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1 1 文稿修订联系人任海涛沈玉栋孙远明第 40 卷分析化学 FENXI HUAXUE) 研究 2 参考文献的作者,期刊,年,卷,期,起止页码已请认真核实未发现错漏 2012 年月 Chn Jun Any Chy 3 两处文献与正文不对应以进行修订 3 修改替换了英文摘要中的一句话 4 修正了一处资助项目编号第期 ~ DOI: SP. J 呋喃唑酮代谢物单克隆抗体制备及酶联免疫吸附分析方法任海涛沈玉栋徐振林杨金易雷红涛肖治理王弘孙远明 * 广东省食品质量安全重点实验室,华南农业大学食品学院,广州 ) 摘要本研究针对呋喃唑酮代谢物AOZ),设计合成了系列半抗原,进一步通过偶联牛血清白蛋白 BSA) 免疫 Bb 小鼠细胞融合筛选和亚克隆等过程成功获得了源于新颖半抗原 H3 的具有高亲和力亲和力常数 L)和高特异性与其它功能类似物交叉反应小于 0.1% )抗 AOZ 单克隆抗体同时,基于设计合成的系列同异源半抗原包被抗原,考察了不同结构包被原对 ELISA 方法灵敏度的影响另外,采用最佳的特征结构异源包被原 H5-OVA,建立了以对硝基苯甲醛 p-np)为衍生剂的 AOZ 间接竞争 ELISAELISA) 和直接竞争 ELISAdELISA)检测方法结果表明:ELISA 模式的 AOZ 检测 IC50 为 gl,定量检测线性范围IC20 ~ IC80 )为 0.060~ gl,检出限ic10 )达 gl;delisa 模式的 AOZ 检测 IC50 为 gl, 定量检测线性范围为 0.143~ gl,检出限为 gl 两种方法对 AOZ 的检测灵敏度和定量线性范围均达到相关检测限量要求,可满足不同需求的实际样品检测关键词 1 引呋喃唑酮;单克隆抗体;酶联免疫法;异源包被言呋喃唑酮是一种硝基呋喃类药物,广泛应用于水产类和禽类养殖,其在体内代谢快速,主要以代谢物 3-氨基-2- 唑烷酮AOZ)形式存在,具有一定毒性致畸性致癌性,对人体健康与生态平衡具有潜在威胁 [1] 因此,欧美等多国禁止其在动物生产中使用,我国农业部自 2002 年规定动物源性食品中呋喃唑酮不得检出 [2] 目前,对食品中硝基呋喃类药物残留检测方法主要有 HPLC,HPLC-MSMS 等仪器法 [3,4],该类方法灵敏准确,但存在前处理繁琐操作复杂检测成本高的问题,难以满足现场大批量样品快速检测要求近年来,基于抗原抗体反应的 ELISA 等快速免疫分析方法以其特异性强灵敏简便准确和样品通量高等优点,弥补仪器法的不足,成为农兽药残留快速筛查的热点技术方法 [5,6] Cp 等于 2004 年首次制备了呋喃唑酮代谢物的多克隆抗体,对虾组织样品中 AOZ 的检出限为 0.3 gl[7] ;Lu 等报道了多克隆抗体检测 ELISA 方法, 检出限为 0.05~ gl[8] 多克隆抗体批间差异大,不利于开发性能稳定的快速检测产品,因而开发可弥补多克隆抗体不足的单克隆抗体已成为发展趋势 Dbkv 等在呋喃唑酮代谢物单克隆抗体基础上建立了定量检测范围达到 0.05 ~ 5 gl 的 ELISA 方法 [9] 另外,由于 AOZ 分子太小,难以直接检测,必须采用衍生化增加分子量方法实现间接检测 [7~ 9] 本研究以对硝基苯甲醛 p-np)为 AOZ 衍生试剂,基于新设计合成的系列半抗原,制备筛选获得了高特异性高亲和力抗 AOZ 单克隆抗体,并在考察了不同结构包被原对 ELISA 方法灵敏度的影响基础上,采用最佳的特征结构异源包被原,建立特异灵敏稳定的 AOZ 间接竞争 ELISAELISA)和直接竞争 ELISAdELISA)检测方法,为进一步开发可满足实际样品不同检测需求的直接和间接竞争 ELISA 试剂盒奠定基础 2 实验部分 2. 1 仪器与试剂 MK3 多功能酶标仪Th 公司);HP1100 液相色谱-质谱联用仪Agn 公司);DRX-600 核磁共振仪Buk 公司);UV-1640A 紫外-可见扫描仪Ky 公司);二氧化碳培养箱Sh-Lb);6K-15 高速收稿; 接受本文系国家自然科学基金 N ) 广东省科技计划项目 N.2009B ,2010A ,2009B )和华南农业大学校长基金 N.5100-K08198)资助 * E-: yun@ u.du.n 2011A 改为

2 分析化学第 40 卷冷冻离心机 Sg 公司 );XSḆ 1A 倒置显微镜上海精密仪器有限公司 ) AOZ 衍生物 p-npaoz 本实验室自制 ); 牛血清蛋白 BSA) 卵清白蛋白 OVA) 二环己基碳二亚胺 DCC) N- 羟基琥珀酰亚胺 NHS) 弗氏完全不完全佐剂 PEG4000 抗体亚类鉴定试剂盒 Sg 公司 );HRP 标记的羊抗小鼠 IgG 抗体博士德生物公司 );RPMI-1640 基础培养基 HAT HTGb 公司 ); 胎牛血清四季青公司 ); 其它化学试剂均为国产分析纯小鼠骨髓瘤 SP20 细胞本实验室保存 ); 雌性 Bb 小鼠 6~8 周龄, 广东省医学实验动物中心 ) 2.2 实验方法半抗原合成半抗原合成路线如图 1 所示半抗原 H 1 和 H 4 :1 AOZ 与乙醛酸或羧基苯甲醛 ) 于 10 L 甲醇中室温反应 2 h, 滤出沉淀, 分别用水和甲醇清洗 3 次, 烘干得半抗原 H 1 或 H 4 ) 半抗原 H 2 :1 对羟基苯甲醛与 1.1 氯乙酸钠于 10 L 0.1 L NOH 溶液中在 90~95 下回流反应 5 h, 冷却, 以 0.5 L HC 调 ph 值至沉淀完全, 滤出沉淀 ; 沉淀采用乙酸乙酯重新溶解, 于分液漏斗中水洗, 乙酸乙酯相经干燥, 除溶剂后, 残余物采用乙酸乙酯 - 石油醚 8 1,VV) 混合溶剂重结晶, 烘干得中间体 IM-1 [10], 并进一步采用 H 1 的合成方法, 与 AOZ 缩合合成得到半抗原 H 2 半抗原 H 3 :1 对羟基苯甲醛溶于 10 L 干燥 DMF, 于 -5 搅拌下加入 2 NH 反应 10 n 后, 滴加 1 L 溴丁酸乙酯, 室温反应过夜反应混合物溶液中加 20 L 甲醇和 0.5 g NOH, 于 60 搅拌下反应 2 h 后, 蒸除溶剂, 加入饱和 NHCO 3 溶液, 乙酸乙酯萃取, 萃余水相滴加 0.5 L HC 调 ph 值至沉淀完全, 过滤, 水洗, 沉淀物烘干得中间体 IM-2 采用 H 1 的合成方法, 将 IM-2 与 AOZ 缩合合成得到半抗原 H 3 图解 1 Sh 1 半抗原合成路线图 Synh u hpn 抗原制备及鉴定采用活泼酯法将半抗原 H 1 ~ H 4 分别与 BSA 或 OVA 偶联, 制备免疫原 H 2- BSA~H 4-BSA 和包被原 H 1-OVA~H 4-OVA; 另外, 采用戊二醛法将 AOZ 直接与 OVA 交联形成包被原 H 5-OVA 抗原的制备及鉴定参考文献 [11,12] 的方法进行免疫程序每种免疫原免疫 3 只 6~8 周龄 Bb 雌鼠 100 g 只 ), 隔 2 周加强免疫一次, 第 4 次免疫后断尾取血, 采用棋盘滴定法测定抗体效价及抑制 [13] [14] 细胞融合与筛选细胞融合及后期筛选亚克隆参考冷泉港实验室手册的方法进行单克隆抗体纯化及特性鉴定筛选的细胞株扩大培养并注射小鼠腹腔诱导腹水, 辛酸 - 硫酸铵法纯化, 采用 Sg 公司鼠单克隆抗体分类试剂盒进行亚型鉴定, 间接 ELISA 测定, 并计算抗体的亲和力常数 KA) [15] ELISA 工作条件优化及标准曲线的建立 1) 间接竞争 ELISA 模式 ELISA 反应程序参照文献 [16] 进行, 通过包被浓度抗体反应时间缓冲液体系缓冲液体系中吐温 -20 含量的优化, 确定 ELISA 工作条件 ; 2) 直接竞争 ELISA 模式采用一步法将 HRP 直接标记在单克隆抗体 [18],ELISA 工作条件优化同间接竞争模式 ; 3) 标准曲线采用最佳 ELISA 工作条件, 以 AOZ 的对硝基苯甲醛衍生物 p-

3 第期任海涛等 : 呋喃唑酮代谢物单克隆抗体制备及酶联免疫吸附分析方法 NPAOZ) 浓度的对数值为横坐标, 以 BB 0 B 为添加药物时的吸光值,B 0 不添加药物时的吸光值 ) 为纵坐标, 按照 BB 0-gC 四参数对数拟合绘制不同包被原条件的 ELISA 标准曲线 [18] 抗体特异性采用间接竞争 ELISA 测定 p-npaoz 及呋喃唑酮结构功能类似物灵敏度, 根据公式 =100 p-npaoz) 类似物 ), 计算交叉反应率 3 结果与讨论 3.1 半抗原抗原设计合成与鉴定合理的半抗原结构是制备高亲和力和高特异性抗体的关键, 而合理的半抗原手臂的偶联位点确保最大限度暴露待测对象分子特征结构, 避免偶联蛋白后被载体蛋白三维结构掩盖, 是动物机体产生特异性免疫应答, 获得高质量抗体的重要因素 [19,20] 本研究选择能充分暴露 AOZ 特征结构的远端苯环对位引入不同长度手臂, 设计合成了免疫半抗原 H 2~H 4 ; 另外, 异源包被可提高待测药物的 ELISA 方法检测灵敏度 [10], 因而设计合成了 H 1-OVA~H 5-OVA 系列包被抗原半抗原 H 1~H 4 的波谱鉴定数据如下 : H 1 : MS ESI ngv): 157 [M -H] - ; 1 H-NMR 600 MH, d 6-DMSO, TMS): δ 7.01, 1H); 4.51,J=7.8 H, 2H); 3.86,J=8.4 H, 2H) H 2 : MS ESI ngv): 266 [M -H] - ; 1 H-NMR 600 MH, d 6-DMSO, TMS):δ12.12, 1H); 7.84, 1H); 7.60 d,j=8.0 H, 2H); , 2H); 7.18 d,j=8.0 H, 2H); 4.51,J=8.0 H, 2H); 3.95,J=8.0 H, 2H); 2.66,J=8.0 H, 2H); 2.36,J=8.0 H, 2H); 1.88 p,j=7.4 H, 2H) H 3 : MS ESI ngv): 295 [M -H] - ; 1 H-NMR 600 MH, d 6-DMSO, TMS): δ 7.82, 1H); 7.67, 1H); 7.65 d,j=8.0 H, 2H); 4.55, 1H); 4.47 d, J=8.0 H, 2H); 4.13, J=8.4 H, 2H); 3.93, J=8.0 H, 2H); 2.34,J=8.0 H, 2H); 1.88,J=9.0 H, 2H) H 4 : MS ESI ngv): 238 [M -H] - ; 1 H-NMR 600 MH, d 6-DMSO, TMS): δ 7.78, 1H); 7.65 d,j=8.0 H, 2H); 6.99 d,j=8.0 H, 2H); 4.48,J=8.0 H, 2H); 3.92,J=8.0 H, 2H) 采用紫外扫描法对免疫抗原 H 2-BSA~H 4-BSA 和包被抗原 H 1-OVA~H 5-OVA 进行鉴定 [11,14] 结果表明, 与相应半抗原和载体蛋白相比, 偶联物免疫和包被抗原 ) 最大吸收峰在 210~ 230 n 及 270~ 285 n 波长范围变化明显, 具有半抗原结构吸收特征, 说明抗原合成成功 3.2 免疫半抗原对抗体特性的影响小鼠免疫 4 次后测定抗血清, 以 H 3-BSA 免疫的抗血清效价和 ELISA 灵敏度最高表 1), 说明连接载体蛋白的 4 个碳原子长度间隔手臂有利于半抗原的充分暴露 ; 另外, 手臂偶联位点位于半抗原特征结构远端, 有利于诱导动物产生高特异性免疫应答表 1 免疫原及包被原对抗血清特性的影响 Tb 1 Inun ungn nd ng ngn n gn nu h 包被抗原 Cng ngn 1 gl) 效价 T H 2-BSA 抑制率 Inhbn 免疫抗原 Iungn 效价 T H 3-BSA 抑制率 Inhbn 效价 T H 4-BSA 抑制率 Inhbn H 1-OVA H 2-OVA H 3-OVA H 4-OVA H 5-OVA 注 N): 效价值为 A 抗血清的稀释倍数 Th h dun nu whn h bbn 450 n w bu 1.0); 抑制率测定时 p-npaoz 添加浓度为 1 gl Th nnn 3-4-nbnydn)n)xdṉ 2-n p-npaoz) 1 gl nhbn dn); OVA: Ovbun 3.3 单克隆抗体纯化及特性鉴定 H 3-BSA 免疫原免疫的小鼠脾脏与其骨髓瘤细胞融合, 间接竞争 ELISA 检测细胞融合率为 85%, 阳性孔为 40% 经 5 次有限稀释筛选到 1 株杂交瘤细胞, 命名为 4C3-H9-E3, 多次传代冻存和复苏其抗体分泌稳定采用辛酸 - 硫酸铵法纯化腹水获得单克隆抗体, 亚型鉴定为 IgG1, 纯化后灵敏度 ) 从

4 分析化学第 40 卷 2.95 gl 提升至 2.51 gl, 表明纯化除去腹水中的杂蛋白有利于抗体更好地识别抗原 ; 另外, 根据文献 [16] 的方法, 测定纯化后的抗体浓度为 6.79 gl, 采用间接 ELISA 测定并抗体亲和力常数 KA 达 L 3.4 ELISA 工作条件优化对包被浓度抗体反应时间缓冲液体系缓冲液中吐温 -20 含量等 4 个工作条件进行优化图 2) [22] 通过比较 Ax 的值大小, 确定了 ELISA 最佳工作条件 :1)ELISA: 包被原浓度为 125 gl 抗体反应时间为 40 n 缓冲液体系为 PBSṮ 0.05% 吐温 -20 2)dELISA: 包被原浓度为 250 gl 抗体反应时间为 40 n 最优稀释溶液体系为 PBSṮ 0.05% 吐温 -20 图 1 不同工作条件对间接竞争 ELISA 方法灵敏度的影响以 ELISA 为例 ) Fg.1 Inun dn wkng ndn n nd ELISA nvy ELISA) 3.5 包被原对 ELISA 灵敏度的影响基于上述最佳 ELISA 工作条件, 考察了不同包被原对间接竞争和直接竞争 ELISA 药物抑制效果表 2) 结果显示, 灵敏度 ) 从高到低表 2 不同包被原对 ELISA 检测的和线性工作范围的影响依次为 H 5-OVA > H 1-OVA > H 4-OVA > Tb 2 Inun dn ng hpn n nd n p H 2-OVA >H 3-OVA, 与包被原和免疫原结 wk 构的异源性大小差异顺序一致, 其中 H 5- OVA 和 H 1-OVA 灵敏度结果相当, 且远大于 H 2-OVA~ H 4-OVA, 说明只含待测物质对象 AOZ 特征结构片段的异源包被, 剔除了苯环, 仅保留了 AOZ 特征结构, 可在充分保留抗原 - 抗体分子识别特异性的前提下, 降低包被抗原与抗体的亲和力, 从包被抗原 Cng ngn 间接竞争 ELISA Ind pv ELISA ELISA)gL) IC 20~IC 80 直接竞争 ELISA D pv ELISA delisa)gl) C 50 IC 20~IC 80 H 1-OVA ~ ~78.48 H 2-OVA ~ ~304.6 H 3-OVA ~ ~531.2 H 4-OVA ~ ~248.3 H 5-OVA ~ ~54.31 而提高抗体竞争识别待测分子的灵敏度 [22] 另外, 由于包被原 H 2-OVA~ H 4-OVA 上的半抗原结构和待测物质主体骨架结构相同, 导致其和抗体的亲和力相当, 从而造成待测物质的 ELISA 竞争检测灵敏度 [23] 不高因此, 本实验选择 H 5-OVA 作为最佳 ELISA 方法的包被原

5 第期任海涛等 : 呋喃唑酮代谢物单克隆抗体制备及酶联免疫吸附分析方法 3.6 方法特异性以呋喃唑酮结构和功能类似的抗生素为待测物, 分别采用 ELISA 和 delisa 模式, 测定药物抑制, 进一步计算交叉反应率,% ) 表示抗体的特异性结果表明, 抗 AOZ 单克隆抗体与功能结构类似的其它硝基呋喃类药物均无交叉反应, 特异性良好表 3) 另外, 唯一出现交叉反应的是呋喃唑酮原药, 但作为检测呋喃唑酮代谢物的方法, 检测其代谢物最终也是为了说明呋喃唑酮的使用与否因此, 与原药的交叉并不影响对监测结果的判定表 3 ELISA 方法的单克隆抗体特异性测定 Tb 3 Spy nn nbd ELISA 结构式 Suu u 间接竞争 ELISA ELISA) gl) 直接竞争 ELISA delisa) gl) 结构式 Suu u 间接竞争 ELISA ELISA) gl) 直接竞争 ELISA delisa) gl) < <0.1 > <0.01 > <0.01 > <0.01 > <0.01 > <0.01 > <0.01 > <0.01 > <0.01 > <0.01 > <0.01 > <0.01 > <0.01 > <0.01 > < 标准曲线的建立以 125 gl H 5-OVA 为异源包被原, 基于前述 ELISA 最佳工作条件, 分别建立了检测 p-npaoz 的 ELISA 和 delisa 方法标准曲线图 4 ) 在 ELISA 模式下, 为 gl 相对于 AOZ gl), 定量检测线性范围为 IC 20 ~IC 80 )0.14~ gl 相当于 AOZ 0.060~13.95 gl) 检出限为 0.04 gl 相当于 AOZ gl); 在 delisa 模式下, 采用一步法, 以 HRP 直接标记抗体, 形成异源包被 delisa 模式, 为 2.74 gl 相当于 AOZ gl), 定量检测线性范围为 0.33~54.31 gl 相图 4 ELISA 标准曲线当于 AOZ 0.143~23.57 gl), 检出限为 0.13 gl 相当 Fg.4 ELISA ndd uv 于 AOZ gl), 虽然可能因减少了 ELISA 检测时二抗的放大效应造成灵敏度相对间接竞争略有降低, 但减少了加入酶标抗体的步骤, 缩短了操作时间 4 结论基于设计合成的新颖免疫半抗原 H 3, 成功制备获得了具有高亲和力高特异性的抗 AOZ 单克隆抗体同时, 在考察了不同结构包被原对 ELISA 方法灵敏度的影响基础上, 采用最佳的仅含 AOZ 特征结构片段的异源包被原 H 5-OVA, 建立了 AOZ 的 ELISA 和 delisa 检测方法, 检测灵敏度和定量线性范围均达到相关检测限量要求, 为开发满足实际样品不同检测需求的直接和间接竞争 ELISA 试剂盒奠定基础

6 分析化学第 40 卷 Rn 1 VM,HukK,Fnk M.VnnMdn,2008,539):469~500 2 XU Y-Png,XU ChuṉL.FdSn,2007,2810):590~593 徐一平, 胥传来. 食品科学,2007,2810):590~593 3 BbJ,MuS,BbR,RF.An.Ch.A,2007,5861-2):359~365 4 RdwL.J.Chg.B,2008,8641-2): ZhuH P,LuT T,LuB,YnH L,LXL,WngL,WngS.Chn.Ch.L.,2010,219):1049~ ChngC,PngDP,WuJE,WngYL,YunZ H.J.Ag.FdCh.,2008,5612):1525~ CpK M,CddA,ECT,KnndyD G.An.Ch.A,2004,5201-2):79~86 8 LuY,HungLL,WngYL,YngB,IhnA,FngK,PngDP,LuZL,DM H,YunZH.J.Ag. FdCh.,2010,5811):6774~ DbkvI,CpK M,KnndyD G,Fnk M.An.Ch.A,2005,5402):285~ WANG Yu,SHEN Yu-Dng,XUZhṉLn,LEIHng-T,WANG Hng,SUN Yuṉ Mng.ChnJ.An. Ch.,2010,383):313~317 王宇, 沈玉栋, 徐振林, 雷红涛, 王弘, 孙远明. 分析化学,2010,383):313~ K YJ,ChY A,LH S,LY T,GSJ,HkBD.An.Ch.A,2003,4751-2):85~ SnghK V,KuJ,VhnyGC,RjM,Su.BnjugCh.,2004,151):168~ LuY,PngDP,HungLL,WngYL,ChngC,IhnA,TYF,YngB,YunZH.An.Ch.A, 2010,6642):151~ HwE,LnD.Anbd:ALbyMnu.CdSpngHbLbyP,CdSpngHb, Nw Yk,1988:1~ JW G.MnnAnbd:PnpndP.AdP,InLd,1983:142~ PENGFng-Y,JIANG H-Rng,CHEN YuṉXng,CHENShng-Zhn,LINZh-Hu,LIAO P,HE M, SHIHṉChng,CAIQng.ChnJ.An.Ch.,2010,3812):1737~1741 彭方毅, 姜海蓉, 陈远翔, 陈胜珍, 林治华, 廖璞, 何苗, 施汉昌, 蔡强. 分析化学,2010,3812):1737~ ZhuL-Png,ChnXu-Qng.Iungyxpnhd.Pp ydp,2000:351~357 朱立平, 陈学清. 免疫学实验方法. 人民军医出版社,2000:351~ GngJP.IunyA PApph.A:OxdUnvyP.2000:41 19 KngpngL,FuK,KgT,End M,MM.FhSn,2008,745):1055~ XIEGu-Mn,SUN Yuṉ Mng,XUZhṉLn,LIYng-Xng,LEIHng-T,WANG Hng,SHEN Yu-Dng. Ch.J.Chn.U.,2009,3011):2193~2198 谢桂勉, 孙远明, 徐振林, 李永祥, 雷红涛, 王弘, 沈玉栋. 高等学校化学学报,2009,30 11):2193~ WANGB-Lng,YUAN L-Png,LEIHng-T,XU ZhṉLn,YANGJṉY,SUN Yuṉ Mng,DING Wu, PANGJ.FdSn,2010,3120):270~274 王保玲, 袁利鹏, 雷红涛, 徐振林, 杨金易, 孙远明, 丁武, 庞杰. 食品科学,2010,3120):270~ LJ,LuJ,ZhngH C,LH,WngJP.An.Ch.A,2010,6781):1~6 23 XuZL,XG M,LY X,WngBF,BRC,LH T,WngH,ShnY D,SunY M.An.Ch.A, 2009,6471):90 ~96

7 第期任海涛等:呋喃唑酮代谢物单克隆抗体制备及酶联免疫吸附分析方法 P du nndi d n n Mn n An bdy Ag n Fu dnm b ndd v pn En -L nk diun b n A y y REN H n,yangj n -T,SHEN Yu -Dng,XU Zhn -L -Y,LEIHng -T, XIAOZh,WANG Hng,SUN Yun ng* -L -M KyLb y F dqu v n C g F ds n, ynds y Gungdng P,, ) Su hch nag u u Un v n y Gunghu Ch 改为:Th ubyp nd ny nn nbdy w pvy IgG1 nd L. Ab Sv nwhp n u dn b 3 n 2 x dnn AOZ)w yn h dndup d bv n u bu n BSA) ungnndu d un B b.a n ngn n n bdy hp n H3 w b ndby -AOZ n u nnd n ng.th n bd w , hub I h n yp w gg1nd y n n w qu L.Th n n n bdyb nd w h gh yp AOZ.Fu h,b dn nv ng h h gyndh gu ngn g gn w hd n u u n heli SA n v nd p veli SA ELI SA)ndd y, p velisa delisa) hd u db b hdw hh5-ova hb h ngn d nnd n ng AOZw gl, gu gn.thic50,, glnd g L ELI SAnd g L g Lnd g L deli SA, p v h ELI SA n h v d qu n x u du y.b ) MRL AOZndp v dp n nd n v p dun y hd d AOZ n d. K w d Fu dn;mn n n bdy;en nkdun bn y;h gnu y y - n gn R vd29ap 2011; p d30nvb 2011)

第期甘金华等强力霉素人工抗原的合成与抗体制备材料与方法试剂及溶液

第期甘金华等强力霉素人工抗原的合成与抗体制备材料与方法试剂及溶液第卷第期年月食品与生物技术学报强力霉素人工抗原的合成与抗体制备甘金华邓薇李进平艾晓辉中国水产科学研究院长江水产研究所湖北荆州武汉纺织大学环境与城建学院湖北武汉采用改进的碳二亚胺两步法将强力霉素半抗原与载体蛋白连接制备强力霉素牛血清白蛋白人工免疫抗原并用同样方法将强力霉素与载体蛋白连接制备人强力霉素卵清白蛋白人工包被抗原经紫外扫描分析和动物免疫试验证实强力霉素人工抗原合成成功