标题

Size: px

Start display at page:

Download "标题"

存虫刁
7 years ago
Views:

1 第 12 卷第 5 期 2014 年 9 月生物加工过程 Chinese Journal of Bioprocess Engineering Vol 12 No 5 Sep 2014 doi: / j issn 腈水解酶 psn 基因工程菌的发酵及产酶条件优化熊雷, 李恒, 龚劲松, 杨涛, 朱小燕, 许正宏, 史劲松 ( 江南大学药学院, 无锡 ) 摘要 : 来自恶臭假单胞菌的腈水解酶具有高效催化 3 氰基吡啶产烟酸的能力, 对表达该酶的基因 psn 进行发酵和产酶条件优化, 通过对 C 源 N 源磷酸盐金属离子温度诱导剂浓度和诱导时间进行单因素考察, 获得最适培养基条件 (g / L): 葡萄糖 5 蛋白胨 15 酵母粉 5 (NH 4 5 K 2 H 24 5 KH Mg 0 48; 最佳诱导条件 : 培养 2 5 h 后添加 IPTG 诱导, 浓度 0 2 mmol / L, 诱导温度 30 在该条件下培养, 重组大肠杆菌的腈水解酶比酶活可达到 U / ml, 比优化前提高了 2 26 倍在此基础上, 于 5 L 发酵罐上进行 C N 源的补料研究, 获得最适分批补料策略, 发现其腈水解酶活力可达到 U / ml, 是优化前的 3 74 倍关键词 : 腈水解酶 ; 烟酸 ; 发酵 ; 分批补料培养中图分类号 :Q78 文献标志码 :A 文章编号 : (2014) Optimization of fermentation and nitrilase production conditions of engineered Escherichia coli for expression of psn gene XIONG Lei,LI Heng,GONG Jinsong,YANG Tao,ZHU Xiaoyan,XU Zhenghong,SHI Jinsong ( School of Pharmaceutical Science,Jiangnan University,Wuxi ,China) Abstract:Nitrilase from Pseudomonas putida exhibited high specificity toward 3 cyanopyridine and could be used for generating nicotinic acid In order to optimize the fermentation conditions of recombination Escherichia coli for expression of psn gene, the influences of carbon source,nitrogen source,phosphorus, metal ions,temperature,iptg concentration,time for induction of recombinant E coli for expression of psn were optimized by single factor test The optimum culture conditions for the production of nitrilase are as follows:glucose 5 g / L,tryptone 15 g / L,yeast extract 5 g / L,( NH 4 5 g / L,K 2 H 24 5 g / L, KH g / L,Mg 0 48 g / L The optimal time point, concentration, temperature for induction with IPTG were at 2 5 h after inoculation,0 2 mmol / L and 30,respectively The activity of nitrilase expressed in E coli under the optimal fermentation conditions reached up to U / ml,which was 2 26 times higher than the initial level And the fed batch fermentation strategy for producing nitrilase from recombination E coli in 5 L fermentor was optimized Under the optimized conditions of fed batch fermentation,the specific activity reached U / ml, which was 3 74 times higher than the initial level Key words:nitrilase; nicotinic acid; fermentation; fed batch 收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ) ; 江苏省自然科学基金 (BK ) 作者简介 : 熊雷 (1988 ), 男, 湖北武汉人, 硕士研究生, 研究方向 : 生物催化 ; 史劲松 ( 联系人 ), 教授, E mail:shijs@ 163 com

2 8 生物加工过程第 12 卷腈水解酶 ( EC ) 是一类能够将腈化合物水解生成羧酸和氨的催化剂, 其立体选择性可用于解决化学工艺中手性催化效率低的问题 [1-2] 腈水解酶具有来源广泛反应条件温和特异性高和选择性强的特点, 在有机合成领域具有很好的潜在应用价值 [3-5] 目前已有较多的研究是围绕腈类化合物的生物转化展开, 并已有多种腈水解酶应用于工业生产, 然而仍然存在着诸如比酶活低稳定性差和底物谱窄等问题 [6] 因此, 筛选发掘新功能的腈水解酶并通过异源表达提高其产酶水平, 是目前生物转化腈化合物的重要任务烟酸又名维生素 B3, 被广泛用作药物中间体和食品添加剂 [7], 是人体和动物体不可缺少的营养组分, 目前全球市场需求量在 3 5 万 t 左右烟酸的传统生产工艺是以吡啶为原料, 通常需要强酸 ( 或强碱 ) 高温和高压等反应条件, 存在副产物多产量低和环境污染严重等缺点 [8-9] 目前, 生物法直接水解 3 氰基吡啶生成烟酸已成为新的工艺研究热点, 而腈水解酶活性是影响其工艺效益的关键 [10-11] Sharma 等报道了以 3 氰基吡啶为原料, 在微生物腈水解酶的作用下转化生成烟酸的工艺, 所获产品的纯度大大提高, 但其腈水解酶活力偏低, 仅为 6 67 U / mg ( 以细胞干质量计 ); 同样, Prasad [12] 等从 Rhodococcus sp NDB 1165 中获得的腈水解酶活力也仅为 2 39 U / mg ( 以细胞干质量计 ), 导致最终合成烟酸产量不高而影响其工业应用 [13] 笔者所在课题组朱小燕等筛选到 1 株产腈水解酶的恶臭假单胞菌 ( Pseudomonas putida CGMCC3830), 并已成功扩增获得腈水解酶基因 psn, 再将该 psn 克隆到大肠杆菌中, 发现其重组菌在腈化合物的生物转化中表现出良好的应用前景 [14] 在此基础上, 笔者通过对重组工程菌产酶条件的优化, 以期实现腈水解酶工程菌的高菌体浓度和高酶活发酵, 为将来烟酸的生物法生产创造有利条件 1 材料与方法实验材料菌株与质粒恶臭假单胞菌腈水解酶基因 psn 由本实验室成功扩增获得, 并在宿主 Escherichia coli Rosetta gami (DE3) 中进行表达, 构建了腈水解酶基因工程菌株 E coli Rosetta gami (DE3) / pet 28a ( +) psn 主要试剂 3 氰基吡啶烟酸 ( 纯度 98%),Sigma 公司 ; 氯霉素卡那霉素异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG), 上海生工生物工程有限公司 ; 酵母粉和葡萄糖 ( 生化等级试剂 ), 购于国药集团化学试剂有限公司主要仪器 DHZ DA 型恒温摇床, 太仓市实验设备厂 ; 电子天平, 美国 Sartorius 公司 ; 高效液相色谱仪, 美国 Dionex 公司 ;5 L 发酵罐, 上海保兴生物设备工程有限公司 ; 立式冷冻高速离心机, 日本日立公司培养基种子培养基 ( g / L): 蛋白胨 10 酵母粉 5 NaCl 10;pH 7 2 发酵培养基 ( g / L): 葡萄糖 5 蛋白胨 15 酵母粉 5 ( NH 4 5 K 2 H 24 5 KH Mg 0 48;pH 7 2 C 源补料培养基 : 配制一定体积 100 和 200 g / L 葡萄糖溶液 N 源补料培养基 Ⅰ: 蛋白胨 15 g, 酵母粉 5 g, (NH 4 5 g; 定容到 300 ml N 源补料培养基 Ⅱ: 蛋白胨 30 g, 酵母粉 10 g, (NH 4 10 g; 定容到 300 ml 1 2 实验方法摇瓶培养取 -80 保存的菌株甘油管, 摇瓶活化 ( r / min 10 h) 后, 涂布于平板,37 培养 12 h 挑取单菌落于 50 ml 摇瓶培养基中, r / min 培养 10 h 以 1% 接种量将种子液接入到 250 ml 摇瓶中, r / min 振荡培养, 于适当时间加入诱导剂 IPTG, 诱导产酶 L 发酵罐培养取上述种子液, 按 1% 接种量接入 5 L 发酵罐中,37 培养, 搅拌转速 400 r / min, 待适当时间, 加入 IPTG 诱导产酶流加方法发酵 6 h 开始补加, 流速控制在 0 5 ml / min, 发

3 第 5 期熊雷等 : 腈水解酶 psn 基因工程菌的发酵及产酶条件优化 9 酵 14 h 停止补料 1 3 检测方法菌体浓度的测定 : 菌液稀释适当倍数后, 在 600 nm 下测定吸光值,OD 600 = 吸光值稀释倍数菌体干质量的测定 : 取菌液离心, 用生理盐水洗涤, 稀释不同的倍数, 放入 105 烘箱中烘干至恒质量, 称质量, 绘制出菌体浓度与菌体干质量的标准曲线, 即细胞干质量 = 0 395OD 600 残糖的测定方法 : 以 BA 40D 型生物传感器测定残糖浓度 HPLC 检测条件 : 采用戴安 HPLC ( Ultimate 3000), C18 柱 (Waters,4 6 mm 150 mm,5 μm), 流动相为乙腈和 0 025%( 体积分数 ) H 3 混合缓冲溶液, 体积比 3 2, 流速 1 ml / min, 柱温 30, 进样量 10 μl, 检测波长 268 nm 酶活定义 : 每分钟产生 1 μmol 烟酸所需的酶量定义为 1 个酶活单位 (U); 每毫克菌体干质量所含的酶活单位为 1 DCW; 每毫升菌液所含酶活单位定义为 1 U / ml 取 100 μl 菌液, r / min 离心 2 min, 弃上清, 加入 100 mmol / L PBS 缓冲液洗涤菌体, r / min 离心 2 min, 弃上清, 最后加入 750 μl PBS 缓冲液,200 mmol / L 3 氰基吡啶 ( 终浓度 50 mmol / L) 250 μl 进行反应,30 下反应 10 min 后, 加入 2 mol / L 盐酸 200 μl 终止反应, 取上清稀释 10 倍后用 HPLC 检测 3 氰基吡啶和烟酸的含量 2 结果与讨论 2 1 发酵培养基的优化 C 源及其质量浓度对产酶的影响以 LB 培养基为起始培养基进行 C 源种类的优化在 LB 培养基中分别添加 5 g / L 葡萄糖甘油蔗糖麦芽糖和可溶性淀粉作为 C 源进行单因素实验, 结果见图 1 由图 1 可知, 以葡萄糖为 C 源, 菌体生长最好, 酶活最大, 因此选择葡萄糖为最佳 C 源进一步设定葡萄糖质量浓度为和 25 g / L 6 个水平, 考察不同葡萄糖质量浓度对菌体和酶活的影响, 结果如图 2 所示由图 2 可知 : 最适宜的葡萄糖质量浓度为 5 g / L 时, 比酶活达到 U / ml, 而继续增加葡萄糖质量浓度至 15 g / L, 菌体生物量增加, 但酶活几乎不变, 而且葡萄糖浓度过高, 会抑制菌体生长和酶的表达从生产成本和酶活角度考虑, 最终将葡萄糖质量浓度选定为 5 g / L 图 2 Fig 图 1 Fig 1 C 源对重组菌生长及产酶的影响 Effects of different carbon sources on 葡萄糖质量浓度对重组菌生长及产酶的影响 Effects of different concentrations of glucose N 源及其质量浓度对产酶的影响通过改变 LB 培养基中不同 N 源来考察对菌体和产酶的影响, 主要比较了不同有机 N 源及无机 N 源对产酶的影响, 结果见表 1 和表 2 表 1 Table 1 有机 N 源有机 N 源对重组菌生长及产酶的影响 Effects of organic nitrogen sources on ρ / ρ(dcw) / 比酶活 / (U ml -1 ) 蛋白胨 ± ±2 01 酵母粉 ± ±1 42 牛肉膏 ± ±2 24 酵母粉 + 蛋白胨 ± ±2 04 牛肉膏 + 蛋白胨 ± ±1 17

4 10 生物加工过程第 12 卷表 2 Table 2 无机 N 源对重组菌生长及产酶的影响 Effects of inorganic nitrogen sources on 无机 N 源 ρ / ρ(dcw) / 比酶活 / (U ml -1 ) NH 4 Cl 2 4 7± ±2 04 (NH ± ±2 25 NH 4 NO ± ±2 15 尿素 2 5 0± ±2 82 由表 1 可知 : 蛋白胨和酵母粉复合 N 源能有效促进酶的表达 ; 进而优化复合 N 源的浓度, 结果见图 3 和图 4 当蛋白胨质量浓度为 15 g / L, 比酶活达到 41 2 U / ml, 当蛋白胨质量浓度继续提高至 20 g / L 时, 菌体生物量仅有微弱的提升, 而酶活无显著变化, 因此最终仍选定蛋白胨质量浓度为 15 g / L 当酵母粉质量浓度为 5 g / L 时, 产酶及比酶活达到最高, 为 U / ml( 图 3 和图 4) 在此基础上考察 (NH 4 NH 4 Cl NH 4 NO 3 和尿素等无机 N 源的影响, 发现再添加 (NH 4 为 5 g / L 时, 菌体比酶活达到 44 7 U / ml( 图 5) 图 4 酵母粉质量浓度对菌体生长和产酶的影响 Fig 4 Effects of different concentrations of yeast extract on E coli growth and nitrilase production 图 5 (NH 4 质量浓度对菌体生长和产酶的影响 Fig 5 Effects of different concentrations of (NH 4 图 3 Fig 3 蛋白胨质量浓度对菌体生长和产酶的影响 Effects of different concentrations of tryptone 磷酸盐添加量的影响磷酸盐是微生物生长和维持渗透压的必需物质, 对重组质粒的稳定性菌体生物量和外源蛋白的表达有影响实验考察了不同浓度磷酸盐对重组菌生长和产酶的影响, 结果见图 6 由图 6 可知, 磷酸盐浓度在 150 mmol / L 时, 酶活达到最高, 进一步增加将不利于菌体生长, 产酶能力相应降低金属离子的影响为考察金属离子对重组菌生长和产酶的影响, Fig 6 图 6 磷酸盐浓度对重组菌生长及产酶的影响 Effects of different concentrations of phosphate 分别在培养基中添加 2 5 mmol / L 金属离子, 结果见图 7 由图 7 可知,Cu 2+ 对菌体生长有一定的抑制作用, 这与 Cu 2+ 对 Rhodococcus rhodochrous J1 生长与产腈水解酶特性基本一致 [16] Mg 2+ 对菌体产酶有一定的促进, 经浓度优化, 得出其适宜的浓度为 4 mmol / L

5 第 5 期熊雷等 : 腈水解酶 psn 基因工程菌的发酵及产酶条件优化 11 图 7 金属离子对重组菌生长及产酶的影响 Fig 7 Effects of different metallic ions on E coli growth and nitrilase production 图 9 Fig 9 诱导剂浓度对重组菌生长及产酶的影响 Effects of concentration of IPTG on E coli growth and nitrilase production 2 2 发酵条件的优化诱导温度的优化温度是影响菌体生长和外源蛋白表达的重要因素, 实验考察不同诱导温度对重组菌生长和产酶的影响 ( 图 8) 由图 8 可知, 在较为广泛的温度范围内 (26 ~ 37 ) 进行诱导, 均可以获得 4 0 g / L 以上的菌体量和较好的产酶水平, 其中以 30 相对较优图 10 Fig 10 诱导时间对重组菌生长及产酶的影响 Effects of time of adding IPTG on E coli growth and nitrilase production 图 8 诱导温度对重组菌生长及产酶的影响 Fig 8 Effects of temperature on E coli growth and nitrilase production 诱导剂浓度和诱导时间对菌体和产酶的影响采用 IPTG 作为诱导剂, 考察不同添加浓度和不同诱导时机对菌体生长和产酶的影响, 结果见图 9 由图 9 可知, 对本工程菌而言, 诱导剂浓度对菌体生长没有太大影响, 其中 IPTG 在 0 2 mmol / L 时酶活相对较高诱导时间对酶活和菌体生长的影响较大, 在接种后 2 5 h 时诱导, 菌浓和比酶活都达到最大值, 分别为 5 14 g / L 和 U / ml( 图 10) L 发酵罐培养过程研究基于摇瓶培养条件, 开展 5 L 罐上的发酵研究, 分析培养过程的菌体浓度残糖 ph 和酶活等参数, 为小罐发酵的优化提供思路, 图 11 为未进行流加控制的重组菌发酵过程由图 11 可知 : 随着葡萄糖的消耗, 发酵液 ph 从 7 4 开始逐步下降, 至 8 h 葡萄糖利用完全时,pH 降至 6 75, 之后有所回升 ( 图 11 (a)) 而采用 NH 3 H 2 O 流加控制 ph 后, 菌体浓度有所提高, 菌体量达到 5 69 g / L( 图 11(b)) 发酵 8 h 后, 葡萄糖大幅度消耗, 菌体生长减缓 ( 图 11(a) 和图 11(b)), 因此, 考虑补充营养物质来提高菌体浓度首先考察葡萄糖的流加, 从发酵 6 h 开始补料, 分别补加葡萄糖终质量浓度为 1 和 2 g / L ( 图 12 (a) 和图 12(b)), 发现补糖 1 g / L 时, 菌体量可以达到 8 29 g DCW/ L, 比酶活达到 U / ml; 补糖 2 g / L 时, 菌体量可达到 g DCW/ L, 比酶活达到 U / ml 考虑不同 C N 比对菌体生长和产酶的影响, 即

6 12 生物加工过程第 12 卷菌体浓度在 6 ~ 10 h 内快速增长, 至 14 h 仍呈增长趋势, 最终可达 g / L, 且比酶活提高到 U / ml( 图 13 (b)) 图 11 5 L 发酵罐上重组菌的发酵曲线 Fig 11 Fermentation curve of E coli in 5 L fermentor 图 13 补加 N 源策略对菌体生长和产酶的影响 Fig 13 Effects of feeding strategy of nitrogen source 2 3 SDS PAGE 对腈水解酶表达量的分析为比较不同发酵条件下腈水解酶的表达量, 采用 SDS PAGE 对菌体全细胞蛋白进行分析, 结果见图 14 由图 14 可知 : 优化后腈水解酶的表达量显著提升图 12 葡萄糖补加策略对菌体生长和产酶的影响 Fig 12 Effects of feeding strategy of glucose on 在补加 C 源的同时补加不同浓度的 N 源 ; 方案 1 采用 N 源补料培养基 Ⅰ, 发现菌浓和酶活都有所提高 ( 图 13 (a)); 方案 2 采用 N 源补料培养基 Ⅱ, 发现 M 标准蛋白 ;1 诱导前的菌体 ; 2 优化的 LB 培养菌体 ;3 培养基优化后菌体 ; 4 5 L 发酵罐补料优化后菌体图 14 发酵优化后菌体 SDS PAGE 电泳图 Fig 14 SDS PAGE analysis of cells growth under different fermentation conditions

7 第 5 期熊雷等 : 腈水解酶 psn 基因工程菌的发酵及产酶条件优化 13 3 结论对腈水解酶的基因工程大肠杆菌培养基组分进行研究, 考察了 C N 源磷酸盐和金属离子对重组大肠杆菌生长和产酶的影响, 确定了最佳培养基成分, 经过浓度优化, 得到培养基组分 ( g / L): 葡萄糖 5 蛋白胨 15 酵母粉 5 ( NH 4 5 K 2 H 24 5 KH 和 Mg 0 48 在此条件下在 30 培养 2 5 h 后添加终浓度 0 2 mmol / L 的 IPTG 进行诱导, 发现比酶活从初始的 U / ml 提高到 U / ml 随后在 5 L 发酵罐进行控制 ph 和进行流加策略的优化, 得到最终的产酶水平为 U / ml, 相比优化前提高了 3 74 倍, 亦为工业上开展烟酸的生物转化奠定了良好的技术基础参考文献 : [ 1 ] Davis B G,Borer V.Biocatalysis and enzymes in organic synthesis [ J].Nat Prod Rep,2001,18(6): [ 2 ] Gong J S,Lu Z M,Li H,et al. Nitrilases in nitrile biocatalysis: recent progress and forthcoming research [ J]. Micro Cell Fact, 2012,11(1):1 18. [ 3 ] Singh R,Sharma R,Tewari N,et al.nitrilase and its application as a " green " catalyst [ J ]. Chem Biodivers, 2006, 3 ( 12 ): [ 4 ] 徐建妙, 郑裕国, 沈寅初. 腈水解酶的来源, 结构, 作用机制及其应用 [J]. 微生物学通报,2005,32(5): [ 5 ] Thimann K V,Mahadevan S.Nitrilase:I.Occurrence,preparation, and general properties of the enzyme[ J].Arch Biochem Biophys, 1964,105(1): [ 6 ] Andexer J N,Langermann J V,Kragl U,et al. How to overcome limitations in biotechnological processes examples from hydroxynitrile lyase applications[ J]. Trends Biotechnol,2009,27 (10): [ 7 ] 李艳云, 尹振晏, 宫彩红. 烟酸的研究进展 [ J]. 北京石油化工学院学报,2006,14(1): [ 8 ] 李钟玉, 李临生. 烟酸, 烟酰胺的研究进展 [ J]. 化工时刊, 2003,17(2):6 9. [ 9 ] 崔英德, 黎新明. 烟酸的应用与生产方法 [J]. 广州化工,2000, 28(4): [10] Sharma N N, Sharma M, Bhalla T C. An improved nitrilase mediated bioprocess for synthesis of nicotinic acid from 3 cyanopyridine with hyperinduced Nocardia globerula NHB 2[ J].J Ind Microbiol Biotechnol,2011,38(9): [11] Sharma N N,Sharma M,Kumar H,et al.nocardia globerula NHB 2:bench scale production of nicotinic acid[ J].Process Biochem, 2006,41(9): [12] Prasad S, Misra A, Jangir V P, et al. A propionitrile induced nitrilase of rhodococcus sp. Ndb 1165 and its application in nicotinic acid synthesis[ J].World J Microbiol Biotechnol,2007, 23(3): [13] 朱小燕, 龚劲松, 李恒, 等. 产芳香腈水解酶的恶臭假单胞菌 Pseudomonas putida CGMCC3830 的筛选鉴定及发酵优化 [J]. 生物工程学报,2014,30(3): [14] Zhu X Y,Gong J S,Li H,et al. Characterization and functional cloning of an aromatic nitrilase from Pseudomonas putida CGMCC3830 with high conversion efficiency toward cyanopyridine[ J].J Mol Catal B:Enzym,2013,97: [15] Veit A,Polen T,Wendisch V F.Global gene expression analysis of glucose overflow metabolism in Escherichia coli and reduction of aerobic acetate formation[ J].Appl Microbiol Biotechnol,2007,74 (2): [16] Nagasawa T, Kobayashi M, Yamada H. Optimum culture conditions for the production of benzonitrilase by Rrhodococcus rhodochrous j1[ J].Arch Microbiol,1988,150(1): ( 责任编辑周晓薇 )

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析第卷第期年月食品与生物技术学报响应面优化绿色木霉菌培养基黄雪莲于新仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州利用响应面分析法对绿色木霉菌的培养基进行优化通过测量不同营养条件下绿色木霉菌落生长直径研究其生物学特性在单因素实验的基础上选定葡萄糖添加量丙氨酸添加量和磷酸二氢钾添加量个因素进行中心组合实验建立二次回归方程并应用响应面分析法进行优化结果表明绿色木霉菌最佳培养基为葡萄糖