ICS B 44 T/CALAS x-201x 实验动物螺杆菌普通 PCR 和实时荧光 PCR 检测方法 Laboratory animals - Method of conventional PCR and real-time fluorescent PCR for the d

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襄瞻二华
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1 ICS B 44 T/CALAS x-201x 实验动物螺杆菌普通 PCR 和实时荧光 PCR 检测方法 Laboratory animals - Method of conventional PCR and real-time fluorescent PCR for the detection of Helicobacter sp. ( 征求意见稿 ) 201x-xx-xx 发布 201x-xx-xx 实施发布

2 前言本标准按照 GB/T 给出的规则编写本标准附录为规范性附录本标准由中国实验动物学会归口本标准由全国实验动物标准化技术委员会 (SAC/TC281) 技术审查本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草本标准主要起草单位 : 广东省实验动物监测所, 中国食品药品检定研究院本标准主要起草人 : 黄韧, 袁文, 张钰, 郭鹏举, 饶丹, 伍妙梨 I

3 实验动物螺杆菌普通 PCR 和实时荧光 PCR 检测方法 1 范围本标准规定了实验动物螺杆菌普通 PCR 和实时荧光 PCR 检测方法本标准适用于实验动物及其产品细菌培养物实验动物环境和动物源性生物制品中螺杆菌的检测 2 缩略语下列缩略语适用于本标准 2.1 PCR 聚合酶链式反应 2.2 实时荧光 PCR 实时荧光聚合酶链式反应 2.3 Ct 值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 2.4 DNA 脱氧核糖核酸 2.5 PBS 磷酸盐缓冲液, 配制方法见附录 A 3 检测方法原理用合适的方法提取样本中的螺杆菌 DNA, 针对螺杆菌 16sRNA 基因设计特异的引物序列, 通过 PCR 对模板 DNA 进行扩增, 根据 PCR 检测结果判定该样品中是否含有螺杆菌属核酸成分, 然后, 根据不同种的螺杆菌基因序列设计特异的种鉴别引物, 判定为哪一个种的螺杆菌实时荧光 PCR 方法是在常规 PCR 的基础上, 加入了一条特异性的荧光探针, 探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团探针完整时, 报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收 ;PCR 扩增时,Taq 酶的 5' 3' 外切酶活性将探针酶切降解, 使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离, 淬灭作用消失, 荧光信号产生并被检测仪器接受, 随着 PCR 反应的 1

4 循环进行,PCR 产物与荧光信号的增长呈对应关系因此, 可以通过检测荧光信号对核酸模板进行检测 4 主要设备和材料 4.1 PCR 仪 4.2 实时荧光 PCR 仪 4.3 电泳仪 4.4 凝胶成像分析系统 4.5 高速冷冻离心机 4.6 普通离心机 4.7 恒温孵育器 4.8 漩涡振荡器 4.9 组织匀浆器 4.10 生物安全柜 4.11 PCR 超净工作台 4.12 冰箱 (-20 ) 4.13 微量移液器 (0.1~2μL,1~10μL,10~100μL,100~1000μL) 4.14 灭菌离心管 (1.5mL 2mL 5mL 15mL), 灭菌吸头 (10μL,200μL,1mL), 灭菌 PCR 扩增反应管 (0.2 ml, 八连管或 96 孔板 ) 4.15 聚乙烯薄膜袋 :90mm 150mm 自封袋, 使用前紫外灭菌 20min 4.16 采样工具 : 剪刀镊子和灭菌棉拭子等 5 试剂除特别说明外, 所有实验用试剂均为分析纯 ; 实验用水为去离子水 5.1 灭菌 PBS 配制方法见附录 A 5.2 DNA 抽提试剂 : 基因组 DNA 提取试剂盒 DNeasy Blood & Tissue Kit,(Qiagen 公司, Cat.No.69504) 1 ) 或其他等效产品 5.3 无水乙醇 1 ) 给出这一信息是为了方便本标准的使用者, 并不表示对该产品的认可如果其他等效产品具有相同的效果, 则可以使用这些等效产品 2

5 5.4 PCR 试剂 :Premix Taq TM (Version 2.0 plus dye)( Takara 公司,Cat.No.RR901A) 1) 或其他等效产品 5.5 实时荧光 PCR 试剂 :TaqMan Universal PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific 公司, Cat.No ) 1) 或其他等效产品 5.6 DNA 相对分子质量标准 :100bp~2 000bp TAE 电泳缓冲液, 配制方法见附录 A 5.8 溴化乙锭 :10mg/mL, 配制方法见附录 A, 或其他等效产品 % 琼脂糖凝胶, 配制方法见附录 A 5.10 引物和探针 : 根据表 1 和表 2 的序列合成引物和探针, 引物和探针加无灭菌去离子水配制成 10μmol/L 储备液,-20 保存表 1: 普通 PCR 检测引物细菌引物名称引物序列 (5 3 ) 产物大小 (bp) 螺杆菌属 H-F CTATGACGGGTATCCGGC ( Helicobacter genus) H-R CTCACGACACGAGCTGAC 780 肝螺杆菌 (H. hepaticus) Hh-F Hh-R ATGGGTAAGAAAATAGCAAAAAGATTGCAA CTATTTCATATCCATAAGCTCTTGAGAATC 705 胆汁螺杆菌 (H. bilis) Hb-F Hb-R ATGGAACAGATAAAGATTTTAAAGCAACTTCAG CTATGCAAGTTGTGCGTTAAGCAT 435 啮齿类螺杆菌 (H. rodentium) Hr-F Hr-R TTGTGAAATGGAGCAAATCTTAAAAACT TAGCCAGTTTGGCATTCC 191 小家鼠螺杆菌 (H. muridarum) Hm-F Hm-R ATGACAAAAAAATATTCTTTCACAAAACTATTCATTGGT TTTATTTTAGATTCCATTTAACTGCTAAATCATCAATAGT 807 盲肠螺杆菌 (H. typhlonius) Ht-F Ht-R AGGGACTCTTAAATATGCTCCTAGAGT ATTCATCGTGTTTGAATGCGTCAA 122 表 2: 实时荧光 PCR 检测引物和探针细菌引物和探针名称引物和探针序列 (5 3 ) 正向引物 ACGGGTTGTGAAGCTTTTACTGATA AI89KFO_F 肝螺杆菌反向引物 (H. CCTTGAGTGCGGATACAAATCG AI89KFO_R hepaticus) 探针 FAM AAGGCTACGCACATTCA MGB NFQ AI89KFO_M 注 : 探针也可选用具有与 FAM 荧光基团相同检测效果的其他合适的荧光报告基团产物大小 (bp) 86 3

6 6 检测方法 6.1 采样及样本的处理采样过程中样本不得交叉污染, 采样及样品前处理过程中须戴一次性手套脏器组织剖检, 无菌采集动物的胃和肠, 剪取待检样品 2.0g 于无菌 5mL 离心管, 加入 4mL 灭菌 PBS, 使用电动匀浆器充分匀浆 1-2 分钟, 然后将组织悬液在 4,3000r/min 离心 10min, 取上清液转入另一无菌 5mL 离心管中, 编号备用胃内容物肠内容物或粪便无菌采集动物胃内容物肠内容物或粪便, 取待检样品 2.0g 于无菌 5mL 离心管, 加入 4mL 灭菌 PBS, 使用电动匀浆器充分匀浆 1~2 分钟,12,000 rpm 离心 10min, 取上清液转入另一无菌 5mL 离心管中, 编号备用螺杆菌分离培养物经选择性培养基培养的固体菌落或液体培养物, 或待鉴定的纯化培养物, 取适量样本装于无菌 1.5mL 离心管中, 编号备用实验动物环境实验动物饲料垫料和饮水取适量实验动物饲料和垫料置于聚乙烯薄膜袋中, 加入适量灭菌 PBS( 饲料和垫料需全部浸泡于液体中 ) 密封后浸泡 5~10min, 充分混匀, 将混悬液转移至 15mL 离心管中, 静置 30min, 取上清液转入另一无菌 5mL 离心管中, 编号备用取适量实验动物饮水直接转移到无菌 5mL 离心管中, 编号备用实验动物设施设备用灭菌棉拭子拭取实验动物设施设备出风口初效滤膜表面沉积物, 将拭子置入灭菌 15mL 离心管, 加入适量灭菌 PBS, 浸泡 5~10min, 充分混匀, 取出棉拭子, 将离心管静置 30min, 取上清液转入另一无菌 5mL 离心管中, 编号备用样本的存放采集或处理的样本在 2~8 条件下保存应不超过 24h, 若需长期保存, 须放置 -20 冰箱, 但应避免反复冻融 ( 冻融不超过 3 次 ) 6.2 样本 DNA 提取 2 ) 2 ) 该 DNA 提取方法是针对 DNA 提取试剂盒 DNeasy Blood & Tissue Kit,Qiagen 公司,Cat.No 给出的, 给出这一信息是为了方便本标准的使用者, 并不表示对该产品的认可如果其他等效产品具有相同的 4

7 6.2.1 取 50~100μL 的样本至 1.5mL 或 2mL 离心管中, 加 20μL 蛋白酶 K, 用 PBS 补加至 220μL 加入 200μL 缓冲液 AL, 涡旋震荡充分混匀,56 孵育 10min 加入 200μL 的无水乙醇, 涡旋震荡充分混匀移取步骤的混合液至离心柱上, 离心柱放在 2mL 收集管上 6000g(8000rpm) 离心 1 分钟弃收集管 / 液离心柱放至新的 2mL 收集管上, 加 500μL 的缓冲液 AW1, 6000g(8000rpm) 离心 1 分钟弃收集管 / 液离心柱放至新的 2mL 收集管上, 加 500μL 的缓冲液 AW2,20000g(14000rpm) 离心 3 分钟弃收集管 / 液将离心柱放在一个新的 1.5 离心管上, 吸 200μL 的缓冲液 AE 在吸附膜上, 室温孵育 1 分钟, 6000g(8000rpm) 离心 1 分钟制备好的 DNA 应尽快进行下一步 PCR 反应, 若暂时不能进行 PCR 反应, 应于 -20 冰箱保存备用 6.3 普通 PCR PCR 反应体系 PCR 反应体系见表 3 反应液的配制在冰上操作, 每次反应同时设计阳性对照阴性对照和空白对照, 其中阳性对照以含有螺杆菌的组织或培养物提取的 DNA 作为阳性对照模板, 其中阴性对照以不含有螺杆菌 DNA 样本 ( 可以是正常动物组织或正常培养物 ) 作为阴性对照模板, 空白对照即为不加模版对照 (No Template Control,NTC), 即在反应中用水来代替模板表 3 每个样品反应体系配制表反应组份用量 /μl 终浓度 2 Premix Taq Mix (plus dye) 25 1 Forward Primer(10μM) 2 400nM Reverse Primer(10μM) 2 400nM DNA 模版 10 灭菌去离子水 11 效果, 则可以使用这些等效产品 5

8 总体积 PCR 反应参数 PCR 反应参数见表 4: 表 4: PCR 反应参数步骤温度时间循环数预变性 94 5min 1 变性 94 1min 退火 55 1min 35 延伸 72 1min 延伸 72 10min 1 注 : 可使用其他等效的 PCR 检测试剂进行, 反应体系和反应参数可做相应调整 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳检测和拍照将适量 50 TAE 稀释成 1 TAE 溶液, 配制含核酸染料溴化乙锭的 1.5% 琼脂糖凝胶 PCR 反应结束后, 取 10μL PCR 产物在 1.5% 琼脂糖凝胶进行电泳检测, 以 DNA 分子量作参照电压大小根据电泳槽长度来确定, 一般控制在 3V/cm~5V/cm, 当上样染料移动到凝胶边缘时关闭电源电泳完成后在凝胶成像系统拍照记录电泳结果 6.4 实时荧光 PCR 实时荧光 PCR 反应体系实时荧光 PCR 反应体系见表 5 反应液的配制在冰上操作, 每次反应同时设计阳性对照阴性对照和空白对照, 其中阳性对照以含有螺杆菌的组织或细胞培养物提取的 DNA 作为阳性对照模板, 其中阴性对照以不含有螺杆菌 DNA 样品 ( 可以是正常动物组织或正常细胞培养物 ) 作为阴性对照模板, 空白对照即为不加模版对照 (No Template Control,NTC), 即在反应中用水来代替模板表 5 每个样品反应体系配制表反应组份用量 /μl 终浓度 2 TaqMan universal PCR master mix 25 1 Forward Primer(10μM) 2 400nM Reverse Primer(10μM) 2 400nM 6

9 Probe(10μM) 1 200nM DNA 模版 2.5 灭菌去离子水 17.5 总体积实时荧光 PCR 反应参数实时荧光 PCR 反应参数 : 实时荧光 PCR 反应参数见表 6: 表 6: 实时荧光 PCR 反应参数步骤温度时间采集荧光信号循环数 UNG 酶防污染 50 2min 否 1 预变性 95 10min 否变性 95 15sec 退火, 延伸 60 1min 是 1 40 试验检测结束后, 根据收集的荧光曲线和 Ct 值判定结果注 : 可使用其他等效的实时荧光 PCR 检测试剂盒进行, 反应体系和反应参数可做相应调整 7 结果判定 7.1 普通 PCR 质控标准所有引物中, 阴性对照和空白对照未出现条带, 阳性对照出现相应大小 ( 各引物的扩增产物大小见表 1) 的目的扩增条带则表明反应体系运行正常, 否则此次试验无效, 需重新进行普通 PCR 扩增结果判定用螺杆菌属 (Helicobacter sp.) 特异引物检测被检样品出现 780bp 条带时, 判定为螺杆菌属核酸阳性, 否则为核酸阴性用肝螺杆菌 (H. hepaticus) 特异引物检测被检样品出现 705bp 条带时, 判定为肝螺杆菌核酸阳性, 否则为核酸阴性用胆汁螺杆菌 (H. bilis) 特异引物检测被检样品出现 435bp 条带时, 判定为胆汁螺杆菌核酸阳性, 否则为核酸阴性用啮齿类螺杆菌 (H. rodentium) 特异引物检测被检样品出现 191bp 条带时, 判定为啮齿类螺杆菌核酸阳性, 否则为核酸阴性用小家鼠螺杆菌 (H. muridarum) 特异引物检测被检样品出现 807bp 条带时, 判定 7

10 为小家鼠螺杆菌核酸阳性, 否则为核酸阴性用盲肠螺杆菌 (H. typhlonius) 特异引物检测被检样品出现 122bp 条带时, 判定为盲肠螺杆菌核酸阳性, 否则为核酸阴性 7.2 实时荧光 PCR 结果分析和条件设定直接读取检测结果, 基线和阈值设定原则根据仪器的噪声情况进行调整, 以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准质控标准空白对照无 Ct 值, 并且无荧光扩增曲线, 一直为水平线阴性对照无 Ct 值, 并且无荧光扩增曲线, 一直为水平线阳性对照 Ct 值应 35, 并且有明显的荧光扩增曲线, 则表明反应体系运行正常, 否则此次试验无效, 需重新进行实时荧光 PCR 扩增结果判定若待检测样品无荧光扩增曲线, 则判定样品未检出肝螺杆菌若待检测样品有荧光扩增曲线, 且 Ct 值应 35 时, 则判断样品中检出肝螺杆菌若待检测样品 Ct 值介于 35 和 40 之间时, 应重新进行实时荧光 RT-PCR 检测重新检测后, 若 Ct 值 40 时, 则判定样品未检出肝螺杆菌重新检测后的 Ct 值仍介于 35 和 40 之间, 则判定样品检出肝螺杆菌 7.3 序列测定必要时, 可取待检样本扩增出的阳性 PCR 产物进行核酸序列测定, 序列结果与已公开发表的螺杆菌特异性片段序列进行比对, 序列同源性在 90% 以上, 可确诊待检样本螺杆菌核酸阳性, 否则判定螺杆菌核酸阴性 8

11 附录 A 规范性附录溶液的配制 A mol/l ph7.2 磷酸盐缓冲液 (PBS) 的配制 A.1.1 A 液 0.2 mol/l 磷酸二氢钠溶液 : 称取磷酸二氢钠 (NaH 2 PO4 H 2 0) 27.6g, 先加适量去离子水溶解, 最后定容至 1000 ml, 混匀 A.1.2 B 液 0.2 mol/l 磷酸氢二钠溶液 : 称取磷酸氢二钠 NaH 2 PO 4 7H 2 O53.6g( 或 Na 2 HPO 4 12H 2 O 71.6g 或 Na 2 HPO 4 2H 2 O 35.6g), 先加适量去离子水溶解, 最后定容至 1000mL, 混匀 A mol/l ph7.2 磷酸盐缓冲液 (PBS) 的配制取 A 液 14mL,B 液 36mL, 加氯化钠 (NaCl)8.5g, 用无离子水溶解稀释, 最后定容至 1000 ml, 经 121 高压灭菌 15min, 冷却备用 A.2 50 TAE 电泳缓冲液 A mol/L 乙二铵四乙酸二钠 (EDTA) 溶液 (ph8.0) 乙二铵四乙酸二钠 (EDTA -Na 2 H g 灭菌去离子水 80mL 5mol/L 氢氧化钠溶液调 ph 至 8.0 灭菌去离子加至 100mL,121,15min 灭菌备用 A TAE 电泳缓冲液配制羟基甲基氨基甲烷 (Tris) 冰乙酸 0.5mol/L EDTA 溶液,pH g 57.1mL l00ml 灭菌去离子加至 1000mL,121,15min 灭菌备用用时用灭菌去离子水稀释至 l 使用 A.3 溴化乙锭 (EB) 溶液 (10μg/μL) 溴化乙锭灭菌去离子水 20mg 20mL 9

12 A.4 含 0.5μg/mL 溴化乙锭的 1.5% 琼脂糖凝胶的配制琼脂糖 1.5g 1 TAE 电泳缓冲液加至 l00ml 混合后加热至完仝融化, 待冷至 50 ~55 时, 加溴化乙锭 (EB) 溶液 5μL, 轻轻晃动摇匀, 避免产生气泡, 将梳子置人电泳槽中, 然后将琼脂糖溶液倒人电泳板上, 待凝固后取下梳子备用

前言本标准按照 GB/T 给出的规则编写本标准附录 A 为资料性附录本标准由中国实验动物学会归口本标准由全国实验动物标准化技术委员会 (SAC/TC369) 技术审查本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草本标准主要起草单位 : 广东省实验动物监

前言本标准按照 GB/T 给出的规则编写本标准附录 A 为资料性附录本标准由中国实验动物学会归口本标准由全国实验动物标准化技术委员会 (SAC/TC369) 技术审查本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草本标准主要起草单位 : 广东省实验动物监 ICS 65.020.30 B 44 中国实验动物学会团体标准 T/CALAS x-201x 实验动物多瘤病毒普通 PCR 和实时荧光 PCR 检测方法 Laboratory animals - Methods of conventional PCR and real-time PCR for the detection of Polyoma virus ( 征求意见稿 ) 201x-xx-xx