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峨促常
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1 中国农业科学 2015,48(19): Scientia Agricultura Sinica doi: /j.issn 动物尿液中苯乙醇胺 A 胶体金快速检测方法的建立聂雯莹 , 罗晓琴, 李金超, 李行, 吴广, 王琳琛 ( 1 北京勤邦生物技术有限公司, 北京 ; 2 河北省兽药监察所, 石家庄 ) 摘要 : 目的苯乙醇胺 A 为一种新型违禁添加剂, 目前的检测方法繁琐耗时, 故建立动物尿液中苯乙醇胺 A 胶体金免疫层析快速检测方法方法通过苯乙醇胺 A 与溴代戊醛发生亲核取代反应, 制备得到苯乙醇胺 A 半抗原, 将苯乙醇胺 A 半抗原与载体蛋白偶联得到免疫原和包被原, 经 TNBS 法测定半抗原与载体蛋白偶联比用免疫原免疫 BALB/c 小鼠, 制备特异性单克隆抗体, 采用间接竞争 ELISA 方法测定单克隆抗体的灵敏度选取与苯乙醇胺 A 结构类似的 13 种同类药物利用间接竞争 ELISA 方法进行单克隆抗体特异性的测定, 计算交叉反应率并通过胶体金单克隆抗体 - 胶体金标记物结合物释放垫反应膜样品吸收垫的制备以及试纸条的组装, 建立了动物尿液中苯乙醇胺 A 胶体金快速检测方法, 测定试纸条的检测限假阳性率假阴性率以及与 ELISA 方法的检测猪尿样品结果比较, 验证试纸条的准确度, 其中 ELISA 方法的标准品浓度分别为 μg L -1, 对猪尿样品的最低检测限为 0.5 μg L -1, 回收率为 75% 105% 结果苯乙醇胺 A 半抗原制备结果显示从苯乙醇胺 A 的氨基端引入末端代醛基的连接臂, 得到苯乙醇胺 A 衍生物, 即苯乙醇胺 A 半抗原 TNBS 法测定结果显示苯乙醇胺 A-BSA 和苯乙醇胺 A-OVA 成功偶联, 苯乙醇胺 A 半抗原 -BSA 偶联比为 11.38, 苯乙醇胺 A 半抗原 -OVA 偶联比为间接 ELISA 检测结果显示 MC-73 杂交瘤细胞株的上清效价为 1:2 10 3, 腹水效价为 1:5 10 7, 较 MC-33 和 MC-29 的效价高, 抗苯乙醇胺 A 单克隆抗体对苯乙醇胺 A 的 IC50 为 μg L -1, 较 MC-33 和 MC-29 的 IC50 低, 得到 MC-73 单克隆抗体腹水灵敏度最高苯乙醇胺 A 单克隆抗体与克仑特罗莱克多巴胺和沙丁胺醇等共 13 种苯乙醇胺 A 的同类化合物的交叉反应率均小于 1%, 试纸条检测限为 5 μg L -1, 假阳性率为 0, 假阴性率为 0 检测实际动物尿液样品时, 试纸条与 ELISA 测定结果没有差异结论成功研制出灵敏特异简便快速的苯乙醇胺 A 胶体金免疫层析试纸条, 可直接检测动物尿液, 无需样品前处理, 反应只需 5 min 即可得到检测结果适合中国基层兽药检测实验室和企业大批量样品集中筛查及现场检测关键词 : 苯乙醇胺 A; 胶体金免疫层析 ; 快速检测试纸条 ; 动物尿液 Establishment of a Detection Method for the Immune Colloidal Gold of Phenylethanolamine A in Animal Urine NIE Wen-ying 1, LUO Xiao-qin 1, LI Jin-chao 2, LI Hang 1, WU Guang 1, WANG Lin-chen 1 ( 1 Beijing Kwinbon Biotechnology Co., Ltd, Beijing ; 2 Hebei Province Institute of Veterinary Drug Control, Shijiazhuang ) Abstract: Objective The aim of the study is to establish a detection method for the immune colloidal gold of phenylethanolamine A in animal urine. Method Phenylethanolamine A hapten was synthetized by nucleophilic substitution with phenylethanolamine A and bromo aldehyde. Phenylethanolamine A hapten was coupled with BSA and OVA, respectively, to prepare immunogen and envelope antigen. The coupling ratio of hapten-bsa/ova was determined by TNBS. Monoclonal antibody was acquired from mice which were immunized with hapten-bsa. The indirect ELISA method has been established for sensitivity and 收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 国家十二五科技支撑计划 (2012BAF14B00) 联系方式 : 聂雯莹,Tel: ; kwinbonnwy@163.com 通信作者罗晓琴,Tel: ; luoxiaoqin@kwinbon.com

2 3932 中国农业科学 48 卷 specificity detection of monoclonal antibody. A total of 13 compounds whose structures were similar with phenylethanolamine A were used to test the specificity and calculate the cross reaction rate of monoclonal antibody. A rapid detection method for immune colloidal gold of phenylethanolamine A in animal urine was established by the parts of strip prepared and assembled. The strip s detection limits, false positive rate and false negative rate were determined. Compared the immunochromatography assay (ICA) with ELISA whose limited ranges of standards concentration were 0, 0.1, 0.3, 0.9, 2.7 and 8.1 μg L -1, the detection limits for pig urine was 0.5 μg L -1 and the ranges of percent recovery were 75%-105%. Result Phenylethanolamine A derivative was prepared that amino terminal of phenylethanolamine A connected with the connecting arm whose aldehyde group was on the end. Phenylethanolamine A hapten connected with BSA and OVA successfully by TNBS and the coupling ratio between hapten with BSA and OVA were and 10.66, respectively. The titer and ascites of MC-73 hybridoma cell strain were 1: and 1: which were higher than MC-33 and MC-29. IC 50 of monoclonal antibody against phenylethanolamine A was μg L -1 which was more sensitive than MC-33 and MC-29. The cross reaction rate with 13 compounds whose structures were similar with phenylethanolamine A were less than 1%. The detection limit, false positive rate and false negative rate were 5 μg L -1, 0 and 0, respectively. Detection results of phenylethanolamine A in pig urine between ICA and ELISA were the same. Conclusion The phenylethanolamine A strip with high sensitivity, specificity, accuracy and rapidity was developed in this study which would be used to test animal urine in 5 min without pre-treatment of urine samples. It would be efficient for mass samples screening in primary laboratory and enterprises. Key words: phenylethanolamine A; colloidal gold immunochromatographic assay; rapid detection strip; animal urine 0 引言研究意义苯乙醇胺 A 是 2-[4-(4- 硝基苯基 ) 丁基 -2 羟基氨基 ]-1- 甲氧基苯乙醇盐酸盐 (2-[4-(4- nitrophenyl)butyl-2 Hydroxysemi]-1- (4-methoxyphenyl) ethonal hydrochloride), 其分子式为 C 19 H 24 N 2 O 4, 一般以盐酸盐的形式存在苯乙醇胺 A 俗称克仑巴胺 [1-2], 是一种人工合成的化学物质, 与盐酸克仑特罗和莱克多巴胺属于同类物质, 均属于 β- 肾上腺素能受体激动剂, 具有同盐酸克仑特罗和莱克多巴胺相同的作用和效果, 可使生猪长速加快皮红毛亮瘦肉率高人吃了含有这种瘦肉精的猪肉后, 可诱发高血压心脏病等 [3-5] 2011 年 9 月, 四川省广安市广安区枣山镇畜牧兽医站对某养猪场例行违禁药物监测中, 用莱克多巴胺检测试纸卡分别检测母猪仔猪和育肥猪尿液, 发现该场育肥猪尿检呈阳性, 之后确认是新型添加物苯乙醇胺 A 农业部第 1519 号公告已明令禁止苯乙醇胺 A 在饲料和动物饮水中使用 β- 激动剂类物质进入动物体内后, 主要是经尿液排泄 [6], 因此监控动物是否饲喂苯乙醇胺 A 最有效的检测样本是尿液前人研究进展目前检测苯乙醇胺 A 的方法主要包括高效液相色谱法 (HPLC) [7] 高效液相色谱 - 串联质谱法 (LC-MS/MS) [8-9] 气相色谱 - 质谱联用法 (GC-MS) 液相色谱- 质谱联用法 (LC-MS) [10] 等以及免疫学检测方法上述仪器检测方法虽然具有检测精确度高的特点, 但仪器价格昂贵, 前处理方法复杂, 操作繁琐, 检测时间长, 难以满足现场快速筛查的需求目前文献报道的关 [11] 于苯乙醇胺 A 的免疫学检测方法为张琳等利用苯乙醇胺 A 酶联免疫 (ELISA) 检测试剂盒对饲料进行初筛, 并用 LC-MS/MS 法对疑似阳性样品进行确证, 方法的标准曲线范围为 ng ml -1, 添加浓度在 μg kg -1 之间, 回收率范围在 [12] 74% 140% 之间蔡齐超等通过合成人工抗原, 制备出鼠源苯乙醇胺 A 多克隆抗体, 但并没有建立相应的检测方法本研究切入点胶体金免疫层析法是一种灵敏简单快速的检测方法, 利用特异性较高的苯乙醇胺 A 单克隆抗体制备得到的可以检测动物尿液中苯乙醇胺 A 的胶体金试纸条, 尚未见报道本研究成功合成苯乙醇胺 A 半抗原和抗原, 进行动物免疫, 通过杂交瘤技术制备分泌抗苯乙醇胺 A 单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 并建立了动物尿液中苯乙醇胺 A 胶体金快速检测方法拟解决的关键问题本研究以制备苯乙醇胺 A 单克隆抗体为基础, 研发了动物尿液中苯乙醇胺 A 胶体金检测试纸条, 并对试纸条的性能进行鉴定评价, 方法灵敏度高, 操作简单, 检测快速, 无需样品前处理, 不需要配套仪器设备, 适合在基层抽检养殖场屠宰场现场大量筛查使用 1 材料与方法 1.1 试验时间地点本研究从 2013 年 10 月至 2014 年 8 月在北京勤邦生物技术有限公司研发实验室完成

3 19 期聂雯莹等 : 动物尿液中苯乙醇胺 A 胶体金快速检测方法的建立材料试剂苯乙醇胺 A, 购自 Sigma 公司, 纯度 98%; 牛血清白蛋白 (BSA) 卵清白蛋白(OVA) 和二甲基甲酰胺 (DMF), 购自 Sigma 公司 ; 弗氏完全佐剂 (FCA) 和弗氏不完全佐剂 (FIA), 北京勤邦生物技术有限公司制备 ; 碳化二亚胺 (EDC) 和 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS), 购自 Thermo scientific 公司 ; 氯金酸, 购自上海化学试剂有限公司 ; 其它试剂市售所得均为 AR 级仪器 FA2104 型电子天平, 上海良平仪器仪表有限公司 ;90-2 型磁力搅拌器, 上海振荣科学仪器有限公司 ;L500 型低速离心机, 湘仪集团 ;CT300 型数控切条机, 上海金标生物科技有限公司 ;IsoFlow 卷轮式喷膜仪, 美国 Imagene 公司 ;752S 型分光光度计, 上海凌光技术有限公司 ;DHP-600 型生化培养箱, 天津市中环实验电炉有限公司 ;Milli-Q Reference 纯水仪, 美国 Millipore 公司试验动物 6 8 周龄 SPF 级雌性 Balb/c 小鼠购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心, 由北京勤邦生物技术有限公司实验动物室饲养 1.3 方法苯乙醇胺 A 半抗原合成取 2.0 g 苯乙醇胺 A 加入到丙酮中溶解, 再加入 0.86 g 溴代戊醛, 发生亲核取代反应, 回流反应 5 h, 利用薄层层析色谱法追踪反应情况, 待反应结束后, 蒸干丙酮, 将反应得到的物质用水和乙酸乙酯萃取, 蒸干得到粗产物, 经过流动相为二氯甲烷:甲醇 =5:1 的柱层析纯化, 得到苯乙醇胺 A 半抗原 0.76 g [13-14] 合成路线如图 1 图 1 苯乙醇胺 A 半抗原合成路线 Fig. 1 The synthesis route of hapten of phenylethanolamine A 免疫原的制备取 7.0 mg 苯乙醇胺 A 半抗原, 溶解于 1 ml 二甲基甲酰胺 (DMF) 中, 得到反应液 Ⅰ; 取 30 mg 碳化二亚胺 (EDC) 和 20 mg 的 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 用 0.2 ml 水充分溶解后加入至反应液 Ⅰ 中, 室温下搅拌 24 h, 得到反应液 Ⅱ; 取 50 ml 牛血清白蛋白 (BSA), 使之充分溶解在 3.8 ml ph 为 8.0 的磷酸盐缓冲液 (PBS) 中, 将反应液 Ⅱ 逐滴缓慢滴加到 BSA 溶液中, 并于室温下搅拌 24 h, 得到反应液 Ⅲ; 用 0.01 mol L -1 的 PBS 在 4 透析 3 d, 以除去未反应的小分子物质, 得到免疫原, 于 -20 保存备用 [15-17] 包被原的制备将 50mL BSA 溶液替换为 40 ml 卵清白蛋白 (OVA), 其余方法同采用 TNBS 法测定半抗原与载体蛋白的偶联比取 L- 赖氨酸盐酸盐, 在 105 温度下烘干 3 h, 精确称取赖氨酸 10 mg 用 0.1 mol L -1 酸氢钠配制成 1 mg ml -1 用 0.1 mol L -1 碳酸氢钠将赖氨酸标准溶液稀释到 μg ml -1, 每个浓度溶液 0.5 ml, 加入 0.25 ml 0.01% 的 TNBS,37 反应 2 h, 加入 0.25 ml 10% 的 SDS 和 ml 1 mol L -1 的盐酸, 测定 335 nm 吸光度值, 以吸光度值为横坐标,-NH 2 的微摩尔分子数为纵坐标做标准曲线将载体蛋白和偶联后抗原分别稀释至 200 μg ml -1, 每个溶液取 0.5 ml, 加入 0.25 ml 0.01% 的 TNBS,37 反应 2 h, 加入 0.25 ml 10% 的 SDS 和 ml,1 mol L -1 的盐酸, 测定 335 nm 吸光度值单克隆抗体的制备将免疫原 ( 苯乙醇胺 A 与牛血清白蛋白偶联物 ) 分别注入到 6 8 周龄 BALB/c 雌性小鼠体内, 首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂, 颈背部皮下多点注射, 间隔两周取相同剂量免疫原加弗氏不完全佐剂加强免疫 1 次, 免疫剂量为 150 µg/ 只, 使其产生抗血清第 3 次免疫后一周眶下窦采血, 然后按照常规方法分离血清 ; 以未免疫的小鼠血清为阴性对照 ; 间接竞争 ELISA 方法测定抗体效价及抑制情况, 选取血清效价高及特异性好的小鼠进行加强免疫,72 h 后做融合

4 3934 中国农业科学 48 卷取免疫 BALB/c 小鼠脾细胞, 按 9:1 比例与 SP2/0 骨髓瘤细胞融合, 采用间接竞争 ELISA 测定细胞上清液, 筛选阳性孔利用有限稀释法进行克隆, 分别得到分泌苯乙醇胺 A 单克隆抗体的苯乙醇胺 A 单克隆杂交瘤细胞株将 BALB/c 小鼠腹腔注入灭菌石蜡油 0.5 ml/ 只,7 d 后腹腔注射杂交瘤细胞个 / 只,7 d 后采集腹水用辛酸 - 饱和硫酸铵法进行纯化, 提纯后即可得到单克隆抗体 [18] 单克隆抗体免疫学特性的鉴定单克隆抗体效价的测定采用间接 ELISA 方法进行测定 [19],3 μg ml -1 的苯乙醇胺 A 半抗原 -OVA 包被酶标板, 每孔 50 μl, 置于 37 下, 避光孵育 2 h, 倾出孔内液体,PBST 洗板 5 次, 拍干, 在每孔中加入 200 μl 封闭液, 置于 37 下, 避光孵育 2 h, 倾去孔内液体拍干 ; 加入单克隆抗体工作液, 每孔 50 μl,37 反应 30 min, 倾出孔内液体,PBST 洗板 5 次, 拍干 ; 加入酶标二抗, 每孔 50 μl, 轻轻振荡混匀, 置于 37 下, 反应 30 min 后, 倾出孔内液体, PBST 洗板 5 次, 拍干 ; 加入底物显色液, 每孔 50 μl, 置于 37 下, 反应 15 min; 加入 2 mol L -1 的浓硫酸终止反应, 每孔 50 μl, 设定酶标仪于双波长 630 nm/450 nm 处测定每孔吸光度值单克隆抗体灵敏度的测定将筛选出的单克隆抗体腹水采用间接竞争 ELISA 方法, 向酶标板每孔分别加入筛选出的单克隆抗体腹水和苯乙醇胺 A 浓度为 μg L -1 的标准品溶液, 每孔 50 μl, 以下步骤同单克隆抗体效价的测定绘制标准曲线, 计算单克隆抗体对苯乙醇胺 A 的 IC 50, IC 50 值越小, 灵敏度越高单克隆抗体特异性的测定将浓度为 μg L -1 的苯乙醇胺 A 克仑特罗莱克多巴胺沙丁胺醇异丙肾上腺素去氧肾上腺素特布他林溴氯布特罗溴布特罗马喷特罗马布特罗氯丙那林盐酸班布特罗和齐帕特罗标准品用 PBST 分别配制成浓度为, 分别与苯乙醇胺 A 单克隆抗体进行间接竞争 ELISA 反应, 制作标准曲线, 分析得到 IC 50, 按下式计算交叉反应率 : 引起 50% 抑制的苯乙醇胺 A浓度交叉反应率 (%)= 引起 50% 抑制的其他同类药物浓度胶体金免疫层析检测方法的建立柠檬酸三钠还原法制备胶体金取 1.0% 氯金酸水溶液 100 ml 加热至沸腾, 加入 2.5 ml 1% 柠檬酸三钠, 继续搅拌加热反应至液体呈透亮的紫红色, 继续将上述溶液煮沸 10 min, 室温冷却后, 即为胶体金溶液 [20-23] 单克隆抗体 - 胶体金标记物的制备将苯乙醇胺 A 单克隆抗体用 ph7.2,0.2 mol L -1 的 PBS 逐级稀释, 各取 0.1 ml 按顺序加入一系列装有 1 ml 胶体金的试管中,5 min 后在上述试管内分别加入 0.1 ml 10% 氯化钠溶液, 混匀, 并进行分光光度测量, 通过测量获得的变化趋于稳定的分光光度值所对应的抗体量为胶体金最适抗体量量取 100 ml 胶体金溶液用 0.2 mol L -1 K 2 CO 3 调节胶体金溶液 ph 至 7.0, 向上述胶体金溶液中加入 1.5 mg 的苯乙醇胺 A 单克隆抗体, 搅拌 30 min, 加入 10% 牛血清白蛋白 (BSA) 至 BSA 在胶体金溶液中的终浓度为 1% ( 体积百分含量 ), 搅拌 30 min r/min,4 离心 30 min, 弃上清液, 用 20 ml 的复溶盐缓冲液将沉淀重悬, 放置于 4 备用结合物释放垫的制备将结合物释放垫浸泡于含有 BSA(BSA 在缓冲液中的浓度为 1.0%) ph 为 7.2 浓度为 0.2 mol L -1 的 PBS 缓冲液中, 均匀浸湿 1 h,37 烘 3 h 备用用 Isoflow 喷膜仪将制备好的苯乙醇胺 A 单克隆抗体 - 胶体金标记物均匀喷涂在结合物释放垫上, 每 1 cm 结合物释放垫喷涂 0.03 ml 苯乙醇胺 A 单克隆抗体 - 胶体金标记物后, 置于 37 环境中 ( 湿度 <20%)60 min 后取出, 置于干燥环境 ( 湿度 <20%) 中保存备用反应膜的制备用磷酸盐缓冲液将苯乙醇胺 A 半抗原 - 卵清蛋白偶联物稀释到 10 mg ml -1, 用 Isoflow 点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线 (T 线 ), 包被量为 0.6 μl cm -1 ; 用 0.01 mol L -1 ph7.4 的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到 200 μg ml -1, 用 Isoflow 点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线 (C 线 ), 包被量为 0.8 μl cm -1 将包被好的反应膜置于 37 条件下干燥 2 h, 备用样品吸收垫的制备将样品吸收垫置于含 0.5% 牛血清白蛋白 ( 体积分数 ) ph mol L -1 磷酸盐缓冲液中浸泡 2 h,37 烘 2 h 备用试纸条的组装将样品吸收垫结合物释放垫反应膜吸水垫依次按顺序粘贴在 PVC 底板上 ; 结合物释放垫从起始端有 1/3 区域被样品吸收垫覆盖, 结合物释放垫的末端与反应膜的始端连接, 反应膜的末端与吸水垫的始端相连, 样品吸收垫的始端与 PVC 底板的始端对齐, 吸水垫的末端与 PVC 底板的末端对齐 ; 将试纸条切成 4 mm 宽的小条, 装在特制的塑料卡中 ( 图 2)

5 19 期聂雯莹等 : 动物尿液中苯乙醇胺 A 胶体金快速检测方法的建立为样品吸收垫 ;2 为结合物释放垫 ;3 为反应膜 ;4 为吸水垫 ;5 为 PVC 底板 ;6 为检测线 (T 线 );7 为质控线 (C 线 ) 1.Sample absorbent pad; 2.Binder release pad; 3.Reactive film; 4.Water absorbing pad; 5.PVC plate; 6.Detection line; 7.Quality control line 图 2 试纸条剖面结构图 Fig. 2 Profile of rapid detection strip 动物尿液样本的检测检测限的确定通过对空白尿液中添加不同浓度的苯乙醇胺 A 标准品进行检测, 每个样品重复 5 次测定,5 min 后观察结果检测线 (T 线 ) 和质控线 (C 线 ) 显色情况 [24], 验证试纸条对动物尿液中苯乙醇胺 A 的最低检测限重复性试验取试纸条检测阴性尿样和含有苯乙醇胺 A 的阳性尿液样品各 50 份, 观察检测结果, 计算其假阳性率和假阴性率确定试纸条重复性假阳性率计算公式 : 阳性检出个数假阳性率 = 100% 阴性样品总数假阴性率计算公式 : 假阴性率阴性检出个数 = 100% 阳性样品总数与 ELISA 方法比较抽取实际尿液样品 50 份, 清亮尿液可直接测定, 如果尿液浑浊, 应通过 r/min 室温下离心 10 min, 直至清亮, 使用试纸条与 ELISA 检测方法进行对比检测试纸条检测方法 : 用一次性吸管吸取尿液样品垂直滴加 2 3 滴于加样孔中, 自液体流动开始计时, 反应 5 min, 判定检测结果 ;ELISA 检测方法 : 加入标准品 / 尿液样品 50 μl 到对应的微孔中, 随即加入酶标抗体工作液 50 μl/ 孔, 轻轻振荡混匀, 用盖板膜盖板后置 25 避光环境反应 30 min, 再将孔内液体甩干, 洗板 4 5 次, 再加入底物液 A 液和 B 液各 50 μl/ 孔, 轻轻振荡混匀, 用盖板膜盖板后置 25 避光环境中反应 15 min, 加入终止液 50 μl/ 孔, 轻轻振荡混匀, 用酶标仪于 450 nm 处检测验证试纸条的准确度当样品中苯乙醇胺 A 含量低于试纸条检测限浓度, 判为阴性, 阴性结果用 - 表示,ELISA 方法阴性结果显示苯乙醇胺 A 的实际浓度含量 ; 当样品中苯乙醇胺 A 含量等于或高于试纸条检测限浓度, 判为阳性, 试纸条方法阳性结果用 + 表示,ELISA 方法阳性结果显示苯乙醇胺 A 的实际浓度含量弱阳性 ( 即苯乙醇胺 A 的含量在试纸条检测限浓度附近, 需要通过仪器方法进一步确证 ) 检测结果用 -/+ 表示 2 结果 2.1 苯乙醇胺 A 半抗原的鉴定苯乙醇胺 A 是小分子药物, 没有免疫原性, 不能刺激机体产生针对苯乙醇胺 A 抗原的特异性抗体 [25], 本研究苯乙醇胺 A 与溴代戊醛发生亲核取代反应, 从苯乙醇胺 A 的氨基端引入末端代醛基的连接臂, 得到苯乙醇胺 A 衍生物, 然后再与载体蛋白偶联, 在免疫动物时, 使抗原的决定簇尽可能暴露在动物免疫系统中, 从而会提高抗体的灵敏度和特异性 2.2 半抗原与载体蛋白偶联比测定方法的鉴定根据试验数据绘制氨基酸分子标准曲线 ( 图 3) 根据曲线的公式 Y=5.1742X X X , -NH2 分子摩尔浓度 -NH2 molecular molarity (μmol ml -1 ) 图 3 氨基分子数标准曲线 Fig. 3 Standard curve of -NH 2 molecular

6 3936 中国农业科学 48 卷得到 BSA 检测吸光度值 X 1 计算得到其 Y 1 ;OVA 测出来的吸光度值 X 2, 计算得到其 Y 2 ; 苯乙醇胺 A 半抗原 -BSA 的吸光度值 X 3 计算得到其 Y 3 ; 苯乙醇胺 A 半抗原 -OVA 的吸光度值 X 4, 计算得到其 Y 4 BSA- 抗原偶联比计算公式为 335 (Y 1 -Y 3 ),OVA- 抗原偶联比计算公式为 :225 (Y 2 -Y 4 ) 将上述测得的数值带入到偶联比计算公式, 可得到苯乙醇胺 A 半抗原 -BSA 偶联比为 11.38, 苯乙醇胺 A 半抗原 -OVA 偶联比为 10.66, 偶联效果较好 2.3 单克隆抗体免疫学特性的鉴定单克隆抗体效价的测定通过间接 ELISA 试验, 筛选出的 3 株杂交瘤细胞株效价 ( 表 1), 可知 MC-73 的单克隆抗体效价最高表 1 苯乙醇胺 A 单克隆抗体效价测定 Table 1 The detection of the titers of phenylethanolamine A mab 单克隆抗体上清腹水 Monoclone antibody Supernatant Ascites MC-73 1: : MC-33 1: : MC-29 1: : 单克隆抗体灵敏度的测定分别以 3 株单克隆抗体腹水进行 ELISA 试验, 苯乙醇胺 A 标准品浓度分别为和 8.1 μg L -1, 以 B/B 0 为纵坐标, 苯乙醇胺 A 浓度对数 lg[ 苯乙醇胺 A] 为横坐标建立苯乙醇胺 A 标准曲线如图 4 所示, 比较三株单克隆抗体腹水的灵敏度, 可得到 MC-73 株建立的 ELISA 方法 IC 50 为 μg L -1,MC-33 株的 IC 50 为 μg L -1,MC-29 株的 IC 50 为 μg L -1 其中 MC-73 株建立的 ELISA 方法 IC 50 值为最低, 故灵敏度最高单克隆抗体特异性的测定选择十三种结构相似的同类化合物 ( 克仑特罗莱克多巴胺沙丁胺醇异丙肾上腺素去氧肾上腺素特布他林溴氯布特罗溴布特罗马喷特罗马布特罗氯丙那林盐酸班布特罗齐帕特罗 ) 进行交叉反应试验, 测定单克隆抗体的特异性, 交叉反应率如表 2 所示, 由表 2 可以看出苯乙醇胺 A 单克隆抗体与苯乙醇胺 A 的交叉反应率为 100%, 与其他同类化合物的交叉反应率均小于 1%, 且 IC 50 均大于 , 本研究制备的得到的单克隆抗体特异性强 100 MC MC MC lg[ 苯乙醇胺 A 浓度 ] lg[phenyl ethanolamine A concentration (μg L -1 ) 图 4 苯乙醇胺 A 的 ELISA 标准曲线 Fig. 4 ELISA standard curve of phenyl ethanolamine A 2.4 胶体金免疫层析方法的建立胶体金的质量鉴定制备的胶体金状态为澄清的酒红色溶液, 表面无漂浮物在透射电镜下观察到胶体金颗粒的大小基本一致, 分散性比较好, 没有多角形的金颗粒, 也没有聚集现象通过随机挑选电镜照片上 10 个金颗粒, 测量其直径大小, 通过计算得到金颗粒平均直径为 25 nm 如图 5 所示胶体金最适标记浓度如图 6 所示,1 4 管由于加入的抗体蛋白量不足, 为达到稳定胶体金的最适抗体量, 均呈现出由红变蓝的聚沉现象, 从第 5 管开始胶体金溶液颜色基本一致 ; 如图 7 所示, 当抗体图 5 胶体金透射电镜图 ( ) Fig. 5 Electron microscope of collaurum transmission ( )

7 19 期聂雯莹等 : 动物尿液中苯乙醇胺 A 胶体金快速检测方法的建立 3937 表 2 苯乙醇胺 A 单克隆抗体与其他化合物的交叉反应率 Table 2 Cross-reactivity of the Phenylethanolamine A antibody with other compounds 化合物 Compounds 交叉反应率 Cross-reactivity (%) 半数抑制浓度 IC 50 (μg L -1 ) 苯乙醇胺 A Phenylethanolamine A 克仑特罗 Clenbuterol <1 > 莱克多巴胺 Ractopamine <1 > 沙丁胺醇 Salbutamol <1 > 异丙肾上腺素 Isoprenaline <1 > 去氧肾上腺素 Phenylephrine <1 > 特布他林 Terbutaline <1 > 溴氯布特罗 Bromchlorbuterol <1 > 溴布特罗 Brombuterol <1 > 马喷特罗 Mapenterol <1 > 马布特罗 Mabuterol <1 > 氯丙那林 Clorpernaline <1 > 西马特罗 Cimaterol <1 > 羟甲基克仑特罗 Hydroxymethylclenbuterol <1 > 塞布特罗 Cimbuterol <1 > 克仑潘特 Clenpenterol <1 > 盐酸班布特罗 Bambuterol Hydrochlorid <1 > 齐帕特罗 Zilpaterol <1 > 图 6 胶体金与标记蛋白比例试验 Fig. 6 Test result of percentage of colloidal gold and protein 量达到一定数值后, 对应的吸光光度值的变化趋于稳定, 这是由于加入的抗体量达到或超过了稳定胶体金的最适抗体量所致可知, 当抗体量等于和大于 13 μg ml -1 时, 对应的吸光光度值的变化趋于稳定, 故苯乙醇胺 A 单克隆抗体最适用量 :13 μg ml -1 (1+20%) =15.6 μg ml 动物尿液样本的检测检测限的确定对苯乙醇胺 A 的添加浓度为 μg L -1 的尿液样本进行检测, 检测结果如表 3 通过判断 T 线是否显色, 确定苯乙醇胺 A 残留检测试纸条的检测限为 5 μg L 抗体浓度 Content of antibody (μg ml -1 ) 图 7 抗体蛋白最适稳定量分光光度计测定 Fig. 7 Optimum quantity of antibody by spectrophotometry 重复性试验对试纸条进行重复性测试结果显示对阳性尿液样品进行检测, 结果均为阳性 ; 对阴性尿液样品检测, 结果均为阴性因此试纸条的假阴性率为 0, 假阳性率为与 ELISA 方法对比通过胶体金免疫层析试纸条法 (ICA) 与 ELISA 方法对 50 份猪尿样品检测结果的比较 ( 表 4),ELISA 方法的标准曲线建立参见 2.3.1, 动物尿液最低检测限为 0.5 μg L -1, 回收率

8 3938 中国农业科学 48 卷表 3 检测限的确定 Table 3 Limit of detection 化合物 Compound 苯乙醇胺 A Phenylethanolamine A 添加浓度检测结果 Concentration (μg L -1 ) Detection result 2.5 C 线显色,T 线显色 C line and T line with coloration 5 C 线显色,T 线不显色 C line with coloration, T line with no colour 10 C 线显色,T 线不显色 C line with coloration, T line with no colour 范围为 75% 105% 由表 4 可知共检测出 18 份阳性样品,6 份弱阳性样品,26 份阴性样品两种方法的检测结果一致, 但由于两种方法均属于快速筛查方法, 对疑似阳性结果需要用仪器分析法进一步确证 3 讨论苯乙醇胺 A 是 2011 年发现添加在饲料中的 β- 激动剂, 具有同盐酸克仑特罗和莱克多巴胺相同的作用和效果建立苯乙醇胺 A 免疫快速检测方法对工商质图 4 ICA 与 ELISA 对猪尿样品检测结果比较 Table 4 Result contrast of ICA and ELISA for pig urine (µg L -1 ) 样品编号 Samples No. ICA 检测方法 Test method ELISA 样品编号 Samples No. ICA 检测方法 Test method ELISA / / / / / /

9 19 期聂雯莹等 : 动物尿液中苯乙醇胺 A 胶体金快速检测方法的建立 3939 监部门监控苯乙醇胺 A 滥用, 保障消费者食品安全具有重要意义本试验通过制备半抗原, 合成人工免疫原, 并进行动物免疫试验, 制备得到分泌抗苯乙醇胺 A 单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 建立了动物尿液中苯乙醇胺 A 胶体金快速检测方法 3.1 苯乙醇胺 A 胶体金检测方法的建立苯乙醇胺 A 半抗原合成过程中, 从苯乙醇胺 A 的氨基端引入末端代醛基的连接臂, 使得抗原决定簇尽可能的暴露于动物的免疫系统中, 提高了制备出高灵敏度苯乙醇胺 A 特异性抗体的可能性 TNBS 法用来测定载体蛋白含有的游离氨基残基, 因偶联后载体蛋白氨基减少, 从而推算出两者的结合比, 该方法适用于偶联方法消耗载体蛋白氨基残留的抗原, 如完全抗原偶联比的测定通过 ELISA 法筛选得到的 3 株单克隆抗体测定其 IC 50, 其中 MC-73 株建立的 ELISA 方法 IC 50 值为最低, 为 μg L -1, 故灵敏度最高采用 ELISA 法测定苯乙醇胺 A 单克隆抗体特异性, 试验结果表明, 单抗对苯乙醇胺 A 的特异性交叉反应率为 100%, 对其他 13 种同类化合物的交叉反应率均小于 1%, 表明本试验得到的单克隆抗体对苯乙醇胺 A 具有较强的特异性采用粒径为 25 nm 的胶体金颗粒标记抗体, 利用分光光度法测得达到稳定胶体金的最适抗体量, 以胶体金标记的苯乙醇胺 A 单克隆抗体的最适标记浓度为 15.6 μg ml 苯乙醇胺 A 胶体金检测试纸条的性能测定检测限测定试验表明, 苯乙醇胺 A 对动物尿液的检测限为 5 μg L -1 通过重复性试验观察发现, 试纸条的假阳性率和假阴性率均为 0, 检测结果的重复性较好由于胶体金试纸条检测方法属于定性检测方法, 适用于样本的初筛, 为疑似阳性样本的仪器确证方法提供了参考依据 4 结论本研究研制出灵敏度高准确度高特异性好操作简单快速检测成本低的苯乙醇胺 A 胶体金免疫层析试纸条, 该试纸条可直接检测动物尿液, 无需样本前处理, 反应只需 5 min 即可得到检测结果适合基层兽药检测实验室屠宰场畜产品企业现场大批量样本集中筛查检测, 为畜产品中瘦肉精监管工作提供了技术支持 References [1] 徐素彬, 赵立军, 柏林, 李云, 张静, 丁雪梅, 郑萍, 王宇萍, 高庆军, 柏凡, 张克英. 高效液相色谱 - 串联质谱法对家畜尿液中苯乙醇胺 A 残留检测研究. 分析化学, 2013, 41(5): Xu S B, Zhao L J, Bai L, Li Y, Zhang J, Ding X M, Zheng P, Wang Y P, Gao Q J, Bai F, Zhang K Y. Determination of phenylethanolamine A in livestock Urine by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Analytical Chemistry, 2013, 41(5): (in Chinese) [2] 曲斌, 郑胜兰, 陆桂萍, 耿士伟, 康学军. 固相萃取 -UPLC-MS/MS 快速测定猪尿中的苯乙醇胺 A. 中国兽药杂志,2012, 46(1): Qu B, Zheng S L, Lu G P, Geng S W, Kang X J. Rapid determination of phenylethanolamine A in pig urine by SPE-UPLC-MS/MS. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2012, 46(1): (in Chinese) [3] Stolker A A, Paulus W Z, Ginkel L A. The use of supercritical fluid extraction for the determination of steroids in animal tissues. Analyst, 1998, 123(12): [4] 刘谦, 颜红. 液相色谱串联质谱测定动物肠衣中残留苯乙醇胺 A. 中国兽医杂志,2012, 48(8): Liu Q, Yan H. Determination of phenylethanolamine A in animal casing by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Chinese Journal of Veterinary Medicine, 2012, 48(8): (in Chinese) [5] Myers S A, Eriksson N, Burow R, Wang S C, Muscat G E. β-adrenergic signaling regulates NR4A nuclear receptor and metabolic gene expression in multiple tissues. Molecular Cell Endocrinology, 2009, 309(1): [6] 梁荣宁, 高奇, 秦伟. 分子印迹电位型传感器快速检测猪尿液中的克伦特罗. 分析化学, 2012, 40(3): Liang R N, Gao Q, Qin W. Potentiometric sensor based on molecularly imprinted polymer for rapid determination of clenbuterol in pig urine. Analytical Chemistry, 2012, 40(3): (in Chinese) [7] 顾亮, 丁磊. 液相色谱串联质谱法测定饲料中盐酸克伦特罗莱克多巴胺沙丁胺醇苯乙醇胺 A. 化学分析计量, 2012, 21(1): Gu L, Ding L. Determination of clenbuterol Ractopamine salbuterol and nylethanolamine in feeds by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. Chemical Analysis and Meterage, 2012, 21(1): (in Chinese) [8] Nielen M W, Lasaroms J J, Essers M L, Oosterink J E, Meijer T, Sanders M B, Zuidema T, Stolker A A. Multiresidue analysis of beta-agonists in bovine and porcine urine, feed and hair using liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2008, 391(1): [9] Wu Y N, Miao H, Fan S, Zhao Y F. Determination of 23β 2 -agonists and 5β-blockers in animalmuscle by high performance liquid chromatography-linear ion trap mass spectrometry. Chemistry, 2010,

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第期甘金华等强力霉素人工抗原的合成与抗体制备材料与方法试剂及溶液

第期甘金华等强力霉素人工抗原的合成与抗体制备材料与方法试剂及溶液第卷第期年月食品与生物技术学报强力霉素人工抗原的合成与抗体制备甘金华邓薇李进平艾晓辉中国水产科学研究院长江水产研究所湖北荆州武汉纺织大学环境与城建学院湖北武汉采用改进的碳二亚胺两步法将强力霉素半抗原与载体蛋白连接制备强力霉素牛血清白蛋白人工免疫抗原并用同样方法将强力霉素与载体蛋白连接制备人强力霉素卵清白蛋白人工包被抗原经紫外扫描分析和动物免疫试验证实强力霉素人工抗原合成成功