基于LY培养基的籼稻成熟胚愈伤组织培养和农杆菌转化说明书

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1 基 于 LY 培 养 基 的 籼 稻 组 织 培 养 和 农 杆 菌 转 化 说 明 书 武 汉 大 学 植 物 发 育 遗 传 教 育 部 重 点 实 验 室 试 剂 盒 内 容 : LY- 培 养 基 ( 固 体 ): 一 瓶, 供 配 制 10L 用 500 LY-addition:20ml, 供 配 制 10L 用 LY-A:500ul ( 用 于 诱 导, 如 果 有 晶 体 析 出,70 水 浴 加 热 溶 解 即 可 ) LY-B:800ul ( 用 于 继 代, 预 培 养, 共 培 养, 筛 选 ) LY-C:400ul ( 用 于 预 分 化, 如 果 有 晶 体 析 出,70 水 浴 加 热 溶 解 即 可 ) LY-D:2000ul( 用 于 分 化, 如 果 有 晶 体 析 出,70 水 浴 加 热 溶 解 即 可 ) 李 阳 mail: 使 用 前 将 LY 培 养 基 溶 于 约 900ml 蒸 馏 水, 加 入 20ml LY- addition 定 容 致 1L 配 成 10 LY 培 养 基 母 液 4 保 存 ( 如 果 较 长 时 间 才 能 用 完, 建 议 先 不 要 把 20ml LY- addition 混 合, 避 免 细 菌 生 长, 在 配 置 培 养 基 时 每 升 加 入 2ML) 需 要 您 自 己 准 备 的 还 有 : 真 核 抗 生 素, 原 核 抗 生 素, 乙 酰 丁 香 酮,MS 铁 盐 蔗 糖, 酸 水 解 酪 蛋 白, 谷 氨 酰 胺, 脯 氨 酸, 琼 脂 粉 ( 本 说 明 书 所 用 琼 脂 粉 凝 胶 强 度 约 1300g/cm 2, 购 于 日 本 BioSharp 公 司 如 果 您 的 琼 脂 粉 硬 度 指 标 不 同 根 据 情 况 自 行 增 减 ) 以 及 phytagel (10L 10 ) 含 所 有 大 量 成 分, 锰, 脯 氨 酸 Ly-minorgan: 小 量 和 有 机 混 合 物 500* 配 制 1l,ly-min 1000*: Znso4*7h2o8 /Hbo312/kI3/cuso4*5h2o100/namoo4*2h2o1/cocl2100/ ph4.0 Ly-organ1000* Glycine2/thiamine1/pyridoxine.5/Nicotinic.5 将 以 上 两 者 混 合 ph 5.4 即 可 Ly-A: 诱 导 激 素 : 1: 12mg/ml, 2: 1mg/ml( 诱 导 ); Ly-PRE: 1: 10 mg/ml,2,1mg/ml; LY-B: 继 代 激 素 : 1: 7mg/ml ->10mg/L ( 平 板 :150; 继 代 100); (LY-B: 后 15mg/ml 均 用 100) LY-C: 1: 7mg/ml, 2: 1mg/ml; LY-C new :sele2 激 素 : 1: 12mg/ml 2: 5mg/ml; 每 升 100ul LY-D: 分 化 激 素 4mg/ml,4mg/ml;0.4mg/ml,0.4mg/ml. 电 话 : ; 网 址 : 邮 箱 :yewyli@163.com 未 经 授 权 请 勿 转 用 1

2 籼 稻 转 基 因 操 作 步 骤 诱 导 : 诱 导 培 养 基 : 1, 1L 诱 导 培 养 基 配 制 ( 根 据 需 要 等 比 例 缩 放 ): 在 1 升 的 烧 杯 中 加 入 800ml 双 蒸 水, 称 取 2.5g Phytagel 微 波 炉 加 热 全 部 溶 化 将 100ml 10 LY( 如 果 预 先 没 有 进 行 LY-Addition 混 合, 每 升 加 入 2ml LY-Addition),10ml 100 铁 盐 [1] 800mg 酸 水 解 酪 蛋 白,500mg 谷 氨 酰 胺, 500mg 脯 氨 酸 ;30g 蔗 糖 加 入 到 phytegel 溶 液 中 加 入 ly-a:100ul, 双 蒸 水 定 容 到 1 升 1N 氢 氧 化 钾 调 ph 值 :5.8 2, 50ml/ 瓶 分 装 到 100ml 容 积 的 三 角 瓶 中, 用 组 培 封 口 膜 封 口 后 115 灭 菌 15 分 钟 冷 凝 后 即 可 用 成 熟 胚 诱 导 ( 选 用 当 年 新 染 提 高 发 芽 率 和 诱 导 率 ) 成 熟 水 稻 胚 去 颖 壳 之 后, 75% 酒 精 浸 泡 1.0min;2,0.15% 的 HgCl2 浸 泡 10 分 钟 3, 用 灭 菌 水 洗 4 遍, 每 次 1 分 钟 ; 用 灭 菌 水 浸 泡 5 分 钟 ; 再 用 灭 菌 水 清 洗 一 次 接 种 到 诱 导 培 养 基 上, 每 瓶 5 颗 为 保 证 诱 导 率 接 种 时 最 好 保 持 种 子 发 芽 方 向 与 培 养 基 平 行 或 者 稍 微 向 下, 不 要 让 发 芽 方 向 向 上 或 者 垂 直 向 下 放 置 33, 湿 度 约 50% 的 环 境 下 暗 培 养, 诱 导 天 直 到 出 现 明 显 松 散 的 愈 伤 组 织, 进 行 继 代 或 者 进 行 预 培 养 转 化 继 代 : 1, 三 角 瓶 培 养 方 案 : 1L 继 代 培 养 基 配 制 : 在 1 升 的 烧 杯 中 加 入 800ml 双 蒸 水, 称 取 2.5g Phytagel 微 波 炉 加 热 致 全 部 融 化 将 100mL 10 LY( 如 果 预 先 没 有 进 行 LY-Addition 混 合, 每 升 加 入 2ml LY-Addition),10ml 100 铁 盐, 800mg 酸 水 解 酪 蛋 白,500mg 谷 氨 酰 胺,500mg 脯 氨 酸 ;30g 蔗 糖, 100ul LY-B 加 入 到 准 备 好 的 phytegel 溶 液 中, 双 蒸 水 定 容 到 1 升,1N KOH 调 ph 值 到 5.8 将 培 养 基 50ml/ 瓶 分 装 到 100ml 容 积 的 三 角 瓶 中, 用 组 培 封 口 膜 封 口 后 115 灭 菌 15 分 钟 ( 注 : 继 代 培 基 养 灭 菌 后 在 组 培 室 [30-34 ] 的 环 境 中 放 置 5 天 后, 表 面 干 燥 后 使 用 ) 挑 取 生 长 旺 盛, 质 地 坚 硬, 色 泽 嫩 黄, 颗 粒 直 径 3mm 左 右 的 愈 伤 组 织 进 行 继 代, 每 100ml 三 角 瓶 接 种 0.3g 左 右 ( 直 径 3mm 左 右 的 愈 伤 组 织 6-7 颗 ),30 生 长 天 2, 培 养 皿 培 养 方 案 : 1L 继 代 培 养 基 配 制 : 在 1 升 的 烧 杯 中 加 入 800ml 双 蒸 水, 将 100mL 10 LY( 如 果 预 先 没 有 进 行 LY-Addition 混 合, 每 升 加 入 2ml LY-Addition),10ml 100 铁 盐, 800mg 酸 水 解 酪 蛋 白, 500mg 谷 氨 酰 胺,500mg 脯 氨 酸 ;30g 蔗 糖 ;100ul LY-B; 双 蒸 水 定 容 到 1 升 ;1N KOH 调 ph 值 : 5.8, 加 入 7g 琼 脂 粉 115 灭 菌 15 分 钟 冷 却 到 60 左 右,25ml/9cm 平 皿, 开 盖 超 净 台 晾 置 30min 即 可 用 于 继 代, 继 代 时, 每 皿 放 置 10 颗 愈 伤 组 织 继 代 条 件 放 置 30, 暗 培 养 ; 如 果 发 现 愈 伤 组 织 变 软 严 重, 推 荐 放 在 光 下 继 代 继 代 时 长 天 ( 根 据 愈 伤 组 织 生 长 多 少, 决 定 下 次 继 代 时 间 ) 注 : 如 果 在 平 皿 培 养 过 程 中 发 现 盖 子 上 有 较 多 的 水 是 不 适 宜 的, 可 能 造 成 培 养 失 败, 原 因 是 培 养 皿 底 部 被 加 热, 盖 温 低 于 培 养 基 温 度 造 成 水 蒸 气 在 培 养 皿 盖 凝 结. 预 培 养 : 1, 1 升 培 养 基 配 制 ( 根 据 需 要 等 比 例 缩 放 ): 在 一 个 1L 的 可 灭 菌 瓶 中 加 入 800ml 双 蒸 水,100ml 10 LY( 如 果 预 先 没 有 进 行 LY-Addition 混 合, 每 升 加 入 1ml LY-Addition);10ml 100 铁 盐 ;800mg 酸 水 解 酪 蛋 白 ;500mg 谷 氨 酰 胺 ;20g 蔗 糖 +10g 葡 萄 糖,500mg 脯 氨 酸 ;LY-B: 100ul; 双 蒸 水 定 容 到 1 升 调 ph 值 : 5.2, 加 入 7g 琼 脂 粉 电 话 : ; 网 址 : 邮 箱 :yewyli@163.com 未 经 授 权 请 勿 转 用 2

3 2, 115 灭 菌 15 分 钟 冷 却 到 50 左 右 加 入 终 浓 度 100umol 的 乙 酰 丁 香 酮 [2] ; 倒 平 皿 25ml/9cm 平 皿 超 净 台 开 盖 晾 置 30min-60min 预 培 养 操 作 : 将 生 长 良 好 的 愈 伤 组 织 块 接 种 于 预 培 养 培 养 基 上 块 /9cm 平 皿, 愈 伤 组 织 颗 粒 不 易 太 大 3mm 左 右,30 暗 培 养 生 长 3-4 天 此 时 愈 伤 组 织 状 态 应 该 是 色 泽 黄 而 且 致 密 农 杆 菌 准 备 : 于 预 培 养 同 一 天 将 转 化 好 的 农 杆 菌 菌 液 在 相 应 抗 性 的 平 板 上 划 线, 30 度 生 长 小 时 再 进 行 一 次 划 线, 生 长 小 时 后 可 以 进 行 转 基 因 操 作 悬 浮 培 养 基 : 1, 每 一 升 悬 浮 培 养 基 配 制 方 法 ( 根 据 需 要 等 比 例 缩 放 ): 在 一 个 1L 的 可 灭 菌 瓶 中 加 入 800ml 双 蒸 水 加 入 50ml 10 LY( 如 果 预 先 没 有 进 行 LY-Addition 混 合, 每 升 加 入 2ml LY-Addition); 10ml 100 铁 盐 ; 800mg 酸 水 解 酪 蛋 白 ;500mg 谷 氨 酰 胺 ;500mg 脯 氨 酸 ;20g 蔗 糖,10g 葡 萄 糖 ;100ul LY-B; 双 蒸 水 定 容 到 1 升,pH 值 :5.2 2, 110 灭 菌 15 分 钟 灭 好 菌 后 4 可 长 期 放 置 使 用 时 加 入 终 浓 度 100uM 的 乙 酰 丁 香 酮 [2] 悬 浮 侵 染 操 作 : 将 生 长 好 的 农 杆 菌 平 板 上 的 农 杆 菌 刮 到 农 杆 菌 悬 浮 培 养 基 里,30 震 荡,OD 值 在 0.2 左 右 的 范 围 内 即 可 转 基 因 侵 染 将 预 培 养 的 愈 伤 组 织 转 移 到 悬 浮 的 菌 液 中, 室 温 浸 泡 20-30min 共 培 养 : 同 预 培 养 培 养 基 共 培 养 操 作 : 将 菌 液 到 掉, 沥 干 农 杆 菌 菌 液, 将 愈 组 织 伤 放 置 在 灭 菌 后 风 干 的 多 层 (8-10 层 ) 滤 纸 上, 尽 量 浸 干 农 杆 菌 菌 液, 超 净 台 晾 干 20-30min, 以 免 共 培 养 的 时 候 农 杆 菌 生 长 过 多, 对 愈 伤 组 织 损 害 过 度 然 后 将 滤 纸 上 的 愈 伤 组 织 颗 粒 挑 到 共 培 养 培 养 基 上, 每 皿 50 颗 左 右, 暗 培 养 小 时 左 右 共 培 养 要 跟 踪 观 察, 如 果 见 农 杆 菌 出 现 明 显, 表 示 浸 染 过 度, 后 续 筛 选 容 易 长 菌 筛 选 筛 选 培 养 基 ( 以 潮 霉 素 作 为 真 核 抗 性 为 例 ): 1, 每 一 升 配 制 方 法 ( 根 据 需 要 等 比 例 缩 放 ): 在 一 个 1L 的 可 灭 菌 瓶 中 加 入 800ml 双 蒸 水,100ml 10 LY( 如 果 预 先 没 有 进 行 LY-Addition 混 合, 每 升 加 入 2ml LY-Addition);10ml 100 铁 盐 ;800mg 酸 水 解 酪 蛋 白 ;500mg 谷 氨 酰 胺 ;30g 蔗 糖 ;100ul LY-B; 双 蒸 水 定 容 到 1 升,1N 氢 氧 化 钾 调 ph 值 : 5.8; 加 入 8g 琼 脂 粉 2,115 灭 菌 15 分 钟 冷 却 到 50 左 右 加 入 40mg/L 终 浓 度 的 潮 霉 素,500mg/L 终 浓 度 的 头 孢, 倒 平 板 25ml/9cm 平 板 超 净 台 开 盖 吹 晾 2 小 时 ( 筛 选 培 养 基 最 好 现 配, 因 为 头 孢 容 易 失 效 造 成 农 杆 菌 生 长 除 了 潮 霉 素 G418, 草 丁 膦 也 是 常 用 的 转 基 因 筛 选 试 剂, 推 荐 浓 度 分 别 为 : 50mg/L,30mg/L ) 筛 选 操 作 : 将 共 培 养 的 愈 伤 组 织 放 入 灭 菌 三 角 瓶 中 用 无 菌 水 洗 涤, 当 完 全 洗 液 清 澈 即 可 然 后 将 愈 伤 组 织 放 置 在 灭 菌 滤 纸 上 吹 晾, 筛 选 平 板 上 的 愈 伤 组 织 均 匀 的 放 在 筛 选 培 养 基 上 颗 / 皿 30 暗 培 养, 发 现 有 霉 菌 或 农 杆 菌 生 长 及 时 将 未 长 菌 的 愈 伤 组 织 转 到 新 的 筛 选 平 板 上 筛 选 30 天 左 右 新 的 愈 伤 组 织 长 出 后, 转 移 到 新 的 筛 选 平 皿 上 再 筛 选 7-10 天, 如 果 明 显 生 长, 则 为 阳 性 愈 伤 组 织, 如 果 不 生 长 即 使 不 出 现 变 褐 死 亡 现 象 也 可 能 为 假 阳 性 电 话 : ; 网 址 : 邮 箱 :yewyli@163.com 未 经 授 权 请 勿 转 用 3

4 预 分 化 ( 针 对 籼 稻 中 分 化 容 易 出 现 褐 化 现 象, 如 果 该 品 种 分 化 无 褐 化, 此 步 骤 作 为 第 二 次 筛 选 用 LY-B 代 替 LY-C 直 接 分 化 ) 1, 预 分 化 培 养 基 : 每 一 升 配 制 方 法 ( 根 据 需 要 等 比 例 缩 放 ): 在 一 个 1L 的 可 灭 菌 瓶 中 加 入 800ml 双 蒸 水, 100ml 10 LY( 如 果 预 先 没 有 进 行 LY-Addition 混 合, 每 升 加 入 2ml LY-Addition);10ml 100 铁 盐 ; 800mg 酸 水 解 酪 蛋 白 ;500mg 谷 氨 酰 胺, 500mg 脯 氨 酸 ;30g 蔗 糖 ;100ul LY-C; 双 蒸 水 定 容 到 1 升 1N 氢 氧 化 钾 调 ph 值 :5.8, 加 入 8g 琼 脂 粉 115 灭 菌 15 分 钟 冷 却 到 50 左 右 加 入 50mg/L 终 浓 度 的 潮 霉 素, 倒 平 板,25ml/9cm 平 皿 超 净 台 晾 干 30-60min 将 第 二 次 筛 选 出 的 阳 性 愈 伤 组 织 部 分 转 移 到 预 分 化 培 养 基 上 每 皿 个 克 隆 30 连 续 光 照 培 养 3-4 天, 再 接 种 到 分 化 培 养 基 上 进 行 分 化 分 化 培 养 基 : 1,1L 培 养 基 配 制 ( 根 据 需 要 等 比 例 缩 放 ): 在 1 升 的 烧 杯 中 加 入 800ml 双 蒸 水, 称 取 3g Phytagel 微 波 炉 加 热 致 全 部 融 化 将 100mL 10 LY( 如 果 预 先 没 有 进 行 LY-Addition 混 合, 每 升 加 入 2ml LY-Addition),10ml 100 铁 盐, 800mg 酸 水 解 酪 蛋 白,500mg 谷 氨 酰 胺 ;30g 蔗 糖 加 入 到 步 骤 1 得 到 的 phytegel 溶 液 中 加 入 ly-d:500ul, 双 蒸 水 定 容 到 1 升 Ph 值 : 5.8 2, 50ml/ 瓶 分 装 到 100ml 容 积 的 三 角 瓶 中, 用 组 培 封 口 膜 封 口 后 110 灭 菌 15 分 钟 分 化 操 作 : 将 第 二 次 筛 选 或 者 预 分 化 处 理 的 生 长 旺 盛, 颗 粒 状, 黄 色 的 愈 伤 组 织 颗 粒 ( 保 证 用 于 分 化 的 愈 伤 组 织 是 没 有 瑕 疵 的 ) 放 置 到 分 化 培 养 基 上, 每 瓶 放 置 2-3 个 阳 性 克 隆, 每 个 克 隆 放 置 少 量 的 愈 伤 组 织 即 可, 放 置 的 愈 伤 组 织 要 质 量 高, 而 不 在 乎 数 量 多 27 连 续 光 照 分 化 天 长 出 绿 叶 后 就 可 以 进 行 生 根 生 根 生 根 培 养 基 : 1,1L 培 养 基 配 制 ( 根 据 需 要 等 比 例 缩 放 ): 在 1 升 的 烧 杯 中 加 入 800ml 双 蒸 水, 称 取 2.5g Phytagel 微 波 炉 加 热 致 全 部 融 化 将 50ml ( 如 果 预 先 没 有 进 行 LY-Addition 混 合, 每 升 加 入 1ml LY-Addition),10ml 100 铁 盐, 800mg 酸 水 解 酪 蛋 白,500mg 谷 氨 酰 胺 ;30g 蔗 糖 加 入 到 步 骤 1 得 到 的 phytegel 溶 液 中 双 蒸 水 定 容 到 1 升 Ph 值 : , 培 养 基 30ml 每 瓶 分 装 到 50ml 容 积 三 角 瓶 或 50ml/ 瓶 分 装 到 100ml 容 积 的 三 角 瓶 中, 用 组 培 封 口 膜 封 口 后 115 灭 菌 15 分 钟 冷 凝 后 即 可 用 生 根 操 作 : 将 每 个 克 隆 分 化 出 的 健 壮 苗 每 瓶 放 置 2-3 棵 苗 光 照 培 养,7-10 天 后 打 开 封 口 膜 加 入 适 量 的 无 菌 水 2-3 天 后 移 栽 注 : [1]1 升 100* 铁 盐 配 制 方 法 : 称 取 FeSO4*7H2O 2.79g 完 全 溶 解 于 1 升 蒸 馏 水 后, 加 入 Na2EDTA 3.7g 至 完 全 溶 解,4 保 存 [2] 乙 酰 丁 香 酮 100mM 配 制 方 法 : 0.2g 乙 酰 丁 香 酮 溶 于 10ml DMSO 中,1ml/ 管 分 装,-20 冻 存 在 组 培 过 各 阶 段 遇 到 问 题 时 请 及 时 向 我 们 反 映 情 况 通 过 邮 箱 或 qq, @qq.com 电 话 : ; 网 址 : 邮 箱 :yewyli@163.com 未 经 授 权 请 勿 转 用 4

5 Attachment: Table 1.The Culture mediums for the whole transformation process in indica rice. Induction Sub-culture Pre/Co-culture Suspension Selection Rre-regeneration Regeneration(RG) Rooting(RT) 10*LY 100ml 100ml 100ml 50ml 100ml 100ml 100ml 50ml 500*LY-Addition 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 100*Fe-EDTANa2 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml Sucrose 30g 30g 20g 20g 30g 30g 30g 20g Glucose 10g 10g Casein(Acid Hydrolysates) 800mg 800mg 800mg 800mg 800mg 800mg 800mg 800mg Proline 500mg 500mg 500mg 500mg 500mg 500mg 500mg 500mg glutamine 500mg 500mg 500mg 500mg 500mg 500mg 500mg 500mg LY-A 100ul LY-B 100ul 100ul 100ul 100ul LY-C 100ul LY-D 500ul ph Agar(in dish) 7g 7g 8g 8g Phytagel(in flask) 2.5g 2.5g 2.5g Sterilization min min min min min min min min Cefotaxime 500mg Hygromycin B 40mg 50mg Acetosyringone(AS) 100umol 100umol Dry 0-30min 0-30min 30-60min min 30-60min Temperature /25 About Light Y Y Y N Y Y Y Y Time-consuming(110D) days 15days*N (N=0,1,2,3) 4/3 days 15-20min 30days 4 days (optional) 15days 10days 电 话 : ; 网 址 : 邮 箱 :yewyli@163.com 未 经 授 权 请 勿 转 用 5

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