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1 50 0, Vol.5, No.06 食品科学工艺技术猪股骨头胶原蛋白降血压肽的分离纯化刘小红, 李诚 *, 付刚, 苏赵 ( 四川农业大学食品学院, 四川雅安 650) 摘要 : 依次采用碱性蛋白酶木瓜蛋白酶和风味蛋白酶对猪股骨头胶原蛋白进行酶解, 制备降血压肽为了得到高活性高纯度的降血压肽, 依次采用超滤离子交换层析凝胶层析对酶解液进行分离纯化, 采用体外检测方法测定各分离产物对血管紧张素转化酶活性的半抑制浓度 (IC 50 值 ) 结果显示 : 猪骨酶解液经超滤分离获得分子质量小于 5 ku 的组分对血管紧张素转化酶的抑制活性最高,IC 50 值为 00 mg/ml; 该组分进行离子交换层析分离得个组分, 其中组分的活性最高,IC 50 值为 88 mg/ml; 再将组分进行凝胶层析分离得个组分, 其中组分的活性最高,IC 50 值为 0.95 mg/ml 关键词 : 酶解 ; 降血压肽 ; 超滤 ; 离子交换层析 ; 凝胶层析 ; 血管紧张素转化酶半抑制浓度 Separation and Purification of Anti-hypertensive Peptides from Pig Femoral Collagen LIU Xiao-hong, LI Cheng*, FU Gang, SU Zhao (College of Food, Sichuan Agricultural University, Ya an 650, China) Abstract: Anti-hypertensive peptides were prepared from pig femoral bones by sequential hydrolysis using alkaline protease, papain and flavourzyme. In order to obtain high activity and purity of anti-hypertensive peptides, ultrafiltration, ion exchange chromatography and gel permeation chromatography were used to separate the hydrolysates. The angioensin-Ⅰ converting enzyme (ACE) inhibitory activity (IC 50 ) of the separated fractions was determined in vitro. The results showed that the ultrafiltration fraction with molecular weight of less than 5 ku showed the highest ACE inhibitory activity, with an IC 50 value of 00 mg/ml. The fraction was then purified by ion exchange chromatography to obtain peaks, among which peak had the strongest ACE inhibitory activity with an IC 50 value of 88 mg/ml. The peak was further fractionated by gel permeation chromatography to obtain sub-peaks, and the sub-peak had the highest ACE-inhibitory activity with an IC 50 value of 0.95 mg/ml. Key words: enzymatic hydrolysis; anti-hypertensive peptides; ultrafiltration; ion exchange chromatography; gel permeation chromatography; half inhibitory concentration of angioensin-Ⅰ converting enzyme 中图分类号 :S879.9 文献标志码 :A 文章编号 :00-660(0) doi:0.7506/spkx 我国是一个畜禽养殖大国,00 年我国肉类总产压症状的手段对人类来说具有非常重要的现实意义 [-5], 量达到 7 95 万 t, 畜禽骨产量大约达到 000 万 t, 但大值得进行深入研究量的骨头都被废弃了, 其深加工率不足 %, 这不仅造降血压肽, 又称为血管紧张素转化酶 (angioensin-Ⅰ 成了资源的巨大浪费, 而且还会因骨头所富含的营养 converting enzyme,ace) 抑制肽, 是从食物蛋白中分离物质易于腐败而造成严重的环境污染 [-] 作为养猪业出的具有显著降低血压功效的多肽短链物质 [6], 这些多肽发达的国家, 如何科学有效高值化开展猪骨综合的氨基酸序列和肽链长度各有不同, 但都具有类似的功 [7] 利用就成为一个重要的问题, 目前从食物原料中开发能自 Oshima 等从明胶蛋白中获得 ACE 抑制肽起, 学功能活性肽成为科学家们研究的热点, 其中降血压活性者们相继从植物蛋白 [8-] 水产蛋白 [-5] [6-8] 乳源蛋白以 [9-0] 肽是目前研究较多的一类, 而食源性蛋白降血压肽由于及肉类蛋白的酶解物中提取出降血压肽以骨为原料其无毒无副作用安全性高, 可开发成降压药物或者降制备降血压肽的研究报道虽然不少, 但大多都只是酶解压保健品 [], 这种通过保健食品的途径预防和缓解高血工艺的研究或以单一酶进行酶解以及单一的手段分离纯收稿日期 : 作者简介 : 刘小红 (985 ), 女, 硕士研究生, 研究方向为功能性食品 @qq.com * 通信作者 : 李诚 (96 ), 男, 教授, 博士, 研究方向为畜产品加工与质量安全控制 lichenglcp@6.com

了得到高活性高纯度的降血压肽, 依次采用超滤离子交换层析凝胶层析对酶解液进行分离纯化, 采用体外检测方法测定各分离产物对血管紧张素转化酶活性的半抑制浓度 (IC 50 值 ) 结果显示 : 猪骨酶解液经超滤分离获得分子质量

2 工艺技术食品科学 0, Vol.5, No.06 5 [] 化, 如魏庭浩采用胰蛋白酶酶解猪骨制备降血压肽, [] 并用超滤对酶解液进行了初步的分离 ; 王金玲等以酸性蛋白酶酶解带鱼脊骨并用超滤分离得到了分子质量在 ku 以下的降血压肽, 其半抑制浓度 (half maximal (50%) inhibitory concentration,ic 50 ) 为 0.77 mg/ml; [] 王英超等采用凝胶层析对羊骨降血压肽进行了分离纯化本实验分别采用了碱性中性酸性蛋白酶解猪骨, 在最大程度上充分利用了原料, 提高了降血压肽的得率在生物活性肽的研究中, 分离纯化是一个重要环节, 只有达到一定的纯度, 肽的某种生物活性才能得以体现, 故本实验将酶解液依次通过超滤离子交换层析凝胶层析进行分离纯化, 以期获得高活性且纯度较高的降血压肽材料与方法. 材料与试剂猪骨雅安农贸市场 ; 猪骨粉实验室自制 ; UNO-S 阳离子交换树脂美国 io-rad 公司 ; 木瓜蛋白酶风胃蛋白酶碱性蛋白酶帝斯曼中国有限公司 ; ACE 马尿酰 - 组氨酰 - 亮氨酸 (hippuryl-his-leu,hhl) 美国 Sigma 公司仪器与设备蛋白层析仪美国 io-rad 公司 ; 超滤管 (5 0 ku) 美国 Millipore 公司 ;QT- 漩涡混匀器上海琪特分析仪器有限公司 ;UV-00 紫外分光光度计上海美谱达仪器有限公司 ;ULT 冷冻干燥机美国 Thermo Scientific 公司 ;D750 Osterode 高速冷冻离心机德国 iofuge 公司 ;ULUP-IV-0T 超纯水装置西安优普仪器设备有限公司 ;PHS-C 型 ph 计成都世纪方舟科技有限公司. 方法.. 分离纯化猪骨降血压肽的工艺过程制备酶解液超滤离子交换层析凝胶层析... 酶解液的制备称取一定量的猪骨粉, 按底物含量为 6%(m/m) 加入相应体积的蒸馏水, 再按酶活为 000 U/g 加入碱性蛋白酶, 调节 ph 值为 0., 在 58. 反应 7 h 后,00 沸水浴 0 min 灭活 ; 再调节 ph 值为 6., 按酶活为 U/g 加入木瓜蛋白酶,55 反应.8 h 时后,00 沸水浴 0 min 灭活 ; 再调节 ph 值为 7.0, 按酶活为 78 U/g 加入风味蛋白酶,5. 反应. h 后,00 沸水浴 0 min 灭活, 冷却后 r/ min 离心 0 min, 上清液即为后续实验所需的酶解液.. 超滤首先将酶解液用截留分子质量为 0 ku 的超滤管进行超滤, 然后将分子质量小于 0 ku 的酶解液用 5 ku 的超滤管进行超滤得到分子质量范围为 >0 ku 5~0 ku <5 ku 个组分, 分别测定其 ACE 抑制率, 收集体外 ACE 抑制率最高的组分, 测定其 IC 50 值, 冻干备用... 离子交换层析采用蛋白层次仪对收集组分进行线性梯度洗脱层析条件 :UNO-S 阳离子交换树脂, 洗脱液为含不同浓度 NaCl 的 mol/l 醋酸钠首先用超纯水将蛋白层析仪的 A 泵冲开, 用 A 液 ( mol/l 醋酸钠 ) 平衡柱子, 上样, 再用 A 液和液 ( 含不同浓度 NaCl 的 mol/l 醋酸钠 ) 进行线性梯度洗脱, 洗脱程序 :A 液 00%~0 液 0~00%, 收集洗脱液, 清洗交换剂管道和装置测定每管洗脱液在 nm 波长处的吸光度, 考察不同流速离子强度 ph 值对分离效果的影响, 测定各组分 ACE 抑制率, 收集体外 ACE 抑制率最高的组分, 测定其 IC 50 值 ) 流速对分离效果的影响 :A 液为 mol/l 醋酸钠 (ph.0), 液为含 mol/l NaCl 的 mol/l 醋酸钠 (ph.0), 考察不同流速 (.5 ml/min) 对分离纯化效果的影响, 确定最适流速 ;) 离子浓度对分离效果的影响 :A 液为浓度为 mol/l 醋酸钠 (ph.0), 液为含不同浓度 NaCl 的 mol/l 醋酸钠 (ph.0), 流速为 ml/min, 考察不同离子浓度 ( mol/l) 对分离纯化效果的影响, 确定最适离子浓度 ;) 洗脱液 ph 值对分离效果的影响 :A 液为 mol/l 醋酸钠, 液为含 mol/l NaCl 的 mol/l 醋酸钠, 流速为 ml/min, 考察洗脱液的不同 ph 值 (.6.0.) 对分离纯化效果的影响, 确定最适 ph 值.. 凝胶层析经过超滤之后得到的降血压肽分子质量大都小于 5 ku, 而 Sephadex G-5 的分离范围在 ~5 ku 之间, 故选用 Sephadex G-5 作进一步的分离, 选用超纯水作为洗脱液首先用超纯水平衡柱子, 上样, 再用超纯水洗脱, 收集洗脱液, 清洗交换剂管道和装置测定每管洗脱液在 nm 波长处的吸光度, 考察不同流速 (0..5 ml/min) 对分离纯化效果的影响, 确定最适流速 [].. 降血压肽活性的测定 ACE 能够催化分解血管紧张素 Ⅰ 的模拟物 HHL 产生马尿酸, 该物质在 8 nm 波长处具有特征吸收峰, 其含量与该特征吸收峰有一定相关性当加入 ACE 抑制肽时, 抑制肽与 ACE 活性区域作用, 使 ACE 对 HHL 的催化分解作用受到抑制, 马尿酸的生成量减少通过测定吸光度, 判断马尿酸生成量, 从而确定水解物的 ACE 抑制率具体操作参考文献 []

3 5 0, Vol.5, No.06 食品科学工艺技术按下式计算 ACE 抑制率 : ACE 抑制率 /%=(A b A a )/(A b A c ) 00 式中 :A a 为样品与 ACE HHL 共同反应后的吸光度 ;A b 为 ACE 与 HHL 完全反应后的吸光度 ;A c 为 ACE 与 HHL 反应的空白对照的吸光度.. IC 50 值测定方法将样品配制成不同的质量浓度, 分别测定其 ACE 抑制率, 以样品质量浓度为横坐标 ACE 抑制率为纵坐标, 绘制圆滑曲线, 计算 IC 50 值结果与分析. 超滤对酶解液的分离效果酶解液经超滤管初步分离, 共得到个组分, 分别收集这个组分进行 ACE 抑制率的测定, 结果见图分子质量小于 5 ku 的肽抑制率最高,IC 50 值为 00 mg/ml, 因此收集分子质量小于 5 ku 的肽作进一步的分离 ACE /% Fig ku 图 5 0 ku 各组分的 ACE 抑制率 0 ku ACE inhibitory activity of ultrafiltration fractions. 离子交换层析对分子质量小于 5 ku 肽的分离效果.. 流速对分离效果的影响.. A C 80 A. ml/min;. ml/min;c..5 ml/min Fig. 图不同流速的分离效果图谱 Separation efficiency at different flow rates 由图可知, 流速对分离效果影响较大, 当流速为 ml/min 时, 分离效果相近, 峰形相似, 都得到个峰, 但当流速为.5 ml/min 时, 只能得到个峰, 不能将峰和峰分开, 因此为了缩短分离时间并保持较好的分离效果, 采用流速为 ml/min.. 离子浓度对分离效果的影响 Fig..8 A.8.8 C A mol/l;. mol/l;c. 5 mol/l 图不同离子浓度的分离效果图谱 Separation efficiency at different ion concentrations 由图可知, 离子浓度对分离效果影响并不大, 这个离子浓度条件下的分离效果相近, 出峰的时间也相近, 都得到个峰, 从峰形和成本个方面综合考虑, 采用离子浓度为 mol/l

. IC 50 值测定方法将样品配制成不同的质量浓度, 分别测定其 ACE 抑制率, 以样品质量浓度为横坐标 ACE 抑制率为纵坐标, 绘制圆滑曲线, 计算 IC 50 值结果与分析.

4 工艺技术食品科学 0, Vol.5, No 洗脱液 ph 值对分离效果的影响.5 A C A. ph.6;. ph.0;c. ph. 图不同 ph 值的分离效果图谱 Fig. Separation efficiency at different eluent ph values 由图可知, 洗脱液的 ph 值对分离效果影响较大, 当 ph 值为.0 时, 可以得到个峰形较好的峰 ; 当 ph 值为.6 时, 只能得到个峰, 与 ph.0 时的图谱相比, 峰和峰不能分开 ; 当 ph 值为. 时, 只能得到个峰, 与 ph.0 时的图谱相比, 峰和峰峰和峰均不能分开, 因此洗脱液的 ph 值选用.0.. 洗脱条件的确定.8 图 5 最优条件下的离子交换分离图谱 Fig.5 Ion exchange chromatogram under the optimum separation conditions 综合以上得出最佳洗脱条件 :A 液为 mol/l 醋酸钠 (ph.0), 液为含 mol/l NaCl 的 mol/l 醋酸钠 (ph.0), 前 0 管用 00%A 液洗脱, 后 0 管按 00%~0%A 液 0%~00% 液梯度洗脱, 流速为 ml/min, 该条件下的分离图谱见图 5 分别收集这个组分进行 ACE 抑制率的测定, 结果见图 6 个组分之间的抑制率有明显差异, 在相同质量浓度下, 组分的抑制活性最高,IC 50 值为 88 mg/ml, 比超滤之后得到的降血压肽活性提高了将近倍, 因此收集组分进行进一步分离 Fig.6 ACE /% 图最优条件下分离所得的各组分的 ACE 抑制率 ACE inhibitory rates of four peaks obtained by ion exchange chromatography under the optimum conditions. 凝胶层析对组分的分离效果由图 7 可知, 流速对分离效果影响较大, 当流速为.5 ml/min 时, 仅能得到个峰, 并没有将组分分开 ; 当流速为 ml/min 时, 可以得到个峰, 但峰形不好, 后个峰分离度不高 ; 当流速为 0. ml/min 时, 分离效果相近, 都得到个峰, 且峰形相差不大, 为缩短分离时间并保持较高的分离效果, 采用 ml/min 分别收集这个组分进行 ACE 抑制率的测定, 结果见图 8 个组分之间的抑制率有明显差异, 在相同质量浓度下组分的抑制活性最高, 且 IC 50 为 0.95 mg/ml, 比离子交换层析得到的降血压肽活性提高了.5 倍.6 -. A

0 时的图谱相比, 峰和峰不能分开 ; 当 ph 值为. 时, 只能得到个峰, 与 ph.0 时的图谱相比, 峰和峰峰和峰均不能分开, 因此洗脱液的 ph 值选用.0.. 洗脱条件的确定.8 图 5 最优条件下的离子交换分离图谱 Fig.

5 5 0, Vol.5, No.06 食品科学工艺技术.8. C D A..5 ml/min;. ml/min;c. ml/min;d. 0. ml/min Fig.8 Fig.7 ACE /% 结论图 7 不同流速的分离效果图谱 Separation efficiency at different flow rates 图 8 各组分的 ACE 抑制率 ACE inhibitory rates of four sub-peaks obtained by gel permeation chromatography 超滤对粗酶解液分离纯化结果表明 : 分子质量小于 5 ku 的肽的 ACE 抑制率最高, 且 IC 50 为 00 mg/ml, 此时 [] 得到的 IC 50 比魏庭浩的研究结果高, 可能由于该研究中主要测定的为分子质量小于 ku 的肽段, 而据许多文献报道, 具有较高降血压活性的肽段分子质量小于 ku [5] 由于分子质量小于 ku 的肽段含量很低, 如果采用 ku 的超滤管超滤会大大降低降血压肽的得率, 因此仅针对超滤之后小于 5 ku 的肽组分进行离子交换层析, 其分离纯化结果表明组分的 ACE 抑制率最高, 且 IC 50 为 88 mg/ml, 比纯化前的降血压肽活性提高了将近倍凝胶层析对离子交换层析得到活性最高的肽组分的分离纯化结果表明 : 组分的 ACE 抑制率最高, 且 IC 50 为 0.95 mg/ml, 比离子交换层析得到的降血压肽活性提高了.5 倍参考文献 : [] 王卫, 张志宇, 刘达玉, 等. 畜禽骨加工利用及其产品开发 [J]. 食品科技, 009, (5): [] 罗通彪. 畜禽鲜骨的开发利用 [J]. 食品研究与开发, 00, (5): [] 肖红, 段玉峰, 刘平, 等. 食品蛋白降血压肽及其研究进展 [J]. 食品研究与开发, 00, 5(5): -6. [] ERIKSEN E K, VEGARUD G E, LANGSRUD T, et al. Effect of milk proteins and their hydrolysates on in vitro immune responses[j]. Small Ruminant Research, 008, 79(): 9-7. [5] 吴蕾, 庞广昌, 张建辉. 乳源性生物活性肽的研究进展 [J]. 食品研究与开发, 009, 0(): [6] 王朝旭, 赵丹, 王小雪. 酶法水解骨蛋白最佳条件的研究 [J]. 食品科学, 00, (): 8-9. [7] OSHIMA G, SHIMAUKURO H, NAGASAWA K. Peptide inhibitors of angiotensinⅠ-converting enzyme in digest of gelatin by bacterial collagenase[j]. iochimica et iophysica Acta, 979, 566(): 8-7. [8] 周存山, 余筱洁, 杨虎清, 等. 混合酶法制备紫菜蛋白降压肽 [J]. 中国食品学报, 00, 0(): [9] 胡少新, 江连州, 许德春, 等. 大豆分离蛋白生产降血压肽酶解技术研究 [J]. 大豆科学, 0, 0(): [0] MIYOSHI S, ISHIKAWA H, KANEKO T. Structures and activity of angiotensin-converting enzyme in an α-zein hydrolyzate[j]. Agricultural iological Chemistry, 99, 55(): 8-9. [] 辛志宏, 吴守一, 马海乐. 从麦胚蛋白质中制备降血压肽的研究 [J]. 食品科学, 00, (0): 0-. [] 毋瑾超, 汪依凡, 方长富. 鲢鱼降血压肽的酶解条件 [J]. 湛江海洋大学学报, 006, 6(): 6-9. [] 王金玲, 何国庆. 酶解法制备带鱼脊骨降血压肽及其降血压效果 [J]. 食品与发酵工业, 00, 6(): [] UKEDA H, MATSUDA H, OSAJIMA K. Peptides from peptic hydrolyzate of heated sardine meat that inhibit angiontensinⅠconverting enzyme[j]. Journal of the Agricultural Chemistry Society of Japan, 99, 66(): 5-9. [5] FUJITA H, YOKOYAMA M. LKPNM: A prodrug-type ACE inhibitory peptide derived from fish proteins[j]. Immunopharmacology, 999, (/): 7. [6] NAKAMURA Y, MASUDA O, TAKANO T. Decrease of tissue angiotensin Ⅰ-converting enzyme activity upon feeding sour milk in spontaneously hypertensive rats[j]. Journal of ioscience, iotechnology and iochemistry, 996, 60(): [7] 李朝慧, 罗永康, 王全宇. 乳清蛋白酶解制备 ACE 抑制肽的研究 [J]. 中国乳品工业, 005, (): 8-. [8] 刘妍妍, 张丽萍. 牛乳酪蛋白源降血压肽的分离及其分子量分布研究 [J]. 中国乳品工业, 006, (5): 6-7. [9] JANG A, LEE M. Purification and identification of angiotensinⅠconverting enzyme inhibitory peptides from beef hydrolysates[j]. Meat Science, 005, 69(): [0] ARIHARA K, NAKASHIMA Y, MUKAI T, et al. Peptide inhibitors of angiotensinⅠ-converting enzyme from enzymatic hydrolysates of porcine skeletal muscle proteins[j]. Meat Science, 00, 57(): 9-. [] 魏庭浩. 猪骨胶原多肽的制备及其血管紧张素转换酶抑制活性的研究 [D]. 雅安 : 四川农业大学, 00: 8-9. [] 王金玲, 何国庆. 酶解法制备带鱼脊骨降血压肽及其降血压效果 [J]. 食品与发酵工业, 00, 6(): [] 王英超, 李天俊, 王敏华, 等. 羊骨酶解物中降血压肽的分离纯化工艺研究 [J]. 食品研究与开发, 007, 8(9): 7-. [] CUSHMAN D W, CHEUNG H S. Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin Ⅰ-converting enzyme of rabbit lung[j]. iochemistry Pharmacology, 97, 0(7): [5] 尹波欢, 王燕. 食源性降血压肽研究进展 [J]. 农产品加工 : 学刊, 0, 7(7): -.

chromatography 超滤对粗酶解液分离纯化结果表明 : 分子质量小于 5 ku 的肽的 ACE 抑制率最高, 且 IC 50 为 00 mg/ml, 此时 [] 得到的 IC 50 比魏庭浩的研究结果高, 可能由于该研究中主要测定的为分子质量小于 ku 的肽段, 而据

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<453A5CCAB3C6B7BFC6D1A73131C4EA3134C6DA5C3134C6DA5C3032B7D6CEF6> 227 ELISA 刘沙洲 1,2, 桑小雪 1, 欧阳华学 3, 雷绍荣 3, 白林含 1, * (1. 四川大学生命科学学院, 四川成都 610065;2. 成都市食品药品检测中心, 四川成都 610045; 3. 四川省农业科学院分析测试中心, 四川成都 610066) 目的 : 比较