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陶舒
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1 1668 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (12): 研究简报 GLP-1 受体长效激动剂 GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) 融合蛋白的制备与生物效应 * 郑云程 ( 上海汉骄生物科技有限公司, 上海 ) 关键词 : 糖尿病 ; GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc); 受体激动剂中图分类号 : R943 文献标识码 : A 文章编号 : (2015) Preparation and the biological effect of fusion protein GLP-1-exendin-4/ IgG4(Fc) fusion protein as long acting GLP-1 receptor agonist ZHENG Yun-cheng * (Shanghai Hanjiao Biotechnology Co., LTD, Shanghai , China ) Abstract: GLP-1 has a variety of anti-diabetic effects. However, native GLP-1 is not suitable for treatment of diabetes due to its short half-life (t 1/2, 2 5 min). Exendin-4 is a polypeptide isolated from lizard saliva, which can bind to GLP-1 receptor, produce physiological effects similar to GLP-1, t 1/2 up to 2.5 h, therefore, we developed a long-lasting GLP-1 receptor agonists and GLP-1-exendin-4 fusion IgG4 Fc [GLP-1-exendin-4/ IgG4(Fc)]. We constructed the eukaryotic expression vector of human GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc)-pOptiVEC - TOPO by gene recombination technique and expressed the fusion protein human GLP-1-IgG4 (Fc) in CHO/DG44 cells. The fusion protein stimulated the INS-1 cells secretion of insulin, GLP-1, exendin-4 and fusion protein in CD1 mice pharmacokinetic experiments, as well as GLP-1, exendin-4 and fusion protein did anti-diabetic effect on streptozotocin induced mice. Results demonstrated that the GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) positive CHO/DG44 clones were chosen and the media from these positive clones. Western blotting showed that one protein band was found to match well with the predicted relative molecular mass of human GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc). Insulin RIA showed that GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) dose-dependently stimulated insulin secretion from INS-1 cells. Pharmacokinetic studies in CD1 mice showed that with intraperitoneal injection (ip), the fusion protein peaked at 30 min in circulation and maintained a plateau for 200 h. Natural biological half-life of exendin-4 was (1.39 ± 0.28) h, GLP-1 in vivo t 1/2 4 min, indicating that fusion protein has long-lasting effects on the modulation of glucose homeostasis. GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) was found to be effective in reducing the incidence of diabetes in multiple-low-dose streptozotocin-induced diabetes in mice, longer duration of the biological activity of the fusion protein. The biological activity was significantly higher than that of GLP-1 and exendin-4. GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) has good anti-diabetic activity. It can be used as a long-acting GLP-1 agonists. Key words: diabetes; GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc); receptor agonist 糖尿病 (diabetes mellitus, DM) 是一种因胰岛素收稿日期 : ; 修回日期 : * 通讯作者 Tel/Fax: , zhengyuncheng@163.com 分泌不足及胰岛 β- 细胞功能缺陷引起的临床综合征, 包括 Ⅰ 和 Ⅱ 型糖尿病 Ⅱ 型糖尿病 (type 2 diabetes mellitus, T2DM) 属于胰岛素非依赖型糖尿病, 是由于机体周边组织对胰岛素敏感性降低胰岛素分泌不

郑云程: GLP -1 受体长效激动剂 GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc)融合蛋白的制备与生物效应足导致的主要病理表现为胰岛素抵抗和由胰岛细胞 1669 IgG4(Fc) 与 GLP-1R 结合, 刺激 INS-1 细胞胰岛素分功能失调所致的胰岛素分泌相对不足, 形成持久的泌 CD1 小鼠的药代动力学研究表明, 单次腹腔注射高血糖, 并可产生多种致命性并发症其临床病症出

(glucogan 1ike peptide-1, GLP-1) 作为一种肠促胰岛素[1, 2], 是由肠道 L 细胞合成和分泌的, 由 30 个氨基酸组成的多肽 GLP-1 结合并激活 G 蛋白偶联受体 GLP-1 受体, 通过胰腺 β-细胞 PKB/Akt 的活化,参与葡萄糖依赖性胰岛素分泌和抗凋亡, GLP-1 增加胰腺 β-细胞的增殖, 研究显示 GLP-1 还有减少食物的摄取

2 郑云程: GLP -1 受体长效激动剂 GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc)融合蛋白的制备与生物效应足导致的主要病理表现为胰岛素抵抗和由胰岛细胞 1669 IgG4(Fc) 与 GLP-1R 结合, 刺激 INS-1 细胞胰岛素分功能失调所致的胰岛素分泌相对不足, 形成持久的泌 CD1 小鼠的药代动力学研究表明, 单次腹腔注射高血糖, 并可产生多种致命性并发症其临床病症出后, 该融合蛋白保持在较高的水平达 1 周以上研究现的关键是分泌胰岛素 β-细胞量降低到不足以维持结果表明, GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) 可以作为替代正常血糖代谢的水平, 如果能增加 β-细胞的数量就 GLP-1 受体激动剂用于治疗糖尿病可以扭转其病程的进展当前糖尿病临床治疗中, 尚无一种药物可以增加胰岛 β-细胞的数量胰高血糖素样肽-1 (glucogan 1ike peptide-1, GLP-1) 作为一种肠促胰岛素[1, 2], 是由肠道 L 细胞合成和分泌的, 由 30 个氨基酸组成的多肽 GLP-1 结合并激活 G 蛋白偶联受体 GLP-1 受体, 通过胰腺 β-细胞 PKB/Akt 的活化,参与葡萄糖依赖性胰岛素分泌和抗凋亡, GLP-1 增加胰腺 β-细胞的增殖, 研究显示 GLP-1 还有减少食物的摄取减慢胃的排空以及抑制胰高血糖素的分泌促进胰岛再生等功能, 且无胰岛素和磺脲类降糖药物的低血糖危险 GLP-1 独特的降血糖作用机制与众不同, 是现有抗糖尿病药物无可比拟的[3 9] hglp-i 是具有广阔市场前景的新型糖尿病治疗 Figure 1 Perspective structure of GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) fusion proteins 药物, 但其临床应用的最大障碍是体内半衰期短 DPP.Ⅳ介导的这种蛋白质水解作用使 hglp-1 在体内降解, 失活的主要途径是通过 hglp-l 受体的体内材料与方法质粒细胞株和菌株 GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) 天然拮抗剂, hglp-1 在体内迅速被血浆中 DPP.Ⅳ从基因片段来自南京金斯瑞基因合成, poptivec - N 末端裂解 His-A1a 二肽, 成为无活性的 des(hisala)- TOPO 载体 (Dhfr+) 中华仓鼠卵巢细胞 (Dhfr gene hglp-1 (9 36), 结果使得 hglp-1 在体内的生物半 deficient CHO/DG44cells) 细胞株, 均购自 Invitrogen 衰期很短 (< 5 min), 其新陈代谢的速率为公司, INS-1 细胞购自 ATCC 公司, 感受态菌 DH5α min [10, 11] 另外, 由于 hglp-1 只有 30 个氨基酸残基, 分子很小, 因此肾清除率较高, 也是造成它体内半衰期短的一个原因 [12 14] 由上海汉骄生物科技有限公司保存限制性内切酶 Nhe I Xho I 和 Nsb IT4 主要试剂 DNA 连接酶, 蛋白 Marker (NEB 公司); DNA 纯化天然的 GLP-1 半衰期很短 (约 2 min), 无法应用回收试剂盒, 质粒提取试剂盒 (天根生物科技公司); 于临床天然 exendin-4 是从美国西南部产的大毒蜥唾 Lipofectamine 2000 脂质体 (Invitrogen 公司); 山羊液中提取的 39 个氨基酸多肽, exendin-4 可与 GLP-1 抗人 IgG(H+I) ( 中山金桥); 亲和层析柱 ProteinG- 受体结合, 产生与 GLP-1 相似的生理效应, 半衰期达 Agarose (Roche 公司); 其他试剂为国产分析纯试剂, 2.5 h, 每天皮下注射两次用于治疗 T2DM, 可得到满 RIA kit (Linco 公司) Ascensia XL 血糖仪和 Ascensia 意的疗效临床研究显示, exendin-4 可在血糖较高的血糖试纸 (Ascensia 公司) 时刺激胰岛素分泌, 从而降低血糖; 在血糖较低时则培养基 a-mem(+) a-mem( ) 培养基 (Gibico 无此作用, 故不会引起低血糖 Exendin-4 可显著降公司); 无血清培养基 CD OptiCHO Medium (Invi- 低 T2DM 患者空腹及餐后血糖 HbA1c, 显著降低体 trogen 公司); 透析胎牛血清 (Hyclone 公司) 重和改善脂代谢, 动物研究表明 exendin-4 增加 β-细胞数量, 对Ⅱ型糖尿病有较好的疗效但是目前 exendin-4 主要采用化学合成, 成本高产量低, 不能满足市场需要本研究构建了 GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) (图 1), 通过人 IgG4 Fc 和 GLP-1-exendin-4 融合, 保留 GLP-1 和 exendin-4 天然活性, 研究表明 GLP-1-exendin-4/ 动物清洁级 7 周雄性 CD1 小鼠来自上海实验动物研究中心, 体重 g 细胞培养 CHO/DG44 细胞培养于 a-mem(+) 含 10% 新生小牛血清的培养基中, 于 37 5% CO2 的培养箱中培养表达载体构建用限制性内切酶 Nhe I Xho I 将目的片段从克隆载体上切下, 用 T4 DNA 连接酶将

3 1670 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (12): 目的片段与 poptivec -TOPO 载体连接, 转化感受态菌 DH5α, 提取质粒, Nsb I 酶切 GLP-1-exendin-4/ IgG4(Fc) poptivec -TOPO 质粒使其线性化, 乙醇沉淀后纯化回收, 双蒸水溶解, 最终质粒质量浓度为 0.5 μg μl 1 脂质体法转染 CHO/DG44 细胞及阳性克隆的筛选采用 Invitrogen 公司的脂质体转染技术 ( 参考试剂说明书 ) 按照转染试剂 Lipofectamine 2000 说明书将线性化的重组质粒转染 CHO/DG44 细胞同时设置空载体组和未转染组细胞转染 24 h 后加入 a-mem- 培养基进行筛选 12 天后表达质粒组和空载体组可见有阳性克隆形成, 阴性细胞组全部死亡, 用克隆环套取单克隆, 胰酶消化, 选出 20 个生长旺盛的单克隆扩大培养, 在扩大培养的基础上重复选取 20 个单克隆扩大培养冻存和检测 GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) 目的基因的扩增诱导表达与纯化在每个单克隆扩大培养稳定生长达到 70%~80% 时, 分别用浓度为和 nmol L 1 的 MTX 进行加压筛选, 加入 a-mem( ) 筛选培养基使细胞生长达到 70%~80% 后, 离心除去杂质, 超滤法浓缩细胞上清液, 将浓缩后的细胞上清液用 ProteinG-Agarose 纯化, 最后分别收集在 ph 9.0 的预冷 2 mol L 1 中和缓冲液 (neutralization buffer) 中表达产物 Western blot 检测分别收集质粒表达组空载体组及未转染对照组 CHO-DG44 细胞培养上清 ProteinG-Agarose 纯化后, 用 10% 分离胶和 5% 浓缩胶进行 SDS-PAGE 电泳电泳完毕后, 电转印至硝酸纤维素膜, 5% 脱脂牛奶封闭, TBST 洗膜后孵育二抗, 山羊抗人 IgG, 稀释倍数为 ~ 显色, 曝光胰岛素分泌实验 INS-1 细胞接种于 24 孔培养板, 细胞数为个 / 孔, 在含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基中第二天, 将培养基更换为新鲜的克林二氏重碳酸盐缓冲液 (KRB) 缓冲缺乏葡萄糖 120 min 将细胞用 2.8 或 16.8 mmol L 1 葡萄糖和不同浓度的和 5.0 mmol L 1 纯化的 GLP-1- exendin-4/igg4(fc) 融合蛋白在 KRB 缓冲液中培养 2 h 胰岛素水平使用大鼠胰岛素放射免疫测定 (RIA) 试剂盒测定 GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) 在小鼠体内的药代动力学雄性 CD1 小鼠腹腔内注射组 (n = 3) GLP-1- exendin-4/igg4(fc) 使用剂量为 1 mg kg 1 血清样品于和 192 h 后收集从眼球后静脉处取静脉血样本, exendin-4 (Heloderma suspectum) RIA kit 测定不同时间点血清 exendin-4 水平 Exendin-4 和 GLP-1 分别腹腔注射 0.12 和 0.1 mg kg 1, 前者于给药和 6 h 后经小鼠眼球后静脉处取静脉血, exendin-4 RIA Kit 测定不同时间点血清 exendin-4 水平, 后者于给药和 15 min 后经小鼠眼球后静脉处取静脉血, GLP-1 RIA kit 测定不同时间点血清 GLP-1 水平 GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) 抗小鼠糖尿病作用评估 GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) 是否有抗糖尿病的作用, 使用多次低剂量链脲霉素 (STZ, 50 mg kg 1 d 1, 连续 4 次腹腔注射 ) 诱导糖尿病 (CD1) 小鼠, 分为实验组对照组 exendin-4 组和 GLP-1 组, 每组各 5 只实验组在喂养过程中每三天腹腔注射 GLP-1- exendin-4/igg4(fc) (1 mg kg 1 ), 第 1 次给药时间是 STZ 给予前一天, exendin-4 组和 GLP-1 组腹腔注射 0.12 和 0.1 mg kg 1, 给药时间和方法同实验组, 对照组腹腔注射磷酸盐缓冲液 (PBS), 在指定时间测定血糖水平统计学分析采用 SPSS14 软件对数据进行统计处理, 实验结果用均数 ± 标准差 (x ± s) 表示, 参数统计采用重复测量的方差分析, P < 0.05 表示差异有统计学意义结果 1 GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) 基因表达产物实验组细胞培养上清液经 Western blot 分析发现, 质粒转染组有一个分子质量约为 70 kda 的 GLP-1- exendin-4/igg4(fc) 二聚体和 35 kda 的 GLP-1- Exendin-4/IgG4(Fc) 单体特异性条带与山羊抗人 IgG 特异结合结果表明, 在不加二硫苏糖醇 (DTT) 非还原条件下蛋白形成稳定的二聚物的 70 kda ( 条带 1); 在加 DTT 还原条件下, 形成单体结构 ( 条带 2) ( 图 2) 2 胰岛素分泌实验细胞用 2.8 或 16.8 mmol L 1 葡萄糖和不同浓度的纯化 GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) 融合蛋白于 KRB 缓冲液中, 胰岛素分泌 RIA 结果表明 GLP-1-exendin-4/ IgG4(Fc) 刺激的 INS-1 细胞胰岛素分泌量与葡萄糖浓度呈依赖方式人体正常血糖浓度为 3.9~6.1 mmol L 1, 本实验设计低于正常血糖浓度的 2.8 mmol L 1 葡萄糖浓度和高于正常血糖浓度的 16.8 mmol L 1 葡萄糖浓度当葡萄糖浓度为 2.8 mmol L 1, 融合蛋白浓度为 mmol L 1 均无效果, 1 mmol L 1 高浓度融合蛋白时, 胰岛素分泌量变大 ; 当葡萄糖浓度为

01 mmol L 1 时, 胰岛素分泌量明显变大, 随着融合蛋白浓度的增高, INS-1 细胞胰岛素分泌增多, 说明随着葡萄糖浓度的变化, GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) 融合蛋白对 INS-1 细胞可调节胰岛素分泌, 对糖尿病有调节血糖浓度作用见图 3 3 GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) 在小鼠体内的药代动力学药代动力学数据显示, 注射单一剂量

4 郑云程 : GLP -1 受体长效激动剂 GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) 融合蛋白的制备与生物效应 1671 Figure 2 The expression of fusion protein GLP-1-exendin-4/ IgG4(Fc) by Western blot. M: Maker; 1: Sample without DTT; 2: Sample add DTT 16.8 mmol L 1, 融合蛋白为 0.01 mmol L 1 时, 胰岛素分泌量明显变大, 随着融合蛋白浓度的增高, INS-1 细胞胰岛素分泌增多, 说明随着葡萄糖浓度的变化, GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) 融合蛋白对 INS-1 细胞可调节胰岛素分泌, 对糖尿病有调节血糖浓度作用见图 3 3 GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) 在小鼠体内的药代动力学药代动力学数据显示, 注射单一剂量 GLP-1- exendin-4/igg4(fc) 20~60 min 后, CD1 小鼠 GLP-1 的浓度明显增加 24 h 时蛋白检测达到峰值, 其后逐渐下降, 200 h 后仍然可以被检测到而天然 exendin-4 的体内半衰期为 (1.39 ± 0.28) h, GLP-1 体内半衰期为 4 min GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) 半衰期与 exendin-4 和 GLP-1 比较具有非常显著差异 (P < 0.01) 见图 4 4 GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) 抗小鼠糖尿病作用 4 个连续的腹腔注射低剂量 STZ (50 mg kg 1 ) 诱导小鼠糖尿病高血糖, 各组每三天给药 1 次 PBS 对照组在实验第 10 天血糖浓度持续升高保持在 17 mmol L 1 左右 ; GLP-1 和 exendin-4 组血糖浓度持续 Figure 3 Stimulation of insulin secretion by GLP-1-exendin-4/ IgG4(Fc) in INS-1 cells Figure 4 Pharmacokinetic study of GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) fusion protein 升高, exendin-4 组血糖浓度低于 GLP-1 组 ; GLP-1- exendin-4/igg4(fc) 组小鼠血糖水平保持相对恒定, 维持在 7.5 mmol L 1 左右, 血糖浓度明显低于其他 3 组 (P < 0.01) 见图 5 Figure 5 GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) improves glucose regulation in MDSD mice. STZ: Streptozotocin 讨论 Exendin-4 在毒蜥唾液中含量非常低, 因此通过提取天然 exendin-4 不可能实现其临床应用, 由于其半衰期较短, 需每日皮下注射两次, 给患者带来极大痛苦 IgG4Fc 为大分子二聚体结构, 在体内有较长的半衰期, 本研究通过对 GLP-1 和 exendin-4 进行结构改造, 采用基因工程方法获得了 exendin-4 与 GLP-1 及 IgG4(Fc) 融合的长效类似物, IgG4(Fc) 显著延长了 exendin-4 与 GLP-1 半衰期, 增强了其生物学效应为抵制 DPP-N 对 hglp-1 的剪切作用, 获得更稳定长效的 hglp-1, 作者将 hglp-1 第 2 位的 Ala 替换为 Gly, 获得活性更高的 hglp-1, 在 22 位 Phe 替换为 Glu, 并使之与 Fc 进行融合为了减少 Fc 融合对 GLP- 1-exendin-4 活性的影响, 在 exendin-4 与 IgG4Fc 之间加入了一个柔性的连接肽 (GGGGS)3 由于 hglp-1

5 1672 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (12): 降血糖的作用具有血糖浓度依赖性, 血糖正常时不促进胰岛素分泌 RIA 结果表明 GLP-1-exendin-4/ IgG4(Fc) 刺激的 INS-1 细胞胰岛素分泌量与葡萄糖浓度呈依赖方式 CD1 小鼠的药代动力学研究表明, 单次腹腔注射, 该融合蛋白保持在较高的水平 (1 周以上 ) GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) 对 STZ 诱导小鼠具有抗糖尿病作用, 控制血糖效果明显好于 GLP-1 和 exendin-4 研究结果表明, GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) 可以作为替代 GLP-1 受体激动剂用于治疗糖尿病 References [1] Meier JJ, Nauck MA. Glucagon-like peptide 1 (GLP-1) in biology and pathology [J]. Diabetes Metab Res Rev, 2005, 21: [2] Holst JJ, Gromada J. Role of incretin hormones in the regulation of insulin secretion in diabetic and nondiabetic humans [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2004, 287: E199 E206. [3] Moens K, Heimberg H, Flamez D, et al. Expression and functional activity of glucagon, glucagon-like activity peptide 1, and glucose-dependent insulinotrophic peptide receptors in rat pancreatic islet cells [J]. Diabetes, 1996, 45: [4] Mayo KE, Miller LJ, Bataille D, et al. International Union of Pharmacology. XXXV. The glucagons receptor family [J]. Pharmacol Rev, 2003, 55: [5] Trumper A, Trumper K, Trusheim A, et al. Glucose-dependent insulinotropic polypeptide is a growth factor for beta (INS-1) cells by pleiotropic signaling [J]. Mol Endocrinol, 2001, 15: [6] Wrede CE, Dickson LM, Lingohr MK, et al. Protein kinase B/Akt prevent fatty acid-induced apoptosis in pancreatic beta- cells (INS-1) [J]. J Biol Chem, 2002, 277: [7] Wang Q, Li L, Xu E, et al. Glucagon-like peptide-1 regulates proliferation and apoptosis via activation of protein kinase B in pancreatic INS beta-cells [J]. Diabetologia, 2004, 47: [8] Drucker DJ. Glucagon-like peptide-1 and the islet beta-cell: augmentation of cell proliferation and inhibition of apoptosis [J]. Endocrinology, 2003, 144: [9] Drucker DJ, Nauck MA. The incretin system: glucagon-like prptide-1 receptor agonists and dipeptidyl peptidase-4 inhibitors in type 2 diabetes [J]. Lancet, 2006, 368: [10] Kumar M, Hunag Y, Glinka Y, et al. In vivo expression of GLP-1/IgG-Fc fusion protein enhances beta-cell mass and protects against streptozotocin-induced diabetes [J]. Gene Ther, 2007, 14: [11] Kumar M, Hunag Y, Glinka Y, et al. In vivo expression of GLP-1/IgG-Fc fusion protein enhances beta-cell mass and protects against streptozotocin-induced diabetes [J]. Gene Ther, 2007, 14: [12] Walsh NA, Yusta B, DaCambra MP, et al. Glucagon-like peptide-2 receptor activation in the rat intestinal mucosa [J]. Endocrinology, 2003, 144: [13] Trumper A, Trumper K, Trusheim A, et al. Glucose-dependent insulinotropic polypeptide is a growth factor for beta (INS-1) cells by pleiotropic signaling [J]. Mol Endocrinol, 2001, 15: [14] Baggio LL, Kim JG, Drucker DJ. Chronic exposure to GLP-1R agonists promotes homologous GLP-1 receptor desensitization in vitro but does not attenuate GLP-1R dependent glucose homeostasis in vivo [J]. Diabetes, 2005, 53: S205 S214.

to match well with the predicted relative molecular mass of human GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc). Insulin RIA showed that GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) dose-depe

to match well with the predicted relative molecular mass of human GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc). Insulin RIA showed that GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) dose-depe GLP -1 受体长效激动剂 GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc) 融合蛋白的制备与生物效应郑云程 ( 上海汉骄生物科技有限公司上海 201210) 关键词 : 糖尿病 ;GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc); 受体激动剂中图分类号 : R943 文献标识码 : A 文章编