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括易
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1 核农学报 2016ꎬ30(2):0323 ~ 0331 Journal of Nuclear Agricultural Sciences 323 文章编号 : (2016) 动物性食品中硝基咪唑类兽药多残留酶联免疫检测方法的建立张 1ꎬ2 弛 1 潘家荣 1 帅瑞琪方 1 豪 1 冯依璠 ( 1 中国计量学院 / 浙江省海洋食品品质及危害物控制技术重点实验室 ꎬ 杭州浙江重庆市计量质量检测研究院第六分院 ꎬ 涪陵重庆 ) 摘要 : 本试验采用活化酯法 ꎬ 将合成的具有 2 - 甲基硝基咪唑通用结构的半抗原与载体蛋白偶联制备免疫抗原和包被抗原 ꎬ 以获得的抗原制备 2 - 甲基硝基咪唑通用结构抗体 ꎬ 并建立 5 种硝基咪唑类药物及代谢物的酶联免疫分析技术 ꎮ 结果表明 : 制备的抗体效价高于 ꎬ 该方法在不同动物源性食品中的加标回收率在 85 65% ~ % 之间 ꎬ 检测限达 mg L - 1 ꎬ 对 2 - 甲基硝基咪唑甲硝唑替硝唑地美硝唑和塞克哒唑 5 种硝基咪唑抗生素及代谢物交叉反应率达 95% 以上 ꎮ 本研究为进一步建立和完善酶联免疫法检测动物性食品中硝基咪唑类药物残留提供了技术支撑 ꎮ 关键词 : 硝基咪唑类抗生素 ꎻ 酶联免疫分析 ꎻ 通用结构 DOI: / j. issn 硝基咪唑类抗生素是畜禽饲料中常用的抗原虫感染及抗菌药 ꎬ 具有促生长作用 [1-3] ꎬ 可与其他抗生素联合用于治疗厌氧菌感染 [4-5] ꎮ 但是该类药物及其某些代谢物对哺乳动物具有致癌致畸致突变作用和遗传毒性 ꎬ 被许多国家列为违禁药物 [5] ꎮ 在我国动物源性食品中硝基咪唑类抗生素残留及其代谢物的检测标准中 ꎬ 检测对象有甲硝唑 1 - (2 - 羟乙基 ) 羟甲基硝基咪唑地美硝唑羟甲基甲硝咪唑替硝唑 2 - 甲硝咪唑 4 - 硝基咪唑塞克哒唑异丙硝唑 1 - 甲基硝基咪唑丙醇洛硝达唑氯甲硝咪唑苯硝咪唑等 13 种化合物 ( 表 1) [6] ꎮ 目前测定硝基咪唑类抗生素及其代谢物的方法主要有气相色谱法 [7-8] 气相色谱质谱联用法 [8] 高效液 [9] [12] 相色谱法和高效液相色谱质谱联用法等 ꎮ 在我国现行动物源性食品 ( 包括蜂王浆及其干粉 [13ꎬ16-17] 肠衣 ) 及饲料中硝基咪唑类抗生素及代谢物检测标准中 [15] ꎬ 其主要检测方法是液相色谱串联质谱法 [14ꎬ18] ꎮ 但上述方法的检测设备昂贵样品前处理复杂 ꎬ 同时还需要较高水平的专业人员进行操作 ꎬ 很难满足对批量样品进行快速检测和现场检测的要求 [20-23] ꎮ 酶联免疫吸附法具有简单快速灵敏特异低成本的优 [19ꎬ24 - 势 25] ꎬ 已广泛应用于农药等化学残留物的检测 [26 - 中 28] ꎮ 酶联免疫吸附试验的关键是要得到一种高效价高特异性的抗体 ꎬ 虽然已有不少关于酶联免疫吸 [10 - 附法测定兽药残留的报道 11] ꎬ 而对硝基咪唑类兽药检测的报道却鲜有见到 ꎮ 本研究通过设计合成一种具有 2 - 甲基硝基咪唑通用结构的半抗原 ꎬ 制备通用结构抗体 ꎬ 建立一种能同时测定多种具有 2 - 甲基硝基咪唑通用结构的硝基咪唑类抗生素的高灵敏的酶联免疫检测方法 ꎬ 旨在为抗生类药物残留的快速检测和现场检测提供技术支撑 ꎮ 1 材料与方法 1 1 试剂甲硝唑 2 - 甲基硝基咪唑 1 - (2 - 羟乙基 ) 羟甲基硝基咪唑地美硝唑羟甲基甲硝咪唑替硝唑 2 - 甲硝咪唑塞克哒唑异丙硝唑 1 - 甲基硝基咪唑丙醇洛硝达唑原药 ꎬ 均为分析纯 ꎬ 购自北京百灵威科技有限公司 ꎻNꎬN - 二甲收稿日期 : 接受日期 : 基金项目 : 国家质检公益专项 ( ) 作者简介 : 张弛 ꎬ 男 ꎬ 主要从事食品检测技术研究 ꎮ E mail:work. zc@ qq. com 通讯作者 : 潘家荣 ꎬ 男 ꎬ 研究员 ꎬ 主要从事食品安全检测技术研究 ꎮ E mail:panjr@ 263. net

2 324 核农学报 30 卷 Table 1 表 1 主要硝基咪唑类抗生素及其代谢物的结构式 The structures of main nitroimidazoles and their metabolites 化合物名称 Names of compounds 结构式 Structure 备注 Remarks 甲硝唑 Metroinidazole( MNZ) 1 - (2 - 羟乙基 ) 羟甲基 5 - 硝基咪唑 1 - (2 - Hydroxyethyl) hydroxylmethyl nitroimidazole(mnzoh) 甲硝唑代谢物 Metabolite of MNZ 地美硝唑 Dimetridazole( DMZ) 羟甲基甲硝咪唑 2 - Hydroxylmethyl methyl nitrometroimidazole (HMMNI) 地美硝唑代谢物 Metabolite of DMZ 替硝唑 Tinidazole 2 - 甲硝咪唑 2 - methyl nitromitroimidazole 4 - 硝基咪唑 4 - nitroimidazole 塞克哒唑 Secnidazole 异丙硝唑 Ipronidazole( IPZ) 1 - 甲基硝基咪唑丙醇 IpronidazoleOH( IPZOH) 异丙硝唑代谢物 Metabolite of IPZ 洛硝达唑 Ronidazole( RNZ) 氯甲硝咪唑 5 - chchloro - 1methyl nitroimidazole 苯硝咪唑 5 - nitrobenzimidazole 基甲酰胺 (DMF) N - 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 牛血清白蛋白 ( BSA) 鸡卵白蛋白 ( OVA) 3ꎬ3 ꎬ5ꎬ5 - 四甲基联苯胺 (TMB)ꎬ 均为分析纯 ꎬ 购自美国 Sigma 公司 ꎻ 弗氏佐剂购自美国 Sigma 公司 ꎻ 辣根过氧化物酶标记

3 2 期动物性食品中硝基咪唑类兽药多残留酶联免疫检测方法的建立 325 的山羊抗兔 IgG( HRP)ꎬ 购自北京康为世纪生物技术有限公司 ꎻNꎬN - 二环己基碳酰亚胺 (DCC)ꎬ 分析纯 ꎬ 购自国药集团化学试剂有限公司 ꎻ 脱脂奶粉 ꎬ 购自内蒙古伊利实业集团股份有限公司 ꎻ30% 双氧水 ꎬ 购自浙江杭州高晶精细化工有限公司 ꎻ98 08% 的浓硫酸 ꎬ 购自浙江三鹰化学试剂有限公司 ꎻ 吐温 20(Tween - 20)ꎬ 化学纯 ꎬ 购自阿拉丁试剂 ( 上海 ) 有限公司 ꎻ 其他常规试剂均为分析纯 ꎬ 购自国药集团化学试剂有限公司 ꎮ 新西兰大白兔 ꎬ8 ~ 9 周龄 ꎬ 购自杭州师范大学实验动物中心 ꎮ 各种食品购于杭州下沙物美超市 ꎮ 1 2 仪器 UV1000 紫外可见分光光度计 ꎬ 日本岛津有限公司 ꎻMULTISKAN MK3 酶标仪 Nicolet in10 红外光谱仪 TY10Sorvall ST 16 台式离心机 ꎬ 美国 Thermo 公司 ꎻ Stectrostin 400Hz 核磁共振仪 ꎬ 德国 Bruker 公司 ꎻRV10 旋转蒸发仪 ꎬ 德国 IKA 公司 ꎮ 1 3 试验方法甲基硝基咪唑通用结构半抗原的合成及鉴定甲硝唑替硝唑地美硝唑 2 - 甲硝咪唑塞克哒唑的通用结构可设计为 2 - 甲基硝基咪唑 ꎮ 本试验以甲硝唑为底物 ꎬ 通过 1 位上的甲醇基与载体联接 ꎬ 合成 2 - 甲基硝基咪唑通用结构半抗原 ꎮ 具体方法为 : 在 10mL 烧杯中加入甲硝唑 0 85g 琥珀酸酐 1 25g 无水吡啶 1mLꎬ 磁力搅拌反应 4hꎬ 得乳白色混合液体 ꎮ 将混合液体放置微波炉内加热约 10s 至混合物刚好沸腾 ꎬ 混合物变成透明的黄色液体 ꎮ 旋转蒸发仪减压浓缩除去吡啶得白色固体 ꎮ 加入 20 ml 蒸馏水超声溶解 ꎬ 用 20 ml 乙酸乙酯萃取 3 次 ꎬ 合并有机相 ꎬ 旋转蒸发仪减压浓缩至干 ꎬ 加入 5 ml 乙酸乙酯超声溶解后 ꎬ 加入 25 ml 石油醚 ꎬ 静置 ꎬ 减压抽滤得白色固体粉末即为 2 - 甲基硝基咪唑通用结构半抗原 ꎮ 真空干燥后用核磁共振仪 ( 2 H - 氯仿作溶剂 ) 和红外光谱仪进行鉴定 ꎬ - 4 保存备用 ꎮ 甲基硝基咪唑通用结构免疫抗原和包被抗原的合成及鉴定采用活性酯法通过 DCC 和 NHS 将载体蛋白的氨基与 2 - 甲基硝基咪唑通用结构半抗原的羧基进行联接 ꎮ 具体步骤为 : 准确称取 g 半抗原溶于 5mL NꎬN - 二甲基甲酰胺中 ꎬ 加入 310mg DCCꎬ 摇床搅拌 10minꎬ 加入 20 0mg NHSꎮ 室温避光反应 3 5hꎬ 可以观察到有白色的沉淀物生成 ꎮ 用离心机进行离心 ꎬ 取上层清液逐滴加到 40mL 4 75mg ml - 1 BSA 溶液 ( 以 0 1mol L - 1 ph 值 8 0 的 PBS 配置 ) 中 ꎬ 室温避光反应 2hꎮ 用 0 9% 的生理盐水透析 3dꎬ 每天换液 3 次 ꎬ 冻干后即得 2 - 甲基硝基咪唑通用结构免疫抗原 ꎮ 同理 ꎬ 利用 2 - 甲基硝基咪唑通用结构半抗原和 OVA 制备 2 - 甲基硝基咪唑通用结构包被抗原 ꎮ 利用紫外分光光度计进行鉴定并测定计算联接摩尔分子比 ꎮ 甲基硝基咪唑通用结构抗体的制备及鉴定 MNZ BSA 用生理盐水稀释 ꎬ 加等体积的完全弗氏佐剂充分乳化 ꎮ 皮下多点注射免疫新西兰白兔 ꎬ 每只 500μg MNZ BSAꎮ 在第 15 天 ꎬ 再次注射相同剂量经不完全弗氏佐剂乳化的抗原 ꎮ 之后分别于第 29 天第 39 天和第 49 天 ꎬ 注射 250μg 经不完全弗氏佐剂充分乳化的免疫抗原 ꎮ 耳静脉取血 ꎬ 测定效价 ꎮ 效价合适后 ꎬ 心脏完全取血后分离纯化抗血清 ꎮ 采用间接非竞争 ELISA 法测定纯化后抗体效价 [23] ꎻ 利用棋盘法确定甲硝唑包被抗原和抗体工作浓度 ꎮ 甲基硝基咪唑 ELISA 测定标准曲线的制作用 PBST 溶液配制 l l 10 mg L - 1 的 2 - 甲基硝基咪唑标准溶液 ꎬ 用测得的最佳工作浓度进行 ELISA 试验 ꎬ 测定其抑制率 ꎬ 以标准浓度的对数值为横坐标 ꎬ 抑制率为纵坐标绘制标准曲线 ꎮ 检测限的测定用测得的最佳工作浓度进行 ELISA 试验 ꎬ 对不含硝基咪唑类药物的 PBS 溶液 (1mmol L - 1 ) 重复测试 20 次 ꎮ 按下式计算检测限 [17] : LOD = σ / D 其中 ꎬσ 为空白测定值的标准偏差 ꎬ 即为噪音值 ꎻ D 为标准曲线的斜率 ꎮ 硝基咪唑类药物的交叉反应率测定通过测定抑制率为 50% 的 2 - 甲基硝基咪唑甲硝唑 1 - (2 - 羟乙基 ) 羟甲基 5 - 硝基咪唑地美硝唑羟甲基甲硝咪唑替硝唑 2 - 甲硝咪唑塞克哒唑异丙硝唑 1 - 甲基硝基咪唑丙醇洛硝达唑 ( 各种 2 - 甲基硝基咪唑结构类似物 ) 的浓度 ꎬ 计算交叉反应率 (% )ꎬ 试验重复 3 次 ꎮ 计算公式如下 : 交叉反应率 = 抑制率为 50% 的 2 - 甲基 -5 - 硝基咪唑浓度抑制率为 50% 的 2 - 甲基 -5 - 硝基咪唑结构类似物浓度 100% 动物源性食品中硝基咪唑类药物加标回收率的测定本试验以猪肉鸡肉牛肉猪肝鸡肝牛肝猪肾牛肾鱼肉蜂蜜和乳制品等为样品研究加标回收率 ꎮ 分别称取 20g 上述样品 ꎬ 以低中高 3 个浓度

4 ３２６核农学３０卷报分别加入２甲基５硝基咪唑ꎬ加入１０ｇ硅藻土充分混匀ꎬ依次加入５ｍＬ氯化钠饱和溶液和７０ｍＬ甲醇丙酮溶液(３１ꎬｖ / ｖ) ꎬ高速均质提取３ｍｉｎꎬ提取液于１００００ｒｍｉｎ１下离心２ｍｉｎꎮ 取上清用于测定ꎮ 对于蜂蜜和乳制品ꎬ加入１０ｍＬＮａＣｌ饱和溶液ꎬ超声波提取２ｍｉｎꎬ其余条件同上ꎮ 每个试验重复３次ꎮ 加标回收率测得的２甲基５硝基咪唑浓度本底值加标的２甲基５硝基咪唑浓度２１００结果与分析图１２甲基５硝基咪唑通用结构半抗原的氢核磁共振图谱２１２甲基５硝基咪唑通用结构半抗原的鉴定Ｆｉｇ. １２ＨＮＭＲｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆｔｈｅＨａｐｔｅｎｏｆ２ｍｅｔｈｙｌ５ｎｉｔｒｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ由图１可知ꎬ１ＨＮＭＲ:δ ７９７８７９８０( ｔꎬ１ｈ) ꎬ ７２６３７２６９( ｔꎬ１ｈ) ꎬ ４２６９４５９６( ｍꎬ２ｈ) ꎬ ４４８１４５１２ ( ｍꎬ２ｈ) ꎬ ２６１８２７２６ ( ｍꎬ３ｈ) ꎬ ２４５６构中存在羧基酯基结构ꎬ并且咪唑环已连接在碳链２５９２( ｍꎬ２ｈ) ꎬ表明半抗原中含有ＣＨＣＨ２ＯＮＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ和ＣＨ２ＣＯＯＣ基唑通用结构半抗原合成成功ꎮ 团ꎬ初步断定这种物质是２甲基５硝基咪唑通用结构半抗原ꎮ 本研究的通用抗原是通过甲硝唑的２位乙羟基联接而来ꎮ 由图２可知ꎬ在３５００ ~ ３２００ｃｍ１有吸收峰ꎬ 是ＯＨ的红外特征结构ꎻ在１６００ｃｍ１左右存在１个吸收峰ꎬ是ＮＯ２的红外特征结构ꎮ 图２和图３表明ꎬ 甲硝唑和２甲基５硝基咪唑通用结构半抗原的出峰位置以及形状都不同ꎮ 根据图３出峰时间可以推断半抗原２甲基５硝基咪唑通用结构半抗原结图２Ｆｉｇ. ２上ꎮ 表明甲硝唑半琥珀酸酯ꎬ即２甲基５硝基咪２２２甲基５硝基咪唑通用结构全抗原紫外吸收光谱鉴定分析由图４可知ꎬＢＳＡ在２８０ｎｍ处有吸收峰ꎬ而２甲基５硝基咪唑通用结构半抗原在该波长吸收较弱ꎬ 全抗原在该波长附近有一肩峰ꎬ可能是载体和偶联于载体上的甲硝唑的吸收累加所致ꎻ３２０ｎｍ为２甲基５硝基咪唑通用结构半抗原的特征吸收波长ꎬＢＳＡ在该波长几乎无吸收ꎬ而全抗原在该波长却表现出与２甲基５硝基咪唑类似的特征吸收峰ꎬ故该吸收甲硝唑的红外光谱图ＩＲｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆｍｅｔｒｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ

5 ２期３２７动物性食品中硝基咪唑类兽药多残留酶联免疫检测方法的建立峰应为连接于载体上的２甲基５硝基咪唑所贡献ꎬ表明２甲基５硝基咪唑通用结构半抗原连接在载体蛋白上ꎬ 全抗原合成成功ꎮ 经计算ꎬ ＢＳＡ和ＯＶＡ与半抗原的偶联分子比分别为１１１和１０１ꎬ符２４２甲基５硝基咪唑酶联免疫检测标准曲线在０００００１０００ｌ００１０. ｌ１和１０ｍｇＬ１２甲基５硝基咪唑浓度下ꎬ以抑制率为纵坐标ꎬ２甲基５硝基咪唑浓度的对数值为横坐标ꎬ可得合免疫和包被要求ꎮ ２甲基５硝基咪唑酶联免疫检测标准曲线ꎬ其其工作浓度的确定０９９８７ ( 图５) ꎮ ２３２甲基５硝基咪唑通用结构抗体的鉴定及抗血清效价测定的结果见表３ꎮ ５只免疫新西兰大白兔中ꎬＸ４号效价最高ꎬ达到１１０００００ꎮ 根据棋盘法测得最佳工作浓度为每孔包被抗原０２５μｇ和抗体稀释１０００倍ꎮ 图３Ｆｉｇ. ３表３Ｔａｂｌｅ３免疫兔编号ＲａｂｂｉｔＮｏ. Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５方程为ｙ１９１０２ｘ７６０５７ꎬ 相关系数平方Ｒ２２５检测限用本研究建立的检测方法对不含硝基咪唑类药物的ＰＢＳ溶液(１ｍｍｏｌＬ１ ) 重复测试２０次ꎬ测量结果值得标准偏差 σ ０００３５ꎬＬＯＤ１９１０４ｍｇＬ１ ꎮ ２甲基５硝基咪唑通用结构半抗原的红外光谱图ＩＲｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆｔｈｅＨａｐｔｅｎｏｆ２ｍｅｔｈｙｌ５ｎｉｔｒｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ不同稀释度下２甲基５硝基咪唑通用结构抗血清的滴度鉴定ＴｉｔｅｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＡｎｔｉｓｅｒｕｍａｇａｉｎｓｔ２ｍｅｔｈｙｌ５ｎｉｔｒｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ１１０００１１００００注:效价测定的结果为阳性ꎬ 为阴性ꎬ / 为可疑ꎮ 抗血清稀释度Ｄｉｌｕｔｉｏｎｒａｔｉｏｓｏｆａｎｔｉｓｅｒｕｍ１２５０００１１０００００１１６００００ / / / Ｎｏｔｅ: : Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｐｏｓｉｔｉｖｅ. :Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｎｅｇａｔｉｖｅ. / :Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｕｎｃｅｒｔａｉｎ. ２６硝基咪唑类药物的交叉反应率测定２甲基５硝基咪唑甲硝唑１ ( ２羟乙基) ２羟甲基５硝基咪唑地美硝唑羟甲基甲硝咪唑替硝唑塞克哒唑异丙硝唑１甲基５硝基咪唑２丙醇和洛硝达唑的交叉反应率见表４ꎬ其中ꎬ甲硝唑地美硝唑替硝唑塞克哒唑的交叉反应率

6 328 核农学报 30 卷表 4 主要硝基咪唑类抗生素对 2 - 甲基硝基咪唑检测检测方法的交叉反应率 (P 0 05) Table 4 The cross reactivity of main nitroimidazoles to 2 - methyl nitroimidazole(p 0 05) / % 化合物名称 Names of compounds 交叉反应率 The cross reactivity 备注 Remarks 2 - 甲基硝基咪唑 2 - methyl nitroimidazole 甲硝唑 Metroinidazole( MNZ) 1 - (2 - 羟乙基 ) 羟甲基硝基咪唑 1 - (2 - Hydroxyethyl) hydroxylmethyl nitroimidazole(mnzoh) 地美硝唑 Dimetridazole( DMZ) 羟甲基甲硝咪唑 2 - Hydroxylmethyl methyl nitrometroimidazole (HMMNI) 替硝唑 Tinidazole 4 - 硝基咪唑 4 - nitroimidazole 塞克哒唑 Secnidazole 异丙硝唑 Ipronidazole( IPZ) 1 - 甲基硝基咪唑丙醇 IpronidazoleOH( IPZOH) 洛硝达唑 Ronidazole( RNZ) 氯甲硝咪唑 5 - chchloro - 1methyl nitroimidazole 苯硝咪唑 5 - nitrobenzimidazole 甲硝唑代谢物 Metabolite of MNZ 地美硝唑代谢物 Metabolite of DMZ 异丙硝唑代谢物 Metabolite of IPZ 图 4 BSA 2 - 甲基硝基咪唑通用结构半全抗原和 2 - 甲基硝基咪唑通用结构免疫抗原紫外吸收光谱图 Fig. 4 UV spectra of BSAꎬ hapten and immunogen of 2 - methyl nitroimidazole 达 95% ꎻ1 - (2 - 羟乙基 ) 羟甲基 5 - 硝基咪唑羟甲基甲硝咪唑异丙硝唑 1 - 甲基硝基咪图甲基硝基咪唑 ELISA 检测标准曲线 Fig. 5 The standard calibration curve of ELISA for Nitroimidazoles 唑丙醇和洛硝达唑的交叉反应率均小于 1% ꎬ 这是因为甲硝唑地美硝唑替硝唑塞克哒唑均具有 2 - 甲基硝基咪唑类似结构 ꎬ 而其他几种实验兽药则没有 ꎬ 表明该检测方法可同时检测 2 - 甲基 - 5 硝基咪唑甲硝唑地美硝唑替硝唑塞克哒唑等 5 种硝基

7 2 期动物性食品中硝基咪唑类兽药多残留酶联免疫检测方法的建立 329 咪唑类抗生素残留 ꎬ 而不会与 1 - (2 - 羟乙基 ) 羟甲基 5 - 硝基咪唑羟甲基甲硝咪唑异丙硝唑 1 - 甲基硝基咪唑丙醇和洛硝达唑等其他兽药产生交叉反应 ꎮ 2 7 测定动物源性食品中硝基咪唑类药物加标回收率的不同种类的食品对 2 - 甲基硝基咪唑加标回收率存在差异 ( 表 5)ꎬ 其中肌肉类样品的加标回收率较高 ꎬ 在 92 34% ~ % 之间 ꎬ 而蜂蜜和乳制品的加标回收率较低 ꎬ 为 85 65% ~ 93 60% ꎮ 两类样品的加标回收率比较接近 ꎬ 可能是因为不同种类食品对加标回收率影响不大 ꎮ 总体而言 ꎬ 加标回收率满足检测要求 ꎮ 表 5 不同动物性食品中 2 - 甲基硝基咪唑的加标回收率 (P 0 05) Table 5 The ELISA recovery of added 2 - methyl nitroimidazole in different kinds of food(p 0 05) / % 食品种类 Foods 加标浓度 Standard addition concentration / (mg L - 1 ) 猪肉 Pork 鸡肉 Chicken 牛肉 Beef 猪肝 Pork liver 鸡肝 Chicken liver 牛肝 Beef liver 猪肾 Pork kideny 牛肾 Beef kideny 蜂蜜 Honey 乳制品 ( 纯牛奶 ) Dairy products( pure milk) 3 讨论人工合成免疫抗原是制备特异性抗体的常用方法 [29] 之一 ꎬ 俎晶晶等用碳二亚胺法将甲硝唑半抗原与牛血清白蛋白 (BSA) 连接制备人工免疫原 ꎬ 获得的血清效价大于 5 000ꎬ 但与甲硝唑外的其他硝基咪唑类兽药交叉反应率均小于 10% ꎮ 本试验通过建立通用结构抗体进行免疫检测是快速检测具有相似结构化学物的方法之一 ꎬ 弥补了前人研究中的不足 [30-31] ꎮ 雷红涛 [32] 等以甲硝唑与琥珀酸酐反应 ꎬ 合成半抗原甲硝唑半琥珀酸酯 ꎬ 通过活泼酯法将半抗原与载体蛋白偶联制备甲硝唑全抗原 ꎬ 此方法与本文相似 ꎬ 进一步说明了利用 2 - 甲基硝基咪唑半抗原制备硝基咪唑类 [33] 通用抗体的合理性 ꎮ Huet 等以乙腈萃取正己烷去脂处理样品 ꎬELISA 法测定了鸡蛋和肉中的 5 种硝基咪唑类兽药 ꎬ 取得了不错的效果 ꎬ 其中 DMZ 和 MNZ 的检出限分别达到 1ppb 和 10ppbꎬ 而本文在此基础之上进一步将相同兽药的检出限提高到 0 19ppb ( mg L - 1 [34] )ꎮ 王亚宾等采用洛硝哒唑水解产物与戊二酸酐生成洛硝哒唑半抗原的方法 ꎬ 可以同时测定 3 种硝基咪唑类兽药 ꎬ 但是只有甲硝唑和二甲硝唑的交叉反应率在 90% 以上 ꎮ 本文通用结构抗原成功将包含甲硝唑在内的 5 种兽药交叉反应率控制在 [35] 95% 以上 ꎬ 扩大了检测兽药的种类 ꎮ 何方洋等利用戊二酸酐法和碳化二亚胺法合成半抗原和免疫抗原 ꎬ 制备特异性强的单克隆抗体 ꎬ 建立了鸡肉中硝基咪唑类兽药 ELISA 检测方法 ꎬ 其最低检测限为 0 04 ppbꎬ 这也表明利用单克隆通用抗体可提高兽药检出限 ꎮ 本试验可以同时检测食品中 2 - 甲基硝基咪唑甲硝唑替硝唑地美硝唑和塞克哒唑 5 种硝基咪唑类抗生素或代谢物残留 ꎬ 是由于其具有相同的特异结构 ꎬ 差别仅为 1 位上的取代基 ꎮ 但是目前需要检测的硝基咪唑类抗生素及其代谢物约为 12 种 ꎬ 由于位上的取代基较为复杂 ꎬ 与 2 - 甲基硝基咪唑通用结构区别较大 ꎬ 本文所建立的方法尚无法检测另外 7 种 ꎬ 因此可再通过设计 1 ~ 2 种其它通用结构进行检测 ꎬ 这有待今后进一步探索 ꎮ 4 结论本试验建立了 2 - 甲基硝基咪唑通用结构硝基咪唑类药物酶联免疫分析技术 ꎬ 该方法加标回收率在 85% ~ 109% 之间 ꎬ 对测试的 5 种硝基咪唑抗生素及代谢物有良好的响应 ꎬ 交叉反应率达 95% 以上 ꎬ 检测限约为 mg L - 1 ꎮ 表明本方法是一种准确灵敏 ꎬ 简便快速的检测方法 ꎬ 适用于硝基咪唑类兽药的快速筛查工作 ꎮ 参考文献 : [ 1 ] Gupta B SꎬBaldwa SꎬVerma SꎬGupta J BꎬSingle A. Metronidazole induced neuropathy[ J]. Neurol Indiaꎬ2000ꎬ48(2): [ 2 ] 魏小兰. 甲硝唑的应用进展及副作用 [ J]. 职业与健康 ꎬ2004ꎬ20 (7):146 [ 3 ] Baggst J Dꎬ Wilson W Dꎬ Hietala S. Clinical pharmacokinetics of metronidazole in homes[ J]. Journal of Veterinary Pharmacological Therapyꎬ1988ꎬ11(2):

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9 Journal of Nuclear Agricultural Sciences 2016ꎬ30(2):0323 ~ Research on Enzyme Linked Immunosorbent Assay for Multi residues of Nitroimidazoles in Foods of Animal Origin ZHANG Chi 1ꎬ2 PAN Jiarong 1 SHUAI Ruiqi 1 FANG Hao 1 FENG Yifan 1 ( 1 Key Laboratory of Marine Food Quality and Hazard Controlling Technology of Zhejiang Province / China Jiliang Universityꎬ ZhejiangꎬHangzhou ꎻ 2 Chongqing Academy of Metrology and Quality Inspection of Six BranchꎬFulingꎬChongqing ) Abstract:In this experimentꎬ the 2 - methyl nitroimidazole hapten was synthesizedꎬ which was used to prepare the immune antigen and envelope antigenꎬ with activated ester method to link to a carrier protein. And the hapten was identified. With the antigen prepared 2 - methyl nitroimidazole common antibodyꎬ the ELISA of 5 kinds of nitroimidazoles was established. The results showed that: An antiserum with titer of 1: was prepared and an ELISA for simultaneously detection of multi residues of nitroimidazoles in foods of animal origin and recovery of 85 65% % had been establishedꎬ the LOD was as low as mg L - 1. The cross reaction rates to 2 - methyl nitroimidazoleꎬ metronidazoleꎬ tinidazoleꎬ dimetridazole and Secnidazole were above 95%. This study provided the technological base to the fast testing of veterinary drug residues in foods of animal origin. Keywords:nitroimidazolesꎬ ELISAꎬ common - structure antibody

第期甘金华等强力霉素人工抗原的合成与抗体制备材料与方法试剂及溶液

第期甘金华等强力霉素人工抗原的合成与抗体制备材料与方法试剂及溶液第卷第期年月食品与生物技术学报强力霉素人工抗原的合成与抗体制备甘金华邓薇李进平艾晓辉中国水产科学研究院长江水产研究所湖北荆州武汉纺织大学环境与城建学院湖北武汉采用改进的碳二亚胺两步法将强力霉素半抗原与载体蛋白连接制备强力霉素牛血清白蛋白人工免疫抗原并用同样方法将强力霉素与载体蛋白连接制备人强力霉素卵清白蛋白人工包被抗原经紫外扫描分析和动物免疫试验证实强力霉素人工抗原合成成功