國立中山大學學位論文典藏.PDF
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- 翼坑 鲍
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1 PTEN 9 PTEN cdna Gelatin zymorgraphy 15 -chemotaxis assay
2 18 18 SK-Hep1 PTEN 19 SK-Hep1 19 Western blot PTEN SK-Hep1 19 PTEN SK-Hep1 20 PTEN SK-Hep1 20 PTEN SK-Hep1 21 PTEN SK-Hep1 MMP9 21 PTEN MAPK/Erk PTEN 34 2 PTEN 35 3 PTEN 36 4 PTEN p PTEN 38 6 PTEN 39 7 SK-Hep1 cdna 40 2
3 8 SK-Hep Western blot PTEN SK-Hep Western blot Akt-p/Akt PTEN SK-Hep PTEN SK-Hep Western blot FAK-p/FAK PTEN SK-Hep PTEN SK-Hep Western blot MAPK Western blot Erk Mahlavu and SK-Hep1 Akt Akt-p PTEN 51 3
4 hepatocellular carcinoma HCC PTEN MMAC TEP1 10q23 PTEN 403 PTEN 40% PTEN PTEN Mahlavu PTEN PTEN in vitro in vivo PTEN Mahlavu PTEN PTEN PTEN SK-Hep1 PTEN SK-Hep1 multiplicity of infection 50~100 M.O.I SK-Hep1 PTEN PTEN PTEN SK-Hep1 Akt-p SK-Hep1 ~20% PTEN SK-Hep1 4
5 PTEN FAK PTEN SK-Hep1 PTEN SK-Hep1 MMP( matrix metallo-proteinase ) in vitro PTEN PTEN PTEN 5
6 Keywords hepatocellular carcinoma HCC PTEN cell motility tumorigenicity ABSTRACT Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most prevalent cancers worldwide. Hepatocarcinogenesis is considered a multifactorial and mulitstep process that involves the activation of oncogenes or the inactivation of tumor suppressor genes. Tumor suppressor gene PTEN (also known as MMAC or TEP1) is located on human chromosome 10q23. The 403 amino acid PTEN protein encodes dual specificity protein phosphatases. Mutation of the PTEN is a common event in advanced stage of diverse human cancers. In our previous studies, immunohistochemical analysis indicated that reduced PTEN expression was found in nearly 40% of HCC specimens. Furthermore, restored PTEN expression by adenovirus gene delivery effectively inhibited the in vitro and in vivo tumorigenicity of Mahlavu cells, a human HCC cell line with PTEN inactivation. In the present study, we further characterize whether PTEN gene delivery still suppressed the oncogenic potential in HCC cell lines with functional PTEN. By expression and sequencing analysis, we identified human SK-Hep-1 cells as the hepatoma cell line with functional PTEN expression. The optimal condition for adenovirus 6
7 vector to infect SK-Hep-1 cells was determined at the multiplicity of infection (MOI) of Tough SK-Hep-1 cells were effectively transduced with exogenous PTEN gene, the enhanced PTEN expression by adenovirus gene delivery did not alter the phosphoryation extent of Akt in SK-Hep1 cells. Nevertheless, PTEN gene delivery reduced the proliferation of SK-Hep-1 cells by ~20%. In addition, the motility of PTEN-transduced SK-Hep-1 cells significantly decreased comparing to cells of control groups. Western blot analysis suggested the decreased cell motility might be attributed to the reduced phosphorylation of focal adhesion kinase (FAK) by PTEN gene delivery. Above all, PTEN gene delivery profoundly reduced the colony formation of SK-Hep-1 cells in soft-agar. However, PTEN gene delivery did not affect the secretion of matrix metallo-proteinases (MMPs) release. Animal studies will be carried out in the future to validate the present in vitro findings. In summary, PTEN gene delivery holds promise for treatment of HCC even when the hepatoma cells possess functional PTEN gene. 7
8 hepatocellular carcinoma 25 1~3 20~70 B C PTEN 8
9 Hu et al.,2003 PTEN 9
10 PTEN PTEN FP P53 Hu Tsung-Hui et al., PTEN Hep G2 Hep 3B Mahlavu J5 SK-Hep1 2 RNA genomic DNA 3 PTEN 4 RT-PCR PTEN 5 PCR PTEN 5 Mahlavu PTEN DNA RNA protein 10
11 Mahlavu Mahlavu cells PTEN Pre-treatment program PTEN Post-treatment program PTEN 1 Mahlavu PTEN PKB/Akt 2 Mahlavu PTEN proliferation migration colony forming 3 Mahlavu PTEN S-G2/M phase 4 Ad-PTEN 5 Ad-PTEN 6 Ad-PTEN SK-Hep1 Mahlavu PTEN DNA RNA protein PTEN PTEN 11
12 1 BLAST PTEN mrna 3 SK-Hep1 cdna PCR 2 GFP Ad-GFP PTEN Ad-PTEN SK-hep1 in vitro 6 proliferation assay migration assay colony formation assay matrix metallo-proteinase assay Western blot SK-Hep1 Ad-PTEN FAK(Focal adhesion kinase) MAPK(mitogen activated protein kinase) 12
13 SK-Hep1 Cell Line Sk-Hep1 ascites from Chinese HBV + 10 fetal calf serum FCS 2 mm glutamine 100 mg/ml streptomycin 100 U/ml penicillin DMEM medium cdna 1. cdna SK-Hep1 total RNA 5-10 ug RT-PCR kit RT-PCR Gibco BRL cdna 2.RT-PCR PTEN NCBI The National Center for Biotechnology Information PTEN mrna 3 primer sense primer reverse Human PTEN 5 5 ATG ACA GCC ATC ATC 3 Human PTEN 3 5 ACA CCA GTT CGT CCC TTT CCA 3 PTEN GCA ATT CAC TGT AAA GCT GGA 3 PTEN GTA TTT ACC CAA AAG TGA AAC ATT TTG 13
14 TCC 3 PTEN GGA CAA AAT GTT TCA CTT TTG GGT AAA TAC 3 PTEN TCA GAC TTT TGT AAT TTG TGT ATG CTG ATC 3 RT-PCR cdna PCR PCR 1.2% ethidium bromide PCR ABI PRISM BigDye TM Terminator Cycle Sequencing Kit V2.0 PCR DNA cycle sequencing ABI PRISM 377 DNA Sequencer NCBI The National Center for Biotechnology Information cdna 1X PBS 1X trypsin-edta ~2 trypsinization DMEM 14
15 trypsin-edta ul 0.04% trypan blue 2000 rpm 3-5 trypan blue 4 /4 X X 10 4 X Gelatin zymography MMP-2 MMP-9 SDS polyacrylamide gel electrophoresis 6 well plate dish SK-Hep1 cells 80% PBS serum-free medium Ad-GFP Ad-PTEN MOI conditioned medium CM 10 PAGE 0.1% wt/vol type A gelatin 20 l CM gelatin PAGE wash buffer wash 1 reaction buffer stain solution 1 gel band 15
16 - chemotaxis assay 6 well plate SK-Hep1 5x10 5 / well PBS serum-free medium Ad-GFP Ad-PTEN MOI serum 48 PBS 1 1X trypsin-edta Boyden chambers Neuro Probe MD U.S.A chamber DMEM medium 30ul polycarbonate filter 8 um pore size chamber chamber 50 l 2.5x10 5 /ml fillter methanol 10 10% Giemsa 1 cell pellet PBS Lysis buffer Coomassie Plus Protein Assay Reagent Bradford method ELISA reader Anthors nm 16
17 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel electrophoresis) Molecular Cloning resolution gel stacking gel resolution gel comb stacking gel stacking gel comb 1X SDS 5 x gel-loading buffer 95 5 ul protein mark Bio-Rad 80mV tracking dye coomassie blue staining solution 3~4 destain buffer 4~8 crystal violet 96 Sk-Hep1 5x10 3 Ad-GFP Ad-PTEN MOI
18 30 ul 0.05% ELISA reader Anthos nm ( ) 100 SK-Hep1 Ad-GFP Ad-PTEN M.O.I /ml 6 plate 2 DMEM media 0.5 agarose 0.5 agarose serum DMEM media CO2 3~4 PVDF polyvinylidene difluoride SDS-PAGE gel PVDF PVDF ECL Plus 18
19 PVDF stripping buffer TBST buffer 19
20 SK-Hep1 PTEN SK-Hep1 PTEN NCBI The National Center for Biotechnology Information BLAST 7 PTEN ~3% Yao et al.,1999 SK-Hep1 PTEN M.O.I Ad-GFP SK-Hep1 Hoechst DNA M.O.I Western blot PTEN SK-Hep1 20
21 Akt insulin SK-Hep1 Akt Ad-GFP Ad-PTEN Akt-p Ad-GFP Ad-PTEN SK-Hep1 insulin Akt Sk-Hep1 Ad-GFP Ad-PTEN insulin Akt-p Akt Akt-p Akt-p SK-Hep1 Akt-p insulin PTEN SK-Hep1 PTEN overexpression Akt-p insulin PTEN PTEN SK - Hep1 10 PTEN SK-Hep1 PTEN 21
22 M.O.I M.O.I 100 Ad-PTEN Sk-Hep PTEN SK-Hep1 SK-Hep1 Ad-GFP Ad-PTEN MOI 100 Boyden chambers chemotaxis Ad-PTEN SK-Hep1 12 insulin FAK FAK insulin PTEN SK-Hep1 FAK-p 13 FAK-p PTEN downregulation FAK Shc. PTEN SK-Hep1 in vitro contact inhibition anchorage independence SK-Hep1 Ad-GFP Ad-PTEN MOI 100 colony PTEN 22
23 Ad-PTEN SK-Hep1 colony 14 PTEN SK-Hep1 MMP9 SK-Hep1 Ad-GFP Ad-PTEN MOI conditioned medium CM 20 l 10 SDS - PAGE 10 SDS - PAGE 0.1% wt/vol type A gelatin MMP-2 MMP-9 SK-Hep1 MMP9 PTEN SK-Hep1 MMP9 15 PTEN MAPK/Erk Ad-GFP Ad-PTEN insulin MAPK-P-38 Erk 1/2 insulin MAPK-P-38 Erk 1/2 insulin Ad-GFP Ad-PTEN control
24 SK-Hep1 cdna PTEN PTEN ~3% Yao PTEN SK-Hep1 Ad-PTEN SK-Hep1 PTEN 9 Ad-PTEN SK-Hep1 Ad-PTEN HA PTEN SK-Hep1 24
25 PTEN angiogenesis migration invasion degrading enzyme matrix metallo-proteinase MMP 26 MMP-2 MMP-9 Ad-PTEN SK-Hep1 MMP-2 MMP-9 migration Ad-PTEN Sk-hep1 MMP-9 MMP-9 migration PTEN SK-Hep1 migration Ad-PTEN SK-Hep1 12 FAK-p FAK 25
26 insulin PTEN SK-Hep1 FAK-p 13 migration assay FAK-p PTEN downregulation FAK Shc 1 Mahlavu FAK-p PTEN. in vitro PTEN SK-Hep1 PTEN SK-Hep1 Ad-PTEN SK-Hep1 24 M.O.I 100 Ad-GFP SK-Hep1 control PTEN 26
27 PTEN PI3K SK-Hep1 PTEN SK-Hep1 Akt Akt-p MAPK ErK 10 SK-Hep1 Akt-p/Akt Ad-GFP Ad-PTEN Akt-p/Akt Akt-p PTEN Mahlavu 18 PTEN ( 16 ) Mahlavu 27
28 3 FAK-p Mahlavu 28
29 Hu,T.H., et al.(2003).expression and prognostic role of tumor suppressor gene PTEN/MMAC1/TEP1 in Hepatocellular Carcinoma.Cancer 97, Wan, X.W. et al.(2003).the alteration of PTEN tumor suppressor expression and its association with the histopathological features of human primary hepatocellular carcinoma. J Cancer Res. Clin Oncol 129, Chen, P. J., and Chen, D. S. (1999). Hepatitis B virus infection and hepatocellular carcinoma: molecular genetics and clinical perspectives. Semin Liver Dis 19, Di Cristofano, A., and Pandolfi, P. P. (2000). The multiple roles of PTEN in tumor suppression. Cell 100, Fujimori, M., Tokino, T., Hino, O., Kitagawa, T., Imamura, T., Okamoto, E., Mitsunobu, M., Ishikawa, T., Nakagama, H., Harada, H., and et al. (1991). Allelotype study of primary hepatocellular carcinoma. Cancer 29
30 Res 51, Fujiwara, Y., Hoon, D. S., Yamada, T., Umeshita, K., Gotoh, M., Sakon, M., Nishisho, I., and Monden, M. (2000). PTEN / MMAC1 mutation and frequent loss of heterozygosity identified in chromosome 10q in a subset of hepatocellular carcinomas. Jpn J Cancer Res 91, Kawamura, N., Nagai, H., Bando, K., Koyama, M., Matsumoto, S., Tajiri, T., Onda, M., Fujimoto, J., Ueki, T., Konishi, N., Shiba, T., and Emi, M. (1999). PTEN/MMAC1 mutations in hepatocellular carcinomas: somatic inactivation of both alleles in tumors. Jpn J Cancer Res 90, Li, D. M., and Sun, H. (1997). TEP1, encoded by a candidate tumor suppressor locus, is a novel protein tyrosine phosphatase regulated by transforming growth factor beta. Cancer Res 57, Li, J., Yen, C., Liaw, D., Podsypanina, K., Bose, S., Wang, S. I., Puc, J., Miliaresis, C., Rodgers, L., McCombie, R., Bigner, S. H., Giovanella, B. C., Ittmann, M., Tycko, B., Hibshoosh, H., Wigler, M. H., and Parsons, 30
31 R. (1997). PTEN, a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain, breast, and prostate cancer [see comments]. Science 275, Liu, T. Z., Chen, P. Y., Chiu, D. T., Wei, J. S., Chang, K. S., and Lin, K. H. (1994). Detection of a novel lactate dehydrogenase isozyme and an apparent differentiation-associated shift in isozyme profile in hepatoma cell lines. Cancer Lett 87, Maehama, T., and Dixon, J. E. (1999). PTEN: a tumour suppressor that functions as a phospholipid phosphatase [In Process Citation]. Trends Cell Biol 9, Piao, Z., Kim, H., Jeon, B. K., Lee, W. J., and Park, C. (1997). Relationship between loss of heterozygosity of tumor suppressor genes and histologic differentiation in hepatocellular carcinoma. Cancer 80, Piao, Z., Park, C., Park, J. H., and Kim, H. (1998). Allelotype analysis of hepatocellular carcinoma. Int J Cancer 75,
32 Podsypanina, K., Ellenson, L. H., Nemes, A., Gu, J., Tamura, M., Yamada, K. M., Cordon-Cardo, C., Catoretti, G., Fisher, P. E., and Parsons, R. (1999). Mutation of Pten/Mmac1 in mice causes neoplasia in multiple organ systems. Proc Natl Acad Sci U S A 96, Steck, P. A., Pershouse, M. A., Jasser, S. A., Yung, W. K., Lin, H., Ligon, A. H., Langford, L. A., Baumgard, M. L., Hattier, T., Davis, T., Frye, C., Hu, R., Swedlund, B., Teng, D. H., and Tavtigian, S. V. (1997). Identification of a candidate tumour suppressor gene, MMAC1, at chromosome 10q23.3 that is mutated in multiple advanced cancers. Nat Genet 15, Yao, Y. J., Ping, X. L., Zhang, H., Chen, F. F., Lee, P. K., Ahsan, H., Chen, C. J., Lee, P. H., Peacocke, M., Santella, R. M., and Tsou, H. C. (1999). PTEN/MMAC1 mutations in hepatocellular carcinomas. Oncogene 18, Yeh, K. T., Chang, J. G., Chen, Y. J., Chen, S. T., Yu, S. Y., Shih, M. C., Perng, L. I., Wang, J. C., Tsai, M., and Chang, C. P. (2000). Mutation analysis of the putative tumor suppressor gene PTEN/MMAC1 in 32
33 hepatocellular carcinoma. Cancer Invest 18,
34 1 PTEN PTEN 1 Apoptosis and cell cycle control PTEN is a lipid phosphatase which can antagonize the phosphoinositide-3 kinase signaling pathway promoting apoptosis and inhibiting cell cycle progression 2 Adhesion-Dependent Signaling Dephosphorylation of FAK inhibiting integrin-mediated cell spreading and migration (Cell 100, ,2000) 34
35 PTEN PTEN A B 2 Hu et al.,
36 3 PTEN A B C D T N PTEN PTEN Hu et al.,
37 4 1 A,E 2 B F 3 C G 4 D H A B C D P53 G H Hu et al.,
38 PTEN expression in hepatoma cells well HepG2 Hep3B J5 Mahlavu SK-Hep1 poor DNA RNA PTEN β actin PTEN GADPH PCR RT-PCR Protein PTEN α tubulin western blot 5 PTEN PTEN 1 HepG2 Hep3B 2 J5 3 Mahlavu Sk-Hep1 PTEN DNA RNA protein Mahlavu 38
39 PTEN PTEN E1A E1B PTEN CMV promoter PTEN HA PTEN. polya E3 39
40 PTEN PTEN PTEN mrna bp bp 3 primers run PCR PTEN mrna PTEN 9 exon exon 5 domain 40
41 Hoechst GFP A B A B Control M.O.I 10 Control GFP 10 M.O.I 50 M.O.I 100 GFP 50 GFP SK-Hep1 A Hoechest stain A 0 B M.O.I 10 C M.O.I 50 M.O.I 50 M.O.I 100 M.O.I
42 Adenovirus-mediated exogenous PTEN expression in SK-hep1 cells insulin _ + SK-Hep1 Ad-GFP Ad-PTEN SK-Hep1 Ad-GFP Ad-PTEN 56kDa PTEN 56kDa 42kDa HA actin 9 Western blot PTEN SK-Hep1 western blot PTEN PTEN Sk-Hep1 PTEN SK-Hep1 Ad-GFP Ad-PTEN 42
43 10 Western blot PTEN Akt-p /Akt Insulin SK-Hep1 Akt-p Akt-p Akt insulin Akt Akt-p Akt Akt 43
44 24 hrs CV 11 PTEN SK-Hep1 proliferation assay Ad-GFP Ad-PTEN M.O.I SK-Hep1 24 Ad-PTEN M.O.I 100 Ad-PTEN M.O.I 50 44
45 A Control 100x Ad-GFP 100x Ad-PTEN 100x B Migration (%) C GFP PTEN 12 PTEN SK-Hep1 migration A B A SK-Hep1 Ad-GFP Ad-PTEN migration assay PTEN SK-Hep1 45
46 FAk-p/FAk expression in SK-hep1 cells after adenovirus gene delivery _ Insulin + Control Ad-GFP Ad-PTEN Control Ad-GFP Ad-PTEN FAK-P FAK FAK-P/FAK ratio Actin Control Ad-GFP Ad-PTEN Control Ad-GFP - + Ad-PTEN 13 Western blot PTEN FAK-p / FAK migration assay PTEN FAK-p 46
47 Colony formating assay SK-Hep1 GFP 100 PTEN 100 colon number SK-Hep1 GFP 100 PTEN PTEN SK-Hep1 Ad-PTEN SK-Hep1 colony formation 47
48 SK-Hep1 Ad-GFP Ad-PTEN MMP9 MMP2 15 PTEN SK-Hep1 MMP matrix metallo-proteinase SK-Hep1 Ad-GFP Ad-PTEN MMP Mahlvu MMP2 SK-Hep1 MMP9 SK-Hep1 PTEN SK-Hep1 control 48
49 - Insulin + Ad-PTEN Ad-GFP SK-Hep1 Ad-PTEN Ad-GFP SK-Hep1 MAPK Actin 16 Western blot MAPK insulin PTEN MAPK. 49
50 17 Western blot Erk insulin PTEN ErK 50
51 Insulin Mahlavu cell SK-Hep1 cell pten Akt-p Akt Actin 18 Mahlavu and SK-Hep1 PTEN Akt SK-Hep1 PTEN Mahlavu insulin SK-Hep1 Akt Mahlavu Akt insulin SK-Hep1 Akt Mahlavu 51
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