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森虎孟
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1 第 40 卷分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究第期 2012 年月 Chinese Journal of Analytical Chemistry ~ DOI: /SP.J S,S- 氰戊菊酯间接竞争酶联免疫吸附分析方法研究张斌王鸣华 * ( 南京农业大学植物保护学院, 江苏省农药学重点实验室, 农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室, 南京 ) 摘要合成了 S,S- 氰戊菊酯的半抗原 S-2-(4- 氯苯基 )-3- 甲基丁酸 -α-s-(n- 丁酸基 )- 甲酰氨 -(3- 苯氧基 ) 苄酯 (Efvb) 半抗原通过混合酸酐法与卵清蛋白 (OVA) 偶联作为包被抗原, 活泼酯法与牛血清蛋白 (BSA) 偶联作为免疫抗原用免疫抗原免疫新西兰大白兔, 得到抗 S,S- 氰戊菊酯多克隆抗体通过异源分析及检测条件优化, 确立了间接竞争酶联免疫分析方法的最佳检测条件为 ph 7.4,0.4 mol/l Na + 40% 甲醇 PBS 溶液, 建立了 S,S- 氰戊菊酯酶联免疫分析方法方法的 IC 50 值为 (3.16± 0.01)mg/L; 检出限 (IC 10 ) 为 (0.0053± )mg/L 对甲氰菊酯溴氰菊酯氯氰菊酯功夫菊酯及其代谢物戊菊酸没有明显交叉反应在自来水河水和土壤样品中添加 S,S- 氰戊菊酯, 其回收率分别为 82.3% ~108.2%,83.1% ~109.2%,72.0% ~91.2% 关键词 S,S- 氰戊菊酯 ; 半抗原 ; 酶联免疫吸附分析 1 引言 S,S- 氰戊菊酯 (Esfenvalerate) 是氰戊菊酯的 4 种立体异构体中活性最高的一种 [1], 生物活性约为氰戊菊酯的 4 倍 [2] S,S- 氰戊菊酯对哺乳动物低毒, 但对水生生物高毒 [3], 其广泛应用于农业生产, 进入水环境的途径也日益增多因此, 建立简单快速的检测方法非常必要我国对 S,S- 氰戊菊酯的残留检测以气相色谱法为主 [4,5], 此方法需要精密仪器, 不适合大批量样品的快速测定酶联免疫分析方法成本低速度快, 适合大批量样品的快速分析, 可为 S,S- 氰戊菊酯的残留检测和监控提供极大的便利 [6] 目前, 对立体异构体的免疫分析研究很少,Shan 等将 3-[4-(3- 甲酰苯氧基 ) 苯基 ] 丙酸苄酯与 S- 戊菊酸联接, 通过酯水解制得半抗原此方法保留了菊酸部分的一个手性位点, 所得的抗体对 S,S- 氰戊菊酯有较高灵敏度本研究用 S,S- 氰戊菊酯直接水解接臂, 制得半抗原, 保留了 S,S- 氰戊菊酯的两个手性位点, 通过免疫新西兰大白兔获得特异性抗体, 经过异源分析及检测条件优化, 建立了 S,S- 氰戊菊酯酶联免疫分析方法此抗体对 S,S- 氰戊菊酯立体识别特异性强在自来水河水和土壤样品中添加回收率和相对标准偏差均符合农药残留分析要求, 可用于水样和土壤样品中 S,S- 氰戊菊酯的测定 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 HṮ 5 多功能搅拌器 ( 江苏荣华仪器有限公司 );Ṟ 200 旋转蒸发仪 ( 瑞士 BüCHI 公司 );DU800 核酸 / 蛋白分析仪 ( 美国 Beckman 公司 );LC-MS QDECA 液质联用仪 ( 美国 Finnigan 公司 );DRX 500 核磁共振仪 ( 美国 Bruker 公司 );Avanti J-26XP 高速冷冻离心机 ( 美国 Beckman 公司 );Professional Meter PP-50 型 ph 计 ( 德国 Sartorius 公司 );Wellwash Plus 型洗板机 ( 美国 Thermo 公司 );imark 酶标仪 ( 美国 Bio-Rad 公司 ) S,S- 氰戊菊酯 ( 江苏皇马农化有限公司 ); 氰戊菊酯 ( 南京红太阳股份有限公司 );S- 戊菊酸及 R- 戊菊酸 ( 江苏科达化工有限公司 );4- 氨基丁酸 ( 国药集团化学试剂有限公司 ); 牛血清蛋白 (BSA) 卵清蛋白 (OVA, 上海索莱宝生物科技有限公司 ); 山羊抗兔 IgG-HRP( 美国 Sigma 公司 ); 邻苯二胺 (OPD) 及吐温 -20 (TweeN-20)(Sigma 公司 ), 其它试剂为分析纯半抗原甲氰菊酯氰基水解产物 (Fpa) 溴氰菊酯氰基水解产物 (Dta) 和功夫菊酯氰基水解产物 (Cya), 合成方法参考文献 [7] 磷酸盐缓冲液 (PBS,0.01 mol/l,ph 7.4) 碳酸盐缓冲液 (CBS,0.05 mol/l,ph 9.6) 含 0.05% 吐温 -20 的 PBS 溶液 (PBST) 实验动物 : 雄性新西兰收稿 ; 接受本文系江苏高校优势学科建设工程资助项目 * wangmha@ njau.edu.cn

2 分析化学第 40 卷大白兔 2.2 实验方法半抗原的合成合成路线如图解 1 所示取 5.9 g (14 mmol)s,s- 氰戊菊酯和 3 ml 水于 150 ml 三口瓶中, 缓慢滴加 8 ml 浓 H 2 SO 4, 于 90 回流搅拌反应 50 min 加入 10 ml 水, 用乙醚萃取两次, 有机相减压浓缩, 得深黄色油状物薄层层析纯化, 展开剂为乙酸乙酯 - 石油醚 - 乙酸 ( ,V/V),Rf =0.51 的组分用丙酮洗脱浓缩, 得黄色的油状物 S-2-(4- 氯苯基 )-3- 甲基丁酸 -α-s- 羧基 -3- 苯氧基苄酯 (Efva), 产率约为 30% 称取 2.0 g(4.5 mmol)efva 于 100 ml 三口烧瓶中, 加入 5 ml 氯化亚砜, 在 79 回流搅拌反应 2.5 h 减压浓缩, 得黄色油状液体, 加入 15 ml 无水四氢呋喃溶解, 于 4 下贮存备用称取 0.3 g(2.98 mmol)4- 氨基丁酸于 100 ml 平底烧瓶中, 加入 2 ml 2 mo1/l NaOH 溶液, 在冰浴中搅拌 20 min 后, 加入 0.02 g 四丁基溴化铵搅拌下滴加酰氯的四氢呋喃溶液, 同时测定体系 ph 值, 滴加 NaOH 溶液保证反应液 ph>8 在冰浴中继续搅拌反应 4 h 用浓 HCl 调至 ph 2.0,2 30 ml 乙酸乙酯萃取,2 10 ml 水洗, 无水 Na 2 SO 4 干燥, 减压浓缩, 得到黄色的油状物薄层层析纯化展开剂为乙酸乙酯 - 石油醚 - 乙酸 ( ,V/V),Rf =0.36 组分用丙酮洗脱浓缩, 得黄色油状产物 S-2-(4- 氯苯基 )- 3- 甲基丁酸 -α-s-(n- 丁酸基 )- 甲酰氨 -(3- 苯氧基 ) 苄酯 (Efvb), 产率约为 25% 图解 1 S,S- 氰戊菊酯半抗原的合成路线 Scheme 1 Synthesis scheme of the haptens for esfenvalerate 人工抗原的制备与偶联比的测定采用混合酸酐法将半抗原与卵清蛋白 (OVA) 偶联制得包被抗原, 采用活泼酯法将半抗原 Efvb 与牛血清蛋白 (BSA) 偶联制得免疫抗原 [7,8] 反应结束后, 将反应液置于 PBS 溶液中, 在 4 下透析 3 d, 每天换液 3 次透析物于 -20 保存根据蛋白半抗原和偶联物在紫外扫描图下吸收光谱的变化判断偶联是否成功, 按文献 [9] 的方法计算偶联比 [10,11] 抗体的制备和纯化人工抗原按常量法免疫健康新西兰大白兔, 分离抗血清, 辛酸 - 硫酸铵法纯化抗体 [12] 冷冻干燥, 制得冻干粉 [13] 抗体效价测定及工作浓度选择采用间接非竞争酶联免疫分析法测定冻干粉效价方阵滴 [13] 定法确定包被抗原和抗体的最佳工作浓度选择包被抗原 4 mg/l,od 时的冻干粉稀释倍数为抗体效价选择 OD 490 值最接近 1.0 时的抗原抗体的浓度为抗原抗体的最佳工作浓度间接竞争酶联免疫分析 (ic-elisa) 采用间接竞争酶联免疫分析法 [11] 用 CBS 缓冲液将包被抗原稀释成相应最佳工作浓度后, 包被在 96 孔酶标板上,100 ml/ 孔,4 过夜经 PBST 洗涤 3 次 ( 下同 ), 加入 1% OVA 的 PBS 封闭液,200 ml/ 孔,37 下温育 0.5 h 洗涤 3 次, 加入系列浓度 S,S- 氰戊菊酯溶液,50 ml/ 孔加入经 PBS 稀释成最佳工作浓度的抗体溶液,50 ml/ 孔,37 温育 45 min 洗涤 3 次后加入经 PBS 稀释 3000 倍的酶标二抗,100 ml/ 孔,37 温育 45 min 加入 OPD-H 2 O 2 底物溶液, 100 ml/ 孔,37 显色 15 min 后加入 2 mol/l H 2 SO 4 终止液,50 ml/ 孔, 酶标仪于 490 nm 波长处读取吸光度值以结合率 B/B0(B=OD X -OD min,b0=od max - OD min,od max 为不加药时的吸光值,OD X 为 S,S- 氰戊菊酯浓度为 x 时的吸光值,OD min 为本底对照的吸光值 ) 为纵坐标,S,S- 氰戊菊酯浓度对数值为横坐标, 绘制出各竞争抑制曲线, 求出抑制中浓度 (IC 50 ) 添加回收率测定水样的添加回收率 : 取 10 ml 自来水及经过滤的当地河水, 于 100 ml 三角瓶中, 添加 S,S- 氰戊菊酯浓度为 10.0;1.0 和 0.1 mg/l, 取 5 ml 上述溶液, 用 80% 甲醇 PBS 溶液稀释一倍

3 第期张斌等 :S,S- 氰戊菊酯间接竞争酶联免疫吸附分析方法研究后进行测定土壤样品的添加回收率 : 取 10 g 风干的棕壤土于 100 ml 具塞三角瓶中, 添加 S,S- 氰戊菊酯浓度为 10.0, 1.0 和 0.1 mg/l, 加入 20 ml 水,30 ml 石油醚,30 ml 丙酮, 振荡 12 h 后抽滤, 滤液倒入 [14] 100 ml 具塞量筒中, 分层后吸取 1/2 上层液体减压浓缩, 用 40% 甲醇 PBS 溶液稀释后测定 3 结果与讨论 3.1 半抗原分子结构鉴定半抗原经液相色谱 - 质谱 (LC/MS) 和核磁共振 ( 1 H-NMR) 进行结构表征, 确证了产物结构半抗原 Efvb 的 MS:Found m/z 546[M+Na],M=523 1 H-NMR:δ 7.00~7.41(m, 13H, Ar H ),6.96 (m,1h, NH ),5.90(s, 1H, CH O ),3.48(m, 1H, CHCO),3.22(m, 2H, CH 2 N),2.27(m, 1H, CH),2.09(m, 2H, CH 2 COO),1.72(m, 2H, CH 2 ),0.98,1.07(s, 6H, 2 CH 3 ) 3.2 人工抗原的鉴定及偶联比的测定与半抗原和载体蛋白相比, 偶联物的紫外扫描吸收光谱发生了明显变化, 证明偶联成功免疫抗原 Efvḇ BSA 的偶联比为 16 1 包被抗原 Efva-OVA, Fpa-OVA, Dta-OVA 和 Cya-OVA 的偶联比分别为 10 1, 15 1, 12 1 和抗体效价测定及工作浓度选择包被抗原分别为 Efva-OVA, Fpa-OVA, Dta-OVA 和 Cya-OVA 时, 抗体效价分别为 , , 和 , 包被抗原与抗体的最佳工作浓度分别为 2.00 和 1.56 mg/l, 4.00 和 6.25 mg/l, 2.0 和 mg/l, 2.0 和 mg/l 包被抗原为 Efva-OVA 时, 抗体效价最高, 原因是此包被抗原与免疫抗原结构最接近, 导致包被抗原与抗体的亲和力最高 3.4 异源分析在最佳工作浓度条件下, 进行异源分析结果显示,Efvḇ BSA/Fpa-OVA 组合 IC 50 值最小, 选定为最优组合进行后续测定从抗体与几种包被抗原的组合分析可以看出, 包被抗原与免疫抗原结构差异越大, 灵敏度越高原因可能是包被抗原与免疫抗原差异越大, 包被抗原与抗体的亲和力就越低, 相应提高了分析物与抗体结合的竞争力 3.5 条件优化及标准曲线的建立用 ph 为 5.4, 6.4, 7.4, 8.4 和 9.4,Na + 浓度分别为 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 和 0.5 mol/l 的 PBS 缓冲溶液稀释抗体, 用甲醇含量分别为 20%, 30%, 40% 和 50% 的 PBS 缓冲液配制 S,S- 氰戊菊酯标准溶液, 采用间接竞争酶联免疫分析法, 分别绘制标准曲线考察 ph 值离子强度甲醇含量对酶联免疫分析的影响, 确定最优的 ELISA 分析条件结果表明, 当 PBS 缓冲液的 ph=7.4 甲醇含量为 40%,Na + 浓度为 0.4 mol/l 时,IC 50 值最低在此条件下, 建立 S,S- 氰戊菊酯的标准竞争曲线标准曲线回归方程为 Y= X (R 2 =0.9777), 抑制中浓度 IC 50 为 (3.16±0.01)mg/L, 检出限 IC 10 为 (0.0053±0.0012) mg/l 3.6 交叉反应率的测定测定 S,S- 氰戊菊酯及类似物的 IC 50, 计算交叉反应率 (CR) CR 为 S,S- 氰戊菊酯的 IC 50 与类似物的 IC 50 的百分比抗体对半抗原氰戊菊酯戊菊酸及其它 4 种拟除虫菊酯的交叉反应见表 1 从表 1 的交叉反应率可见, 抗体与甲氰菊酯溴氰菊酯功夫菊酯和氯氰菊酯没有交叉反应抗体对 S- 戊菊酸有一定识别能力, 对 R- 戊菊酸几乎没有识别, 而氰戊菊酯抗体对戊菊酸的交叉反应高达 35.2% [7] 抗体对两种构型戊菊酸及氰戊菊酯的交叉反应值均证明了构型对抗体特异性具有明显的影响, 这与文献 [6] 的结果一致抗体对 S- 戊菊酸的交叉反应数据比 R- 戊菊酸大 40 倍以上, 证明了 S,S- 氰戊菊酯菊酸部分构型对抗体的特异性识别起决定性作用抗体对氰戊菊酯的交叉反应数据接近 S,S- 氰戊菊酯的 1/4, 而氰戊菊酯中 S,S- 氰戊菊酯恰好占 1/4, 说明抗体对于其它 3 种立体构型的氰戊菊酯几乎没有识别抗体对构型的选择性结果优于文献 [6] 交叉反应数据证明了抗体对 S,S- 氰戊菊酯的高度特异性 3.7 添加回收率测定在自来水河水和土壤样品中添加 0.1, 1.0 和 10.0 mg/l(mg/kg) 的 S,S- 氰戊菊酯, 回收率分别为 82.3% ~108.2%, 83.1% ~109.2% 和 72.0~91.2% ( 表 2) 土壤中添加低浓度 S,S- 氰戊菊酯时平均回收率

4 分析化学第 40 卷表 1 交叉反应 Table 1 Cross-reactivities (CR) 化合物 Compound 抑制中浓度 IC 50(mg/L) 交叉反应 CR (% ) 化合物 Compound 抑制中浓度 IC 50(mg/L) 交叉反应 CR (% ) 0.09 > Efvb Efva S,S- 氰戊菊酯 Esfenvalerate 氰戊菊酯 Fenvalerate S- 戊菊酸 S-Fenvalerate acid R- 戊菊酸 R-Fenvalerate acid 甲氰菊酯 Fenpropathrin 溴氰菊酯 Deltamethrin 功夫菊酯 Cyhalothrin 氯氰菊酯 Cypermethrin 偏低, 是由于土壤中的杂质对低浓度药物的影响相对较大自来水河水和土壤样品中添加回收率和相对标准偏差均符合农药残留分析要求, 本方法可用于水和土壤样品中 S,S- 氰戊菊酯的测定研究结果表明, 本研究制备了 S,S- 氰戊菊酯多克隆抗体, 对 S,S- 氰戊菊酯具有较好的特异性, 与其它拟除虫菊酯和 R- 戊菊酸几乎没有交叉反应, 而与 S- 戊菊酸和氰戊菊酯有一定的交叉反应, 证明了远离结合位点的手性中心决定了抗体的立体选择性本研究为 S,S- 氰戊菊酯检测试剂盒的开发及异构体农药的酶免疫分析奠定了理论和实践基础表 2 S,S- 氰戊菊酯在样品中的添加回收率 Table 2 Recovery of esfenvalerate in samples 样品 Sample 自来水 Tap water 河水 River water 土壤 Soil 添加浓度 Spiked concentration (mg/l) 平均回收率 Average recoveries (%,n=4) 相对标准偏差 RSD (% ) References 1 WANG Ming-Hua.ChemistryofPyrethroids.Beijing:China sagriculturalscienceandtechnologypress,2004, 197~198 王鸣华. 拟除虫菊酯化学. 北京 : 中国农业科学技术出版社,2004:197~198 2 WU Yi-Dong,YANG Yi-Hua,CHENJin,SHENJiṉLiang.Journalof NanjingAgriculturalUniversity,1997, 20(4):40~43 吴益东, 杨亦桦, 陈进, 沈晋良. 南京农业大学学报,1997,20(4):40~43 3 LozanoSJ,HalranSL,SargentK W.Environ.Toxicol.Chem.,1992,11(1):35~47

5 第期张斌等 :S,S- 氰戊菊酯间接竞争酶联免疫吸附分析方法研究 4 CAO Ai-Hua,XU Guang-Jun,LIU Bao-An,FENG Tao.ChineseTobaccoScience,1997,18(1):44~47 曹爱华, 徐光军, 刘保安, 冯涛. 中国烟草科学,1997,18(1):44~47 5 LIU WeṉTao,SUN Wei-Qi,YANGDai-Jin,ZHAO Yu-Cui.ShandongAgriculturalScience,2008,(2):95~97 刘文涛, 孙伟奇, 杨代金, 赵玉翠. 山东农业科学,2008,(2):95~97 6 Guo M S,Donald W,Ingrid W.J.Agric.FoodChem.,1999,47(5):2145~ LuX Q,ZhangB H,ShiH Y,Wang M H.FoodAgr.Immunol.,2009,20(2):147~154 8 ZHU Guo-Nian,YANG Ting,WU YiṉLiang.ScientiaAgriculturaSinica,2002,35(8):1025~1029 朱国念, 杨挺, 吴银良. 中国农业科学,2002,35(8):1025~ YANGLi-Guo.TechniquesofEnzymeImmunoasay.Beijing:NanjingUniversityPress,1998:279~283 杨利国. 酶免疫测定技术. 北京 : 南京大学出版社,1998:279~ SHI Hai-Yan,WU Hui-Ming,CHENGJing-Li,ZHU Guo-Nian.ChineseJournalof PesticideScience,2004, 6(2):20~24 施海燕, 吴慧明, 程敬丽, 朱国念. 农药学学报,2004,6(2):20~24 11 WANGJuṉDong,SHIHai-Yan,WANG Ming-Hua.ChineseJ.Anal.Chem.,2009,37(1):82~86 王俊东, 施海燕, 王鸣华. 分析化学,2009,37(1):82~86 12 ZHU Guo-Nian,WU Gang,WU Hui-Ming.ScientiaAgriculturaSinica,2003,36(6):657~662 朱国念, 吴刚, 吴慧明. 中国农业科学,2003,36(6):657~ LIBo,SHIHai-Yan,WANG Ming-Hua.ChineseJ.Anal.Chem.,2008,36(1):34~38 李波, 施海燕, 王鸣华. 分析化学,2008,36(1):34~38 14 WANGJun,WAN Yu,XIONGChuaṉ Wu.AnhuiChemicalIndustry,2009,35(2):60~62 王军, 万宇, 熊传武. 安徽化工,2009,35(2):60~62 AnIndirectCompetitiveEnzyme-LinkedImmunosorbent AsayforEsfenvalerate ZHANGBin,WANG Ming-Hua * (DepartmentofPlantProtection,NanjingAgriculturalUniversity,JiangsuKeyLaboratoryofPesticideScience, KeyLaboratoryofIntegrated ManagementofCropDiseasesandPests,MinistryofEducation,Nanjing210095) Abstract ThehaptenofS-α-(3-carboxy-propylcarbamoyl)-3-phenoxybenzyḻ S-2-(4-Chlorophenyl)-3- methylbutyriate(efvb)wassynthesized.thehaptens wereconjugated withovalbumin (OVA)as coatingantigensbymixedanhydridemethodandwithbovineserumin(bsa)asimmunogenbyactive ester method.anantibodyagainstesfenvalerate wasgenerated byimmunizingthe New Zealand rabbits.aftertheheterologousassaysandtheoptimization,theconditionsofph 7.4,0.4 mol/l Na +,40% methanolwereselectedastheoptimumassayconditionforthedeterminationofesfenvaleratebytheindirectcompetitiveenzymeḻinkedimmunosorbentassay(ic-elisa).theic50foresfeṉ valeratewas3.16±0.01 mg/l,andthedetectionlimit(ic10)was (0.0053±0.0012)mg/L.Feṉ propathrin,deltamethrin,cyhalothrin,cypermethrinandtheacidofesfenvalerate metaboliteshave notsignificantlycrossṟeaction withantibodyusedinthisassay.whentheesfenvaleratestandards wereaddedtothetapwater,riverwaterandsoilsamples,theaveragerecoverieswereintherangeof 82.3%-108.2%,83.1%-109.2%,72.0%-91.2%,respectively. Keywords Esfenvalerate;Hapten;Enzymeḻinkedimmunosorbentassay (Received2June2011;accepted21September2011)

第期甘金华等强力霉素人工抗原的合成与抗体制备材料与方法试剂及溶液

第期甘金华等强力霉素人工抗原的合成与抗体制备材料与方法试剂及溶液第卷第期年月食品与生物技术学报强力霉素人工抗原的合成与抗体制备甘金华邓薇李进平艾晓辉中国水产科学研究院长江水产研究所湖北荆州武汉纺织大学环境与城建学院湖北武汉采用改进的碳二亚胺两步法将强力霉素半抗原与载体蛋白连接制备强力霉素牛血清白蛋白人工免疫抗原并用同样方法将强力霉素与载体蛋白连接制备人强力霉素卵清白蛋白人工包被抗原经紫外扫描分析和动物免疫试验证实强力霉素人工抗原合成成功