广西地方标准《牛病毒性腹泻病毒的检测 反转录聚合酶链反应法(RT-PCR)》

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1 中国实验动物学会团体标准 实验动物大鼠细小病毒检测方法 编制说明 联系人 : 张钰 联系电话 : 编制单位 : 广东省实验动物监测所 时 间 :2017 年 3 月 31 日

2 一 任务来源根据中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会的下达的 2017 年团体标 准制 ( 修 ) 订计划, 由广东省实验动物监测所负责团体标准 实验动物大鼠细 小病毒检测方法 起草工作 该项目由全国实验动物标准化技术委员会 (SAC/TC281) 技术审查, 由中国实验动物学会归口管理 本标准的编制工作是按照 中华人民共和国国家标准 GB/T 标准化 工作导则 第 1 部分 标准的结构和编写规则 的要求进行编写的 本标准是在广 东省科技计划项目 广东省实验动物检测技术平台 ( 项目编号 2011B ) 课题基础上制定而成的, 在制定过程中参考了国内外相关文 献, 对方法的敏感性 特异性 重复性等进行了研究, 并对所建立的标准方法进 行了应用研究 二 编制过程 本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出, 广东省实验动 物监测所按照团体标准研制要求和编写工作的程序, 组成了由本单位专家和专业 技术人员参加的编写小组, 制定了编写方案, 并就编写工作进行了任务分工 编 制小组根据任务分工进行了资料收集和调查研究工作, 在广东省科技计划项目 广东省实验动物检测技术平台 ( 项目编号 2011B ) 课题研究基础 上, 组织编写实验动物大鼠细小病毒 RPV 株和 RMV 株检测方法技术资料 通 过起草组成员的努力, 多次修改 补充和完善形成了标准和编制说明初稿 2017 年 3 月, 标准草案首先征求中国实验动物学会实验动物标准化专业委 员会的意见, 专家对标准稿提出了系列修订建议和意见 根据提出的意见编制组 对 实验动物大鼠细小病毒检测方法 标准草案进行修改, 形成本标准征求意 见稿和编制说明 三 标准编制背景和意义 大鼠细小病毒 (RPV 株 ) 属于细小病毒科细小病毒属, 核酸为单股 DNA, 无 囊膜 目前至少存在 RPV-1 RPV-2 两种型, 大鼠细小病毒 (RPV 株 ) 对实验大鼠 危害严重, 成年大鼠感染多无临床症状, 免疫抑制等因素可激发该病 种鼠群感 染繁殖率下降 乳鼠感染表现发育不良 黄疸 运动失调等症状 该病毒还可以 污染肿瘤抑制物和细胞系, 对实验研究产生严重干扰 国外实验动物机构和国内 一些 CRO 公司都把 RPV 列为日常健康监测中的一个常规检测项目 目前 RPV

3 的检测方法主要是 ELISA 方法, PCR 检测也是 RPV 诊断的一种有效方法 大鼠细小病毒 (RMV 株 ) 属于细小病毒科细小病毒属, 核酸为单股 DNA, 无囊膜 大鼠细小病毒 (RMV 株 ) 对实验大鼠危害严重, 成年大鼠感染多无临床症状, 免疫抑制等因素可激发该病 种鼠群感染繁殖率下降 乳鼠感染表现发育不良 黄疸 运动失调等症状 该病毒还可以污染肿瘤抑制物和细胞系, 对实验研究产生严重干扰 国外实验动物机构和国内一些 CRO 公司都把 RMV 列为日常健康监测中的一个常规检测项目 目前 RMV 的检测方法主要是 ELISA 方法, PCR 检测也是 RMV 诊断的一种有效方法 本研究参照文献报道建立了大鼠细小病毒 RPV 株和 RMV 株 ELISA IFA 和 PCR 检测方法, 内容基本一致, 本编制说明的内容以 RPV 株为例 为了使该病原检测技术能更好地为生产服务, 特制定本检测方法标准 这一标准的制定, 对实验动物大鼠细小病毒 RPV 株的日常监测 流行病学调查及临床诊断都具有重要的实用意义 四 标准编制原则本标准的编制主要遵循以下原则 : 一是科学性原则 在尊重科学 亲身实践 调查研究的基础上, 制定本标准 二是可操作性原则 本标准无论是从样品采集, 处理, 分离培养鉴定, 均操作简单, 具有可操作性和实用性 三是协调性原则 以切实提高我国实验动物病原微生物检测技术水平为核心, 符合我国现行有关法律 法规和相关的标准要求 五 标准主要技术内容说明, 确定标准主要内容 ( 如技术指标 参数 公式 性能要求 试验方法 检验规则等 ) 的论据 ( 包括试验 统计数据 ) 本标准由范围 ; 规范性引用文件 ; 缩略语 ; 生物安全措施 ; 酶联免疫吸附试验 (ELISA); 免疫荧光试验 (IFA); 普通 PCR; 序列测定和附录共 9 章构成 现将 实验动物大鼠细小病毒 RPV 株检测方法 征求意见稿主要技术内容确定说明如下 : 1 本标准范围的确定本标准规定适用于实验动物大鼠细小病毒 RPV 株的检测 2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注明日期的引用文件, 仅注日期的版本适用于本文件 凡是不注日期的引用文件, 其最新版本 ( 包括所有的

4 修改单 ) 适用于本文件 GB 实验室生物安全通用要求 3 缩略语 为方便标准的使用, 本标准规定了以下缩略语 CPE 细胞病变效应 (cytopathic effect) Ct 值荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 (cycle threshold) ELISA 酶联免疫吸附试验 (enzyme-linked immunosorbent assay) IFA 免疫荧光试验 (indirect immunofluorescence assay) PBS 磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline) PCR 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction) RNA 核糖核酸 (ribonucleic acid) PCR 逆转录 - 聚合酶链式反应 (reverse transcription polymerase chain reaction) RPV 大鼠细小病毒 RPV 株 (rat theilovirus) 实时荧光 PCR 实时荧光逆转录 - 聚合酶链式反应 (real-time PCR) 4 生物安全措施 规定了实验操作及处理按照 GB 的规定执行, 由具备相关资质的工作人员进行相应操作 5 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 规定了 ELISA 检测方法的原理 试剂和材料 仪器和设备 操作步骤 结 果判定 本章内容主要依据国家标准 GB/T 实验动物酶联免疫 吸附试验 编写 6 免疫荧光试验 (IFA) 规定了 IFA 检测方法的原理 试剂和材料 仪器和设备 操作步骤 结果判 定 本章内容主要依据国家标准 GB/T 实验动物免疫荧光试验 编写 7 普通 PCR 规定了普通 PCR 检测方法的原理 试剂和材料 仪器和设备 操作步骤 结果判定 8 实时荧光 PCR 规定了实时荧光 PCR 检测方法的原理 试剂和材料 仪器和设备 操作步 骤 结果判定 9 序列测定

5 必要时, 可取待检样本扩增出的阳性 PCR 产物进行核酸序列测定, 序列结果与已公开发表的大鼠细小病毒 RPV 株特异性片段序列进行比对, 序列同源性在 90% 以上, 可确诊待检样本大鼠细小病毒 RPV 株核酸阳性, 否则判定大鼠细小病毒 RPV 株核酸阴性 9 附录 A 本标准附录为规范性附录, 给出了 PBS 配制方法 六 主要试验 ( 或验证 ) 的分析 ( 一 ) 大鼠细小病毒 RPV 株 PCR 检测方法 1 材料与方法 1.1 病毒大鼠细小病毒 RPV 株病料和大鼠细小病毒 RMV 株由本实验室保存 小鼠细小病毒 MVM 株 (MVM,ATCC VR-1346) 大鼠细小病毒 KRV 株 (KRV,ATCC VR-235) 大鼠细小病毒 H-1 株 (H-1,ATCC VR-356) 购自美国典型微生物菌种保藏中心, 1.2 引物设计合成利用 Primer Primer 5.0 引物设计软件, 根据 RPV 株的 VP1 序列, 设计扩增 RPV 特异性 PCR 引物 引物由 Invitrogern( 广州 ) 公司合成 表 1: 普通 PCR 扩增引物 病原引物引物序列 (5 3 ) 目的基因 产物大小 (bp) Forward CGCACATGTAGAATTTTTGCTG RPV Reverse CAAAGTCACCAGGCAATGTGTT VP1 487bp 1.3 病原微生物 DNA 提取 : 纯化的病毒样品 DNA 的抽提按病毒基因组提取试剂盒 ( 天根公司 ) 操作说 明书进行, 病毒 RNA 的抽提采用 Trizol 试剂 (Invitrogern 公司 ) 按说明书进行 盲肠内容物和粪便样品按照下面的方法预处理, 在装有样本的离心管中加入适量 灭菌的 PBS, 匀浆, 采用粪便基因组 DNA 提取试剂盒 ( 天根公司 ) 按说明书进 行抽提 1.4 普通 PCR 检测方法的建立 以 RPV 的基因组 DNA 为模板用各自引物进行 PCR 扩增,PCR 试剂采用

6 Takara 的 rtaq Premix, 反应体系为 20 μl:dna 模板 2 μl,premix Buffer 2 ( 含 Mg 2+ dntp rtaq 酶 )10μL, 上游引物 (10μM ) 1μL, 下游引物 (10μM) 1μL, 补 H2O 至 20μL 反应条件:94 5 min,94 1 min 55 1 min 72 1 min, 共 35 个循环, 最后 72 延伸 10min 反应完成后取 5μL 扩增产物,1.5% 琼脂糖凝胶电泳, 紫外灯下观察结果 1.5 特异性试验采用建立的 PCR 方法对 RPV RMV KRV H-1 MVM 和 MPV 的 DNA 进行检测, 验证 RPV 检测方法的特异性 同时将 RPV 阳性 PCR 产物送上海英潍捷基有限公司进行序列测定, 并用 NCBI 网站 Blast 软件对其进行核苷酸同源性分析, 验证产物的特异性 1.6 敏感性试验 RPV 质粒标准品的制备以提取的 RPV DNA 为模板, 用 Premix Ex Taq(Takara 公司 ) 进行 PCR, 反应体系为 :2 Premix Ex Taq 25μL, 上游引物 MVM-F (10μM ) 2.5μL, 下游引物 MVM-R (10μM) 2.5μL,DNA 5 μl, 加 RNase Free dh2o 至 50μL 反应条件:94 2 min, 一个循环 ;94 30sec 55 30sec 72 30sec, 共 35 个循环 ; 最后 72 延伸 5 min 反应得到目的大小片段后, 用胶回收试剂盒回收目的片段, 将回收的目的片段连接至 pmd-19t 载体, 并转化至 DH5α 感受态细胞中. 用含有 Amp 的 LB 琼脂平板筛选阳性克隆, 用 PCR 鉴定阳性克隆菌, 并对阳性重组质粒测序验证 用质粒提取试剂盒 (OMEGA 公司 ) 提取质粒, 微量紫外分光光度计测定浓度与纯度, 根据下面的公式计算拷贝数 拷贝数 (copies/μl) = (copies/mol) DNA 浓度 (g/μl)/ 质量 MW(g/mol) 其中,MW= DNA 碱基数 (bp) 660 daltons/bp,dna 碱基数 = 载体序列碱基数 + 插入序列碱基数 敏感性试验将质粒标准品用 Easy dilution(takara 公司 ) 做 10 倍系列稀释, 得到 ~ copies/μl 系列标准模板 按 1.4 所述方法进行检测, 测定模板最低检出量, 判定该方法的敏感度 1.7 在临床样本检测中的应用应用 RPV PCR 检测方法对 224 份 SPF 级小鼠的盲肠内容物或粪便样本进行

7 检测 同时应用 RMV 和 RPV PCR 检测方法对 50 只普通环境饲养小鼠的盲肠内容物进行检测 2 结果 2.1 普通 PCR 检测方法的建立以 RPV 的基因组 DNA 为模板用各自引物进行 PCR 扩增,PCR 试剂采用 Takara 的 rtaq Premix, 反应体系为 20 μl:dna 模板 2 μl,premix Buffer 2 ( 含 Mg 2+ dntp rtaq 酶 )10μL, 上游引物 (10μM ) 1μL, 下游引物 (10μM) 1μL, 补 H2O 至 20μL 反应条件:94 5 min,94 1 min 55 1 min 72 1 min, 共 35 个循环, 最后 72 延伸 10min 反应完成后取 5μL 扩增产物,1.5% 琼脂糖凝胶电泳, 紫外灯下观察结果 结果 RPV 阳性样本在 487bp 位置有一条目的条带, 与预期结果相符 ( 图 1) 图 1 RPV PCR 电泳结果 2.2 RPV PCR 检测方法特异性试验采用建立的 PCR 方法对 RPV RMV KRV H-1 MVM 和 MPV 的 DNA 进行检测, 验证 RPV 检测方法的特异性 结果显示只有 RPV 有目的条带, 其他病原核酸均为阴性, 表明建立的方法具有良好的特异性 ( 图 2)

8 图 2 RPV PCR 检测方法特异性试验结果图 M. DNA Marker DL2000; 1:RMV;2:H-1;3:KRV;4:MPV;5:MVM; 6 和 7:RMV 2.3 PCR 产物测序鉴定将 RPV 阳性 PCR 产物送上海英潍捷基有限公司进行序列测定, 并用 NCBI 网站 Blast 软件对其进行核苷酸同源性分析, 验证产物的特异性 测序结果表明 RPVPCR 产物大小分别为为 705bp 843bp 和 487bp, 与 GeneBank 中登录的核苷酸同源性为 99% 以上, 说明引物特性好 2.4 RPV PCR 检测方法敏感性试验将质粒标准品用 Easy dilution(takara 公司 ) 做 10 倍系列稀释, 得到 ~ copies/μl 系列标准模板 按 1.4 所述方法进行检测, 测定模板最低检出量, 结果 RPV 敏感性 copies/μl( 图 3) 图 3 RPV PCR 检测方法敏感性试验结果 M. DNA Marker DL2000; 1~ copies/μl~ copies/μl 质粒 DNA;11 和 12:NTC 2.5 在临床样本检测中的应用

9 应用 RPV PCR 检测方法对 224 份小鼠盲肠内容物或粪便样本进行检测, 结果 SPF 级小鼠样本中未检出 RPV 应用 RPV PCR 检测方法对 50 只普通环境饲养小鼠的盲肠内容物进行检测 RPV 检出 3 份阳性, 感染率为 6.0% 对 RPV 阳性样本进行测序, 结果证实为 RPV 七 采用国际标准和国外先进标准的程度, 以及与国际 国外同类标准水平的对比情况, 或与测试的国外样品 样机的有关数据对比情况没有相应的国外标准 八 与有关的现行法律 法规和强制性标准的关系本标准的编制依据为现行的法律 法规和国家标准, 与这些文件中的规定相一致 目前实验动物国家标准没有大鼠细小病毒 RPV 株检测方法标准, 本标准作为团体标准是对现有标准的有利补充 九 重大分歧意见的处理经过和依据本标准采用的技术方法比较成熟, 起草过程中无重大分歧意见 十 标准作为强制性标准或推荐性标准的建议本标准批准后作为推荐性标准使用 十一 贯彻标准的要求和措施建议 ( 包括组织措施 技术措施 过渡办法等内容 ) 本标准发布后, 将广泛组织宣传贯彻 十二 废止现行有关标准的建议无 十三 其他应予说明的事项无其他需说明的事项 十四 参考文献 [1] 田克恭. 实验动物病毒性疾病 [M]. 北京 : 中国农业出版社,1992, [2]Wan CH, Bauer BA, Pintel DJ, Riley LK.Detection of rat parvovirus type 1 and rat minute virus type 1 by polymerase chain reaction. Lab Anim Jan;40(1):63-9.

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