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- 錡铁 蒋
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1 细 胞 生 物 学 杂 志 Chinese Journal of Cell Biology 009, 31(1): 人 低 分 化 原 发 性 肝 癌 细 胞 系 TJ3ZX-01 建 立 及 其 细 胞 起 源 的 初 步 研 究 张 世 光 高 英 堂 1, 宋 文 芹 陈 力 朱 争 艳 王 毅 军 1 王 鹏 杜 智 1,* ( 南 开 大 学 生 命 科 学 学 院, 天 津 ; 1 天 津 市 第 三 中 心 医 院, 天 津 ; 天 津 市 人 工 细 胞 重 点 实 验 室, 天 津 ) 摘 要 采 用 组 织 破 碎 直 接 培 养 法 在 体 外 建 立 一 株 人 低 分 化 原 发 性 肝 癌 细 胞 系 TJ3ZX-01, 并 对 其 生 物 学 特 征 进 行 鉴 定, 利 用 免 疫 细 胞 化 学 染 色 与 流 式 细 胞 术 分 析, 探 讨 低 分 化 原 发 性 肝 癌 起 源 细 胞 染 色 结 果 表 明 CK18 + CK19 + 波 形 蛋 白 + AFP low PCNA + Hep -, 认 为 该 细 胞 系 具 有 上 皮 细 胞 的 特 征, 但 肝 细 胞 标 记 物 表 达 较 低, 不 具 有 明 显 的 成 熟 肝 细 胞 特 征 ; 利 用 流 式 细 胞 仪 分 析 细 胞 表 面 标 记 物 CD9 CD34 CD45 Thy-1 (CD90) CD133 CD49f 在 细 胞 中 的 表 达 情 况, 其 阳 性 细 胞 的 比 例 在 传 代 过 程 中 保 持 稳 定 的 水 平, 其 中 少 量 细 胞 可 能 具 有 干 细 胞 与 前 体 细 胞 的 性 质, 显 示 此 例 低 分 化 原 发 性 肝 癌 的 来 源 为 肝 干 细 胞 或 前 体 细 胞 关 键 词 低 分 化 ; 肝 细 胞 癌 ; 癌 干 细 胞 ; 细 胞 起 源 肝 癌 是 一 种 常 见 的 恶 性 肿 瘤, 其 发 生 机 制 与 细 胞 起 源 仍 然 存 在 着 较 大 的 争 议 ; 肿 瘤 干 细 胞 理 论 认 为 癌 症 是 一 种 干 细 胞 疾 病, 肿 瘤 中 存 在 着 一 种 具 有 干 细 胞 性 质 的 对 肿 瘤 发 生 与 发 展 起 决 定 作 用 的 细 胞 亚 群, 这 类 [1] [] [3~8] 细 胞 来 源 于 干 细 胞 突 变 的 积 累 随 着 白 血 病 与 某 些 实 体 瘤 中 这 种 具 有 干 细 胞 性 质 细 胞 亚 群 的 发 现, 究 竟 是 否 所 有 肿 瘤 都 起 源 于 干 细 胞 或 前 体 细 胞, 是 否 所 有 肿 瘤 中 都 存 在 着 肿 瘤 干 细 胞 引 起 了 研 究 者 的 极 大 兴 趣 由 于 肝 细 胞 本 身 具 有 很 强 的 增 殖 能 力, 其 增 殖 过 程 中 有 可 能 突 变 形 成 肿 瘤 细 胞 导 致 肿 瘤 的 发 生, 目 前 被 研 究 者 广 泛 认 同 的 理 论 是 肝 干 细 胞 与 前 体 细 胞 以 及 肝 细 胞 都 可 能 导 致 肝 癌 的 发 生, 低 分 化 肝 癌 起 源 于 骨 髓 干 细 胞 与 卵 圆 细 胞 高 分 化 肝 癌 起 源 于 肝 细 胞, 肝 细 胞 首 先 经 蜕 分 化 形 成 小 肝 细 胞 引 起 肝 癌 的 发 生, 而 卵 圆 细 胞 [9~11] 肝 干 细 胞 与 骨 髓 干 细 胞 也 都 可 能 通 过 积 累 突 变 形 成 肿 瘤, 不 同 类 型 的 肝 细 胞 癌 在 形 态 与 预 后 等 方 面 存 在 着 很 大 差 异 近 年 来 对 肝 癌 干 细 胞 的 研 究 取 得 较 大 进 展, 肝 癌 干 细 胞 及 肝 癌 起 源 的 研 究 对 今 后 肝 癌 的 治 疗 及 预 后 具 有 重 要 的 意 义, 针 对 不 同 类 型 的 肝 癌 可 以 采 取 更 加 有 效 的 方 式 进 行 治 疗 本 实 验 通 过 对 低 分 化 肝 癌 细 胞 的 分 离 与 培 养, 旨 在 研 究 不 同 类 型 肝 细 胞 癌 的 细 胞 起 源 及 讨 论 不 同 类 型 肝 癌 细 胞 中 肿 瘤 干 细 胞 存 在 的 可 能 性 1 材 料 与 方 法 1.1 组 织 来 源 组 织 来 源 于 006 年 9 月 0 日 天 津 市 第 三 中 心 医 院 肝 癌 手 术 标 本, 患 者 为 男 性, 56 岁, 经 病 理 诊 断 为 低 分 化 原 发 性 肝 细 胞 癌 Ⅲ - Ⅳ 级, 表 面 抗 原 HBsAg 阳 性, 伴 有 结 节 性 肝 硬 化 及 伴 灶 性 脂 肪 变 性 1. 细 胞 培 养 将 肿 瘤 组 织 置 于 培 养 皿 中, 经 PBS 清 洗 后, 用 手 术 剪 将 组 织 剪 成 1 mm 3 的 小 块, 充 分 吹 打, 细 胞 悬 液 经 100 目 滤 网 过 滤, 离 心 机 (KDC-046, 科 大 创 新 股 份 有 限 公 司 中 佳 分 公 司 ) 500 g 离 心 5 min 弃 上 清 液, 加 入 溶 血 素 混 匀 37 静 置 10 min 去 除 红 细 胞, 500 g 离 心 5 min 弃 上 清 液, 获 得 的 细 胞 经 PBS 冲 洗 后, 台 盼 蓝 染 色 检 测 收 稿 日 期 : 接 受 日 期 : 天 津 市 重 点 科 技 攻 关 专 项 (No.05YFSZSF0500) 和 天 津 市 基 金 项 目 (No.08JCYBJC08300) 资 助 * 通 讯 作 者 Tel: , zhi-du@163.com
2 10 研 究 论 文 细 胞 活 性 大 于 90%, 以 个 细 胞 数 接 种 于 100 ml 培 养 瓶 中, 加 入 D-MEM/F-1 培 养 液 (Gibco 公 司 ), 含 0% 胎 牛 血 清 ( 晶 美 生 物 工 程 有 限 公 司 ) 100 U/ml 青 霉 素 100 U/ml 链 霉 素, 置 于 37 5% CO 培 养 箱 中 培 养, 培 养 7 h 换 液 去 除 未 贴 壁 的 细 胞, 倒 置 相 差 显 微 镜 (IX-71, Olympus, 日 本 ) 下 每 天 观 察 细 胞 生 长 情 况, 反 复 贴 壁 法 去 除 成 纤 维 细 胞, 培 养 后 观 察 发 现 细 胞 呈 克 隆 化 生 长, 挑 取 克 隆 生 长 的 细 胞 进 行 扩 大 培 养, 每 3 天 换 液, 细 胞 开 始 时 生 长 较 慢, 1~8 天 传 代 一 次, 9 代 后 生 长 较 快, 7 天 传 代 一 次, 目 前 已 获 得 稳 定 增 殖 的 上 皮 样 细 胞, 同 时 该 细 胞 在 低 浓 度 血 清 (5%) 中 仍 可 以 稳 定 生 长, 命 名 为 TJ3ZX 生 物 学 特 征 鉴 定 克 隆 化 生 长 细 胞 扩 大 培 养 挑 取 原 代 培 养 细 胞 中 呈 克 隆 化 生 长 的 细 胞, 转 入 4 孔 板 中 进 行 扩 大 培 养, 细 胞 增 殖 后 转 入 培 养 瓶 中 培 养, 获 得 性 状 稳 定 的 细 胞 群 体 1.3. 细 胞 形 态 取 9 代 细 胞 进 行 HE 染 色, 光 学 显 微 镜 下 观 察 细 胞 形 态, 并 取 对 数 生 长 期 的 细 胞 经 0.5% 胰 蛋 白 酶 (Gibco 公 司 ) 消 化 后, 加 入 固 定 液, 制 备 电 镜 标 本, 透 射 电 镜 (JEM-1010, JEOL, 日 本 ) 观 察 细 胞 超 微 结 构 生 长 曲 线 与 倍 增 时 间 取 11 代 生 长 的 细 胞 经 0.5% 胰 蛋 白 酶 消 化 后 以 每 孔 个 密 度 接 种 于 96 孔 板 中, 加 入 0.1 ml 培 养 液 培 养, 连 续 培 养 7 天, 期 间 视 细 胞 生 长 情 况 补 加 培 养 液, 于 接 种 后 天 使 用 MTT 法 检 测 ; 每 组 6 孔, 同 时 以 培 养 液 作 为 空 白 对 照, 于 490 nm 波 长 处 利 用 酶 标 仪 (Multiskan MK 3, Labsystems, 芬 兰 ) 检 测 各 组 细 胞 的 吸 光 度 值, 取 均 值 绘 制 生 长 曲 线 细 胞 周 期 取 处 于 对 数 生 长 期 的 细 胞, 0.5% 胰 蛋 白 酶 消 化 制 备 单 细 胞 悬 液, 95% 乙 醇 固 定 48 h, PBS 冲 洗 后 加 入 1 ml 碘 化 丙 锭 (propidium iodide, PI) 4 避 光 染 色 30 min, 流 式 细 胞 仪 (FACs, BECKMAN COULTER EPICS ALTRA) 在 488 nm 激 发 波 长 下, 测 定 细 胞 荧 光 强 度, 使 用 MultiCycle 软 件 对 该 细 胞 周 期 DNA 含 量 进 行 分 析, 确 定 细 胞 周 期 分 布 细 胞 核 型 分 析 在 细 胞 培 养 液 中 加 入 秋 水 仙 素 至 终 浓 度 0.4 μg/ml, 继 续 培 养 h, 0.5% 胰 蛋 白 酶 消 化 细 胞, mmol/l KCl 低 渗 处 理 15 min, 甲 醇 / 冰 醋 酸 (3 1) 固 定 液 固 定 h, 滴 片 干 燥 后 吉 姆 萨 染 色, 统 计 并 分 析 细 胞 核 型 克 隆 与 集 落 形 成 分 别 配 制 0.7% 1.% 琼 脂 糖 溶 液 混 匀 后 高 压 灭 菌, 置 于 50 水 浴 中 配 制 D-MEM/F-1 ( 抗 生 素, 40% FPS) 等 量 混 合 1.% 琼 脂 糖 与 D-MEM/F-1, 加 入 6 孔 板 中, 室 温 下 凝 固 消 化 细 胞, 制 备 单 细 胞 悬 液 并 计 数 取 1 10 个 细 胞 加 入 D-MEM/F-1 与 0.7% 琼 脂 糖 中 (1 1) 定 量 加 入 6 孔 板 中 制 成 双 层 软 琼 脂 培 养 基 置 37 5% CO 培 养 箱 中 培 养 14 天, 观 察 细 胞 克 隆 形 成 情 况 成 瘤 能 力 取 15 代 肿 瘤 细 胞, 胰 蛋 白 酶 消 化 后 加 入 PBS 制 备 单 细 胞 悬 液, 以 个 细 胞 数 接 种 5 周 龄 SCID 鼠 ( 中 国 军 事 医 学 科 学 院 ) 腋 背 皮 下, 30 天 后 观 察 小 鼠 成 瘤 情 况 细 胞 侵 袭 能 力 细 胞 经 胰 蛋 白 酶 消 化 后, 以 个 细 胞 数 接 种 于 1 8 稀 释 matrigel (BD 公 司 ) 包 被 的 transwell 小 室 (Costar 公 司 ) 中, 37 5% CO 培 养 箱 中 培 养 4 h, 95% 乙 醇 固 定 后 吉 姆 萨 染 色, 00 显 微 镜 下 随 机 选 取 5 个 视 野 进 行 细 胞 计 数, 取 均 值 表 示 细 胞 的 侵 袭 能 力, 以 肝 癌 细 胞 SMMC-771 作 为 对 照 组 进 行 侵 袭 能 力 的 比 较 1.4 细 胞 起 源 鉴 定 免 疫 细 胞 化 学 染 色 应 用 免 疫 细 胞 化 学 方 法 检 测 细 胞 中 甲 胎 蛋 白 (AFP) 人 细 胞 角 蛋 白 (CK18 CK19) 肝 素 酶 (Hep) 增 殖 细 胞 核 抗 原 (PCNA) 与 波 形 蛋 白 (vimentin) 表 达 情 况, 所 有 一 抗 均 为 鼠 抗 人 抗 体, 购 自 北 京 中 山 生 物 有 限 公 司 ; 采 用 免 疫 细 胞 化 学 检 测 试 剂 盒 ( 晶 美 生 物 工 程 有 限 公 司 ) 提 供 的 标 准 方 法 进 行 实 验, DAB 显 色 苏 木 素 套 染 细 胞 核 观 察 实 验 结 果 1.4. 流 式 细 胞 仪 检 测 取 个 细 胞 分 别 加 入 流 式 细 胞 抗 体 CD9 CD34 CD45 ( 晶 美 生 物 工 程 有 限 公 司 ) CD49f (Biolegend 公 司 ) CD90 (BD 公 司 ) CD133 (Miltenyi Biotec 公 司 ), 室 温 避 光 30 min, PBS 冲 洗 后 1% 多 聚 甲 醛 固 定, 流 式 细 胞 仪 检 测
3 张 世 光 等 : 人 低 分 化 原 发 性 肝 癌 细 胞 系 TJ3ZX-01 建 立 及 其 细 胞 起 源 的 初 步 研 究 103 结 果.1 细 胞 特 征 鉴 定.1.1 细 胞 形 态 倒 置 显 微 镜 观 察 细 胞 形 态 发 现 TJ3ZX-01 肿 瘤 细 胞 为 上 皮 样 细 胞, 呈 集 落 生 长, 细 胞 之 间 紧 密 聚 集, 没 有 接 触 抑 制 现 象, 部 分 细 胞 重 叠 生 长 ( 图 1A), 培 养 后 在 培 养 瓶 中 可 以 形 成 肉 眼 可 见 的 白 斑 ; 细 胞 形 态 与 增 殖 能 力 各 异, 呈 多 角 型 和 梭 型, 细 胞 分 泌 大 量 的 细 胞 外 基 质, 可 在 细 胞 之 间 形 成 多 条 纤 丝, 细 胞 具 有 较 强 的 黏 附 力, 挑 取 克 隆 生 长 的 细 胞, 扩 大 培 养 后 得 到 增 殖 稳 定 的 细 胞 ( 图 1B); HE 细 胞 染 色 发 现 细 胞 具 有 异 质 性 的 特 点, 细 胞 核 呈 多 形 性, 大 小 形 态 不 一 致, 胞 核 与 胞 浆 比 例 大 ( 图 1C) 透 射 电 镜 观 察 细 胞 为 椭 圆 形, 表 面 见 指 状 及 丘 状 突 起, 核 异 型, 少 量 异 染 色 质 散 在 分 布, 胞 质 见 大 小 不 等 坏 死 空 腔 ; 核 内 全 为 常 染 色 质, 仅 见 少 量 异 染 色 质, 大 量 线 粒 体 高 度 凝 聚, 高 尔 基 氏 体 扩 张, 光 面 内 质 网 较 多, 核 糖 体 减 少, 可 见 髓 样 小 体 ( 图 1D).1. 生 物 学 特 征 在 含 有 0% 胎 牛 血 清 D-MEM/F-1 培 养 液 中 培 养 7 天, MTT 法 检 测 细 胞 增 殖 情 况, 取 均 值 绘 制 细 胞 生 长 曲 线 ( 图 A), 对 数 生 长 期 细 胞 倍 增 时 间 为 34.4 h 流 式 细 胞 仪 检 测 肿 瘤 细 胞 多 为 异 倍 体, 细 胞 周 期 结 果 显 示 细 胞 80% 汇 合 程 度 时 G 1 = 61.1%±1.5%, G =1.7%±.7%, S=6.%±.1%, G /G 1 =1.97 ( 图 B) 软 琼 脂 培 养 基 培 养 14 天 后, 细 胞 具 有 在 软 琼 脂 上 形 成 克 隆 的 能 力, 可 以 形 成 肉 眼 可 见 的 克 隆 ; 细 胞 侵 袭 实 验 结 果 显 示 该 肿 瘤 细 胞 具 有 一 定 的 细 胞 侵 袭 能 力, 侵 袭 细 胞 数 为 51.1±4.8, 与 SMMC-771 细 胞 侵 袭 数 60.7±6. 相 比 较 侵 袭 性 稍 差 ; 致 瘤 性 实 验 显 示 该 细 胞 系 成 瘤 能 力 较 弱, 两 次 SCID 小 鼠 皮 下 接 种 个 细 胞 30 天 后 仍 然 未 见 肿 瘤 形 成, 准 备 进 一 步 进 行 原 位 致 瘤 实 验.1.3 核 型 分 析 染 色 体 检 测 细 胞 核 型 为 异 倍 体 ( 图 3A), 随 机 对 64 个 细 胞 的 中 期 分 裂 相 核 型 进 行 分 析, 染 色 体 数 目 变 化 很 大, 数 目 集 中 于 46~119, 众 数 集 中 于 51~70 ( 图 3B), 占 所 统 计 64 个 中 期 分 裂 相 的 84.4%. 细 胞 来 源 鉴 定..1 免 疫 细 胞 化 学 染 色 免 疫 细 胞 化 学 染 色 结 果 显 示 CK18 CK19 波 形 蛋 白 PCNA 呈 阳 性, AFP 为 弱 阳 性, Hep 呈 阴 性 ( 图 4) 作 为 上 皮 细 胞 标 记 物 的 CK18 与 CK19 呈 强 阳 性, 而 肝 癌 细 胞 的 标 记 物 AFP 与 肝 细 胞 标 记 物 Hep 则 呈 现 低 表 达 或 不 表 达 的 特 征, PCNA 与 波 形 蛋 白 表 达 呈 阳 性 与 细 胞 增 殖 情 况 与 恶 性 程 度 呈 正 相 关 同 时 SMMC-771 细 胞 的 免 疫 细 胞 化 学 染 色 的 结 果 为 CK18 CK19 Hep 波 形 蛋 白 PCNA Fig.1 Cell morphology A: clone growth of TJ3ZX-01 cells (100 ); B: dilatation cultivation of cells clone (100 ); C: cells stained with HE (400 ); D: TJ3ZX-01 cells observed in transmission electron microscope (4 000 ).
4 104 研 究 论 文 Fig. Biology characters A: growth curve; B: cell cycle detected by FACs. Fig.3 Karyotype analysis A: karyotype of TJ3ZX-01 cell metaphase plate at passage 1 with 61 chromosomes (1 000 ); B: distribution of chromosome number of 64 metaphase spreads at passages 1 of TJ3ZX-01 cell line. 呈 阳 性 表 达, AFP 为 弱 阳 性.. 流 式 细 胞 仪 检 测 对 不 同 代 数 肿 瘤 细 胞 进 行 流 式 细 胞 术 检 测, 测 定 CD9 (FITC) CD34 (PE) CD45 (PE-Cy5) Thy-1/CD90 (PE) CD49f (FITC) CD133 (PE) 阳 性 细 胞 在 肿 瘤 细 胞 中 所 占 比 例, 结 果 显 示 肝 细 胞 标 记 物 CD9 CD49f 在 细 胞 中 表 达 占 细 胞 总 数 的 78.0%~83.% 和 67.1%~73.9%, 造 血 干 细 胞 标 记 物 CD34 的 表 达 占.4%~.6%, 干 细 胞 与 某 些 肿 瘤 干 细 胞 的 标 志 物 CD133 表 达 量 为 1.4%~16.9%, 肝 干 细 胞 与 前 体 细 胞 标 记 物 CD90 阳 性 率 为 1.0%~.0% ( 图 5), 各 种 抗 体 的 表 达 结 果 在 细 胞 传 代 过 程 中 基 本 保 持 稳 定 3 讨 论 [1] 本 实 验 所 获 得 TJ3ZX-01 细 胞 系 来 源 于 低 分 化 原 发 性 肝 癌 组 织 标 本, 利 用 各 种 细 胞 生 物 学 方 法 对 其 细 胞 生 物 学 特 征 进 行 了 研 究, 结 果 显 示 细 胞 为 上 皮 样 细 胞, 呈 克 隆 生 长 且 生 长 过 程 中 没 有 接 触 抑 制 现 象 ; 细 胞 具 有 异 质 性 的 特 点, 核 异 型, 染 色 体 为 非 整 倍 体, 细 胞 具 有 侵 袭 能 力 并 可 以 在 软 琼 脂 培 养 基 中 形 成 克 隆, 具 有 明 显 的 肿 瘤 细 胞 特 征 ; 该 细 胞 致 瘤 性 较 弱 可 能 与 细 胞 本 身 特 征 及 细 胞 生 长 状 态 有 关, 同 时 受 SCID 小 鼠 品 系 与
5 张 世 光 等 : 人 低 分 化 原 发 性 肝 癌 细 胞 系 TJ3ZX-01 建 立 及 其 细 胞 起 源 的 初 步 研 究 105 Fig.4 The result of immunocytochemistry (400 ) A: CK18; B: CK19; C: AFP; D: Hep; E: PCNA; F: vimentin. TJ3ZX-01 cell stained with DAB and nucleus stained with hematoxylin. Fig.5 Flow cytometry analysis with different markers 周 龄 及 其 接 种 的 部 位 等 诸 多 因 素 的 影 响, 通 过 对 该 细 胞 各 种 生 物 学 特 征 的 初 步 鉴 定, 确 认 为 一 例 原 发 性 肝 癌 细 胞 系 [13] 与 人 肝 癌 细 胞 系 SMMC-771 细 胞 系 相 比 较, 两 者 在 形 态 学 上 存 在 着 较 大 的 差 异, 显 示 着 不 同 的 细 胞 起 源 通 过 免 疫 细 胞 化 学 与 流 式 细 胞 分 析, 研 究 该 低 分 化 原 发 性 肝 癌 细 胞 的 起 源, 免 疫 染 色 结 果 表 明 该 细 胞 系 CK18 + CK19 + 波 形 蛋 白 + PCNA + AFP low Hep -, 其 中 作 为 上 皮 细 胞 与 胆 管 细 胞 标 记 物 的 CK18 CK19 在 该 细 胞 与 SMMC-771 细 胞 中 均 呈 高 表 达, 显 示 此 例 细 胞 与 SMMC-771 细 胞 均 具 有 前 体 细 胞 的 特 征 ; 成 熟 肝 细 胞 标 记 物 Hep - CK19 + 显 示 此 细 胞 来 源 不 是 肝 细 胞, 而 SMMC-771 细 胞 Hep 表 达 呈 阳 性, 认 为 与 SMMC- 771 细 胞 相 比 较, 此 细 胞 来 源 可 能 是 更 为 原 始 的 肝 干 细 胞 或 者 肝 前 体 细 胞 ; AFP 作 为 常 见 的 肝 癌 检 测 标 志 物 在 部 分 肝 癌 中 表 达, 本 实 验 中 肝 癌 细 胞 与 SMMC-771 细 胞 AFP 表 达 均 较 低, 可 能 由 于 肝 癌 发 展 过 程 中 的 细 胞 改 变 导 致 某 些 肝 癌 特 征 消 失, 其 特 征 也 可 能 由 于 其 细 胞 起 源 的 不 同 而 显 示 出 一 定 的 差 异 性 ; 此 外 PCNA 与 波 形 蛋 白 表 达 成 阳 性 与 细 胞 增 殖 情 况 及 恶 性 程 度 有 关, 其 高 表 达 代 表 细 胞 增 殖 情 况 良 好 并 具 有 较 高 的 恶 性 程 度 [14] 近 年 来 对 肝 癌 干 细 胞 的 研 究 取 得 较 大 进 展, Chiba 等 从 几 种 肝 癌 细 胞 系 中 分 离 得 到 的 SP 细 胞 具 有 某 些 干 细 胞 的 性 质, 这 种 SP 细 胞 出 现 于 Huh7 与 PLC/PRF/5 细 胞 系 中, 而 HepG 与 Huh6 细 胞 中 则 没 有 发 现, 同 时 目 前 所 研 究 的 细 胞 系 都 集 中 在 高 分 化 原 发 肝 癌 细 胞 系, 很 少 涉 及 到 低 分 化 原 发 性 肝 癌 细 胞 因 此 是 否 所 有 不 同 起 源 的 肝 癌 细 胞 中 都 有 干 细 胞 特 征 细 胞 存 在, 以 及 其 表 面 标 记 物 是 否 相 同 目 前 仍 然 无 法 确 定 本 实 验 对 该 肝 癌 细 胞 进 行 流 式 细 胞 检 测 发 现 肝 细 胞 标 记 物 CD9 CD49f 的 高 表 达 显 示 细 胞 仍 然 具 有 某 些 肝 细 胞 性 质, CD34 作 为 造 血 干 细 胞 及 其 前 体 细 胞 的 常 用 表 面 标 记 物 在 该 细 胞 中 也 有 少 量 表 达, 其 含 量 也 与 大 部 分 研 究 [15] 报 道 相 符 CD133 作 为 常 用 的 肿 瘤 干 细 胞 标 记 物 在 多 种 肿 瘤 中 均 有 报 道, Kordes 等 研 究 发 现 CD133 + 的 肝 [16] 星 状 细 胞 具 有 前 体 细 胞 的 性 质, Yin 等 在 肝 癌 细 胞 系 SMMC-771 中 发 现 了 具 有 干 细 胞 性 质 的 CD133 + 细 胞, [17] Suetsugu 等 也 在 Huh7 细 胞 系 中 发 现 了 CD133 + 细 胞 的 表 达, 而 在 HepG 细 胞 系 中 则 没 有 发 现, 本 实 验 在
6 106 研 究 论 文 对 该 细 胞 中 CD133 含 量 测 定 后 发 现 CD133 + 细 胞 占 细 胞 总 数 的 1.4%~16.9%, 远 远 高 于 SMMC-771 中 的 0.1%~1%, 同 时 低 于 在 Huh-7 中 的 46.79%, 其 结 果 可 能 是 由 于 不 同 类 型 肝 癌 中 肿 瘤 干 细 胞 之 间 的 差 异, 也 可 能 来 源 于 体 外 培 养 过 程 中 细 胞 产 生 的 变 异 CD90 (Thy-1) 作 为 肝 干 细 胞 与 前 体 细 胞 标 记 物 在 成 熟 肝 细 胞 中 [18] 很 少 表 达, Yang 等 在 研 究 肝 癌 细 胞 系 中 发 现 CD90 + 细 胞 具 有 肿 瘤 干 细 胞 性 质, 之 后 又 通 过 对 肝 癌 组 织 与 肝 癌 患 者 外 周 血 的 研 究 发 现 CD45 - CD90 + 细 胞 为 肝 癌 干 细 胞 的 标 记 物 其 CD90 + 细 胞 的 表 达 量 与 该 低 分 化 原 发 性 肝 癌 细 胞 系 相 似, 大 约 为 % 通 过 对 目 前 已 知 的 肝 癌 干 细 胞 的 表 面 标 记 物 检 测 显 示, 该 低 分 化 原 发 性 肝 癌 细 胞 系 中 存 在 着 这 种 来 源 于 干 细 胞 或 前 体 细 胞 并 与 肝 癌 起 源 密 切 相 关 的 肿 瘤 干 细 胞, 其 各 种 标 记 物 细 胞 所 占 的 比 率 也 与 目 前 报 道 的 研 究 结 果 相 一 致, 究 竟 不 同 起 源 的 肝 癌 中 是 否 都 存 在 着 肿 瘤 干 细 胞, 各 种 肿 瘤 干 细 胞 之 间 的 特 征 是 否 相 同, 仍 然 需 要 进 一 步 的 研 究 相 信 随 着 对 不 同 起 源 肝 癌 的 深 入 研 究, 将 会 对 肝 癌 发 生 发 展 机 制 有 新 的 认 识, 为 临 床 上 彻 底 治 愈 肝 癌 带 来 新 的 希 望 参 考 文 献 (References) [1] Reya T, Morrison SJ, Clarke MF et al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells, Nature, 001, 414(6859): [] Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as ahierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell, Nat Med, 1997, 3(7): [3] Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells, Proc Natl Acad Sci USA, 003, 100(7): [4] Singh SK, Clarke ID, Terasaki M et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors, Cancer Res, 003, 63(18): [5] Singh SK, Hawkins C, Clarke ID et al. Identification of human brain tumour initiating cells, Nature, 004, 43(7015): [6] Li C, Heidt DG, Dalerba P et al. Identification of pancroatie cancer stem cells, Cancer Res, 007, 67(3): [7] Collins AT, Berry PA, Hyde C et al. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells, Cancer Res, 005, 65(3): [8] Dalerba P, Dylla SJ, Park IK et al. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells, Proc Natl Acad Sci USA, 007, 104(4): [9] Wu XZ, Chen D. Origin of hepatocellular carcinoma: role of stem cells, J Gastroenterol Hepatol, 006, 1(7): [10] Sell S. Cellular origin of hepatocellular carcinomas. Semin Cell Dev Biol, 00, 13(6): [11] Tovara V, Villanueva A, Llovet JM. Cell biology and genetics in liver cancer, Gastroenterol Hepatol, 007, 30(6): [1] 司 徒 镇 强, 吴 军 正 细 胞 培 养, 西 安 : 世 界 图 书 出 版 公 司, 004, [13] 董 荣 春, 周 荣 华, 吕 发 度, 等 SMMC-771 人 体 肝 癌 细 胞 株 的 建 立 及 其 生 物 学 特 性 的 初 步 观 察, 第 二 军 医 大 学 学 报, 1980, 1(1): 5-9. [14] Chiba T, Kita K, Zheng YW et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties, Hepatology, 006, 44(1): [15] Kordes C, Sawitza I, Müller-Marbach A et al. CD133 + hepatic stellate cells are progenitor cells, Biochem Biophys Res Commun, 007, 35 (): [16] Yin S, Li J, Hu C et al. CD133 positive hepatocellular carcinoma cells possess high capacity for tumorigenicity, Int J Cancer, 007, 10 (7): [17] Suetsugu A, Nagaki M, Aoki H et al. Characterization of CD133 + hepatocellular carcinoma cells as cancer stem/progenitor cells, Biochem Biophys Res Commun, 006, 351(4): [18] Yang ZF, Ngai P, Ho DW et al. Identification of local and circulating cancer stem cells in human liver cancer, Hepatology, 008, 47(3):
7 张 世 光 等 : 人 低 分 化 原 发 性 肝 癌 细 胞 系 TJ3ZX-01 建 立 及 其 细 胞 起 源 的 初 步 研 究 107 Establishment of A Poorly Differentiated Hepatocellular Carcinoma Cell Line TJ3ZX-01 and Research for Its Cellular Origin Shi-Guang Zhang, Ying-Tang Gao 1,, Wen-Qin Song, Li Chen, Zheng-Yan Zhu, Yi-Jun Wang 1, Peng Wang, Zhi Du 1, * (College of Life Science, Nankai University, Tianjin , China; 1 Tianjin Third Central Hospital, Tianjin , China; Key Laboratory of Artificial Cell, Tianjin , China) Abstract Cancer cell line TJ3ZX-01 were separated from poorly differentiated hepatocellular carcinomas specimen by the tissue dissection method, and their biological characteristics were identified. The cellular origin of the poorly differentiated HCC cell line was investigated with immunocytochemistry and flow cytometry analysis. Immunocytochemistry detection showed CK18 +, CK19 +, vimentin +, AFP low, PCNA + and Hep, which demonstrated the cancer cell line had the characteristics of epithelial cells but not the obvious characteristics of liver cells for the markers of the liver cell were low. The liver cell and stem cells surface markers CD9, CD34, CD45, Thy-1 (CD90), CD133 and CD49f expressed in the cell line were stable with passages. A small subset of cells in the cancer cells migth has the characters of stem cells or progenitor cells, which indicated that this hepatocellular carcinomas cell line originated from stem cells or progenitor cells. Key words poorly differentiated; hepatocellular carcinomas; cancer stem cell; cellular origin Received: May 1, 008 Accepted: September 8, 008 This work was supported by the Key Project of Science and Technology of Tianjin City (No.05YFSZSF0500) and the Foundation of Tianjin City (No.08JCYBJC08300) *Corresponding author. Tel: , zhi-du@163.com
380 研 究 论 文 发 酵 天 数 双 乙 酰 测 定 : 参 照 GB4927-4928-2001 标 准 发 酵 液 中 的 化 学 成 分 的 测 定 : 采 用 GC-8A 型 气 相 色 谱 测 定 1.5 离 子 注 入 方 法 [6] 把 待 处 理 的 菌 株 细 胞 均 匀 涂
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