓度不足以完全诱导蛋白的表达, 而当甲醇浓度过高时又会对细胞产生毒性, 一般超过 1% 的甲醇浓度就会对酵母细胞产性毒性本研究中, 甲醇浓度为 0.5%, 每天补加培养基体积 0.5% 的纯甲醇时即可诱导目的蛋白表达, 且表达量高于 1% 的甲醇浓度另外, 当使用甲醇作为唯一碳源时, 细胞生长缓慢, 混合碳源补加的方法能有效提高表达量常用的混合碳源 [19] 有甲醇和山梨醇, 甲醇和甘油等 Diego 等在培养基中添加山梨醇显著提高了牛凝乳酶 B 的表达量山梨醇的添加有助于降低耗氧量及热产率 [0] 本研究中发现添加山梨醇可以增加蛋白表达量, 故在添加 1% 山梨醇的 BMMY 培养基中进行优化实验一般来说, 表达体系中细胞密度增加, 蛋白表达量也会相应升高但较高的细胞密度, 溶氧量营养成分, 酵母细胞的代谢产物会影响目的蛋白的产量和稳定性诱导前培养基的 OD 值表示了酵母细胞的生物量, 本研究中, 诱导表达前菌体的 OD 600 值分别为 6 7 8, 当 OD 600 的值为 7 时, 第 1 天的蛋白表达量明显高于其他两组, 且在前 4 天一直高于其他两组 4 结论本研究采用 CCD 实验设计原理设计及响应面分析, 建立牛胰脏羧肽酶 A 表达量的二次多项式数学模型经检验证明该模型是合理可靠的, 能够较好地预测牛胰脏羧肽酶 A 表达量利用模型的响应面及其等高线, 对影响牛胰脏羧肽酶 A 表达量的关键因素及其相互作用进行探讨, 通过典型分析并考虑到实际操作的便利性得到的最终优化条件参数为甲醇每 4 h 含量 0.5% 诱导 ph 为 5.90 诱导表达前培养基 OD 600 为 6.54 同时, 在此优化条件下, 牛胰脏羧肽酶 A 表达量的理论值为 6 mg/ml 采用上述最优条件进行蛋白表达,3 组平行, 测得牛胰脏羧肽酶 A 蛋白表达量分别为 4 mg/ ml 4 mg/ml 和 6 mg/ml, 取平均值为 5 mg/ml, 与理论值相比, 相对误差较小, 为 8% 因此, 采用响应面法分析优化得到的牛胰脏羧肽酶 A 的参数准确可靠, 获得了较高的蛋白表达量参考文献 [1] 吴静, 闵柔, 邬敏辰, 等. 羧肽酶研究进展 [J]. 食品与生物技术学报, 01, 31(8): []Abrunhosa L, Santos L, Venancio A. Degradation of ochratoxin A by proteases and by a crude enzyme of Aspergillus niger[j]. Food Biotechnol, 006, 0 :31-4. [3] 冯红霞. 羧肽酶菌株的筛选及其酶的分离纯化酶学性质的研究 [D]. 南京 : 南京农业大学, 00. [4] 赵莹. 猪羧肽酶 A1 酶原的基因克隆及其在毕赤酵母中的表达 [D]. 成都 : 四川农业大学, 009. [5] 易静, 郝晓柯, 苏明权, 等. 人羧肽酶 A1 活性中心的毕赤酵母可溶表达 [J]. 第四军医大学学报, 006 7(5): [6]Doreen D, Huaming W, Gunter S, et al. Structural and functional characterization of ochratoxinase, a novel mycotoxin-degrading enzyme[j]. Biochemistry Journal, 014, 46 : [7]Zhihong L, Kunlun H, Yunbo L. Ochratoxin A and ochratoxinproducing fungi on cereal grain in China :a review[j]. Food Additives & Contaminants :Part A, 015, 3(4): [8]Pitout, M. J. The hydrolysis of ochratoxin A by some proteolytic enzymes[j]. Biochemical Harmacology, 1969, 18 : [9]Deberghes P, Betbeder AM, Boisard F, et al. Detoxification of ochratoxin A, a food contaminant :prevention of growth of Aspergillus ochraceus and its production of ochratoxin A[J]. Mycotoxin Researsh, 1995, 11 : [10] 师磊. 两柱芽孢杆菌和重组羧肽酶 A 对赭曲霉毒素 A 的脱毒研究 [D]. 北京 : 中国农业大学, 014. [11]Li PZ, Anumanthan A, Gao XG, et al. Expression of recombinant proteins in Pichia Pastoris[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 007, 14 : [1]Jodekar AM, May AT. Product exceuence through design of experiments[j]. Cereal Foods World, 1987, 3(1):

0 时, 虽然细胞生物量最高可达 53 g/l, 但是蛋白表达量仅为 4 mg/l [18] 低温诱导或许可以通过降低蛋白酶活力, 增加外源蛋白稳定性来提高外源蛋白的产量合适的甲醇浓度是维持细胞高活性, 促进蛋白高表达的关键因素过低的

8 016,3(3) 王晓云等 : 毕赤酵母表达重组牛胰脏羧肽酶 A 的响应面法优化 197 [13]Damaso MC, Almeida MS, Kurcenbach E, et al. Optimized expression of a thermostable xylanase from Thermomyces lanuginosus in Pichia pastoris[j]. Applied and Environment Microbiology, 003, 69(10): [14]Minning S, Serrano A, Ferrer P, et al. Optimization of the high-level production of Rhizopus oryzae lipase in Pichia pastoris[j]. J Biotechnol, 001, 86 : [15] 陆永超, 蒋琳. 毕赤酵母高效表达策略概述 [J]. 微生物学免疫学进展, 013, 41(1): [16] 卢其湘, 赵树进. 外源基因在毕赤酵母中表达的优化 [J]. 氨基酸和生物资源, 005, 7(4):7-9. [17]Joan LC, James MC. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[j]. FEMS Microbiology Reviews, 000, 4 : [18]Bayraktar E. Effects of ph on human growth hormone production by Pichia pastoris considering the expression levels of regulatory genes[d]. Ankara :Middle East Technical University, 009. [19]Diego GN, Matías NR, Martín B, et al. Cloning, expression and optimized production in a bioreactor of bovine chymosin B in Pichia (Komagataella)pastoris under AOX1 promoter[j]. Protein Expression and Purification, 013, 9 : [0]Jungo C, Schenk J, Pasquier M, et al. A quantitative analysis of the benefits of mixed feeds of sorbitol and methanol for the production of recombinant avidin with Pichia pastoris[j]. Journal of Biotechnology, 007, 131 : ( 责任编辑李楠 )

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: 307, [], [2],,,, [3] (Response Surface Methodology, RSA),,, [4,5] Design-Expert 6.0,,,, [6] VPJ33 ph 3,, ph, OD, Design-Expert 6.0 Box-Behnken, VPJ3

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016,3(3) 王 晓 云 等 : 毕 赤 酵 母 表 达 重 组 牛 胰 脏 羧 肽 酶 A 的 响 应 面 法 优 化 191 食 品 和 饲 料 中 赭 曲 霉 素 的 去 除 [] [3] 用 作 脱 苦 味 剂 等 动 物 来 源 的 羧 肽 酶 主 要 存 在 于 猪 牛 等 的 胰

016,3(3) 王晓云等 : 毕赤酵母表达重组牛胰脏羧肽酶 A 的响应面法优化 191 食品和饲料中赭曲霉素的去除 [] [3] 用作脱苦味剂等动物来源的羧肽酶主要存在于猪牛等的胰