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袋翎顾
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1 核桃乳中掺大豆乳的鉴别研究张敬敬, 宋合兴, 刘博, 曹小妹, 高文惠 ( 河北科技大学生物科学与工程学院, 河北石家庄 ) 摘要 : 建立了一种用高效液相色谱法检测核桃乳中掺有大豆乳的方法样品用甲醇超声提取 20 min, 料液比为 1:9 ( 体积比 ), 在 4000 r/min 条件下离心 20 min 使用 Promosil C 18(4.6 mm 150 mm,5 μm) 色谱柱, 以甲醇 - 水作流动相进行梯度洗脱, 检测波长为 258 nm 结果表明, 通过对大豆异黄酮的检测, 可以有效地鉴别核桃乳中是否掺有大豆乳 ; 大豆苷和染料木苷的线性范围为 0.3~200 μg/ml, 大豆苷元和染料木素的线性范围 0.1~150 μg/ml 线性相关系数在和之间, 样品加标回收率为 80.73~116.44%, 相对标准偏差 4.62% (n=5), 检测限为 0.03~0.1 μg/ml, 该方法快速灵敏简便易行关键词 : 核桃乳 ; 大豆乳 ; 掺假 ; 高效液相色谱法文章篇号 : (2013) Identification of Adulteration in Walnut Milk Containing Soybean Milk ZHANG Jing-jing, SONG He-xing, LIU Bo, CAO Xiao-mei, GAO Wen-hui (College of Biological Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang , China) Abstract: A method for detection of adulteration in walnut milk containing soybean milk by high performance liquid chromatography was established. The extraction conditions were sample-methanol ratio 1:9 (V/V), ultrasonic time 20 min,and centrifugal time 20 min at 4000 r/min. The analysis was carried out with a column C18 (150 mm 4.6 mm, 5 μm) using methanol-water as gradient mobile phase at 258 nm. The results showed that walnut milk containing soybean milk was identified effectively through determination of soybean isoflavones. The linear ranges were 0.3~200 μg/ml for daidzin and genistin and 0.1~150 μg/ml for daidzein and genistein, respectively. The linear correlation coefficients were between and And the averrage recoveries were between 80.73% and %. The relative standard deviations (RSDs) were less than 4.62% (n=5) and the detection limits were 0.03~0.1 μg/ml. This method was fast, sensitive and simple. Key words: walnut milk; soybean milk; adulteration; high performance liquid chromatography 核桃乳是一种营养丰富的饮品, 含有蛋白质维生素 B 尼克酸以及多种微量元素, 其所含磷脂对脑神经有良好的保护作用 [1] 但核桃乳的原材料价格比较昂贵, 一些生产厂商受利益的驱使, 对核桃乳进行掺假, 使用价格低廉的大豆, 通过特定的加工工艺去除大豆腥味 [2], 然后将其掺入到核桃乳中, 使得核桃乳的成本大大的降低掺假的核桃乳使消费者和一些生产厂商的利益受到损失 ; 国内外关于核桃大豆中成分的检测有相关报道 [3~6], 但是关于核桃乳掺假的检测未见报道因此, 研究一种准确灵敏快速的检测方法以鉴别核桃乳是否掺假有着重要的意义大豆乳中含有大豆异黄酮, 本实验通过对产品中大豆异黄收稿日期 : 基金项目 : 河北省科技支撑计划项目 ( D); 石家庄市科技支撑计划项目 ( A) 作者简介 : 张敬敬 (1987-), 女, 在读研究生, 研究方向 : 食品安全与检测通讯作者 : 高文惠 (1963-), 女, 教授, 博士, 研究方向 : 食品安全与分离科学酮的分析, 来鉴别核桃乳中是否掺有大豆乳 1 材料与方法 1.1 材料与试剂材料 : 核桃乳 : 购自超市市场和自制核桃乳 ; 大豆乳 : 自制大豆乳试剂 : 甲醇 : 色谱纯, 天津市康科德科技有限公司 ; 乙腈 : 色谱纯, 天津市光复精细化工研究所 ; 磷酸 : 分析纯, 天津市光复精细化工研究所 ;95% 乙醇 : 分析纯, 天津市凯通化学试剂有限公司 ; 无水乙醇 : 分析纯, 天津市富宇精细化工有限公司 ; 大豆苷染料木苷大豆苷元染料木素标准品 ( 纯度 98%) 均购自上海纯优生物科技有限公司 1.2 仪器与设备日本岛津 LC-20A 高效液相色谱仪, 岛津国际贸易 ( 上海 ) 有限公司 ;SK5200LHC 型超声波清洗器, 上海科导超声仪器有限公司 ;LD5-2A 低速离心机, 北京雷勃尔离心机有限公司 ;phs-3s 酸度计, 萧山市鑫龙 881

2 医疗器械有限公司 ; Barnstead D3750 超纯水机, Thermo 公司 ; 科友牌 C 型玻璃仪器气流烘干器, 河南予华仪器有限公司 1.3 方法溶液的配制标准溶液的配制 : 分别称取大豆苷染料木苷大豆苷元染料木素各 100 mg, 用甲醇将其溶解并定容至 100 ml, 得到浓度均为 1 mg/ml 的大豆异黄酮标准溶液混合标品标准溶液的配制 : 分别移取浓度为 1 mg/ml 的大豆苷染料木苷大豆苷元和染料木素 340 μl 350 μl 200 μl 和 180 μl 于 1 ml 容量瓶中, 用甲醇定容, 过 0.45 μm 有机膜, 备用样品的制备及前处理核桃乳的制备 [7] : 称取去壳核桃仁 g, 置于 0.5% 氢氧化钠溶液中, 在 90 水中浸泡 15 min, 用清水反复冲洗, 加入 240 ml 95 热水, 用打浆机将其打碎, 过 200 目筛, 均质 ( 温度为 75, 压力为 30 MPa), 杀菌备用大豆乳的制备 [8] : 称取干大豆 g, 放入 45 的 0.3% 碳酸氢钠水溶液浸泡 6 h, 用清水冲掉附着的碱液制浆方法详见核桃乳打浆后, 需在 95 加热 15 min 灭酶准确量取 1 ml 样品于 10 ml 具塞比色管中, 用甲醇定容至 10 ml, 在 53 Hz 条件下超声 20 min, 再将其转移到 50 ml 离心管中在 4000 r/min 条件下离心 20 min 取上清液过 0.45 μm 有机滤膜, 备用高效液相色谱条件色谱柱 :Promosil C18(4.6 mm 150 mm,5 μm), 采用甲醇 - 水为流动相进行梯度洗脱, 洗脱程序为 :0~5 min 时甲醇为 40%;5~15 min 时甲醇为 60%, 体积流速为 1 ml/min, 检测波长为 258 nm, 柱温为 30 2 结果与讨论采用高效液相色谱法按照条件对处理后的样品进行检测峰面积的大小直接反映了提取试剂对待测组分的提取效果, 不同提取试剂对核桃乳和掺假核桃乳中大豆苷和染料木苷提取效果的影响见图 1 图 1 不同提取试剂对大豆异黄酮提取效果的影响 Fig.1 Effect of extracting reagents on extraction of soybean 注 :A: 掺假核桃乳中大豆苷的提取效果 ;B: 掺假核桃乳中染料木苷的提取效果 ;C: 核桃乳中大豆苷的提取效果 ;D: 核桃乳中染料木苷的提取效果通过图 1 可知, 用甲醇作为提取试剂时, 核桃乳和掺假核桃乳中的大豆苷和染料木苷的提取效果明显大于其它提取试剂, 并且提取液离心后, 用甲醇提取的样品相对澄清, 过膜容易故选用甲醇作为提取试剂提取时间的选择用甲醇作为提取试剂, 按照方法处理样品, 改变超声时间, 超声时间分别为 min 不同提取时间对核桃乳和掺假核桃乳中大豆苷染料木苷的提取效果影响见图样品前处理方法的优化大豆异黄酮中大豆苷和染料木苷的含量在 90% 以上 [9], 且四种大豆异黄酮成分性质相似, 故选用大豆苷和染料木苷标准品作为样品的添加实验优化前处理条件提取试剂的选择根据大豆异黄酮的分子结构和性质, 分别选用甲醇,80% 甲醇, 乙醇和 80% 乙醇提取液提取样品中的大豆异黄酮, 分别量取 1 ml 核桃乳和掺假核桃乳于 10 ml 具塞比色管中, 分别加入浓度为 1 mg/ml 的大豆苷和染料木苷各 18 μl 按照条件进行样品前处理, 图 2 不同超声时间对大豆异黄酮提取结果的影响 Fig.2 Effect of ultrasonic time on extraction of soybean 注 :A: 掺假核桃乳中大豆苷的提取效果 ;B: 掺假核桃乳中染料木苷的提取效果 ;C: 核桃乳中大豆苷的提取效果 ;D: 核桃乳中染料木苷的提取效果由图 2 可知, 提取时间为 20 min 时掺假核桃乳和核桃乳中大豆苷和染料木苷的提取效果高于提取时间为 882

3 10 min 时的提取效果,20 min 以后随着提取时间增长, 掺假核桃乳和核桃乳中大豆苷和染料木苷的提取效果无明显变化, 故确定提取时间为 20 min 提取频率的选择用甲醇作为提取试剂, 超声时间为 20 min, 按照方法处理样品, 改变超声波频率, 超声波频率分别为 53 Hz 和 35 Hz 其提取效果如表 1 所示表 1 不同超声频率对大豆异黄酮提取效果的影响 Table 1 Effect of ultrasonic frequency on extraction of soybean 超声频率 /Hz 核桃乳中的大豆苷的峰面积 /mv 核桃乳中的染料木苷的峰面积 /mv 掺假核桃乳中的大豆掺假核桃乳中的染料木苷峰面积 /mv 苷峰面积 /mv 由表 1 可知, 超声波频率为 53 Hz 时的提取率均高于 35 Hz 时的提取效果, 因为超声波频率增大时增加了空化作用, 相当于增加了样品组织的破坏速度, 增大传质动力, 使得相同时间内大豆苷和染料木苷转移到提取剂中的量增大, 改善了提取效果故提取频率选取 53 Hz 2.2 色谱条件的优化流动相配比的选择通过对比等度洗脱和梯度洗脱分离四种大豆异黄酮混合溶液, 可知等度洗脱时四种组分实现完全分离时需要 50 min, 梯度洗脱时在 15 min 内可以实现四种组分的完全分离, 且峰形尖锐故采用梯度洗脱技术在甲醇 - 水作流动相下, 考察了四种梯度洗脱情况 :(1)0~5 min 时甲醇 40%,5~15 min 时甲醇 60%; (2)0~5 min 时甲醇 40%,5~15 min 时甲醇 70%;( 3) 0~5 min 时甲醇 40%,5~15 min 时甲醇 80%;( 4)0~5 min 时甲醇 30%,5~15 min 时甲醇 60% 结果表明, 当洗脱程序为 (4) 时不能实现四种物质的完全分离, 其它三个配比条件均可实现四种物质的基线分离, 为了使样品中的物质与大豆异黄酮实现较好的分离, 实验选择梯度洗脱程序为 (1) 综上所述, 在最佳色谱条件下, 四种大豆异黄酮标准溶液的色谱分离图如图 4 所示从图中看出, 在 13 min 内四种大豆异黄酮实现了基线分离图 4 四种大豆异黄酮的色谱分离图图 3 不同 ph 流动相对四种大豆异黄酮的分离影响 Fig.3 Effect of ph of mobile phases on separation of the four 木素 soybean 注 :A~D 依次代表大豆苷染料木苷大豆苷元和染料检测波长的选择通过紫外扫描, 四种大豆异黄酮在 258 nm 处均有较大吸收, 故选取检测波长为 258 nm 流动相体系 ph 的选择调节水的 ph, 使其分别为 , 制备成一系列甲醇 - 水流动相, 然后对四种标品进行分离分析,pH 值对四种标品分离效果的影响如图 3 所示由图 3 可知,pH 值对四种标品保留时间无明显影响, 故实验选用超纯水作为流动相用水 Fig.4 HPLC chromatogram of the four soybean 2.3 线性关系和检测限将四种大豆异黄酮标品配制成一系列不同浓度 ( 浓度范围为 0.02~200 μg/ml) 的标准溶液, 在条件下进样分析, 绘制四种大豆异黄酮的线性关系曲线四种大豆异黄酮的线性方程线性相关系数线性范围和检测限见表 2 表 2 四种大豆异黄酮的线性关系和检测限 Table 2 Linearity and detection limit of the four soybean 大豆异黄酮线性方程线性相线性范围检测限关系数大豆苷 y=66799x ~ 染料木苷 y=79191x ~ 大豆苷元 y=98953x ~ 染料木素 y=56212x ~ 由表 2 结果可以看出, 该方法中大豆苷和染料木苷的线性范围为 0.3~200 μg/ml, 大豆苷元和染料木素的 883

4 线性范围为 0.1~150 μg/ml, 线性相关系数 r , 大豆苷和染料木苷的检测限为 0.1 μg/ml, 大豆苷元和染料木素的检测限分别为 0.03 μg/ml 和 0.05 μg/ml 2.4 样品测定与回收率实验样品测定按照的前处理方法处理样品, 然后在最佳色谱条件下分别测定掺假核桃乳和核桃乳样品, 样品色谱分离图见图 5 和图 6 图 5 核桃乳样品色谱图 Fig.5 HPLC chromatogram of walnut milk 大豆苷染料木苷大豆苷元染料木素平均回收率 /% RSD/% 平均回收率 /% RSD/% 平均回收率 /% RSD/% 平均回收率 /% RSD/% 平均回收率 /% RSD/% 平均回收率 /% RSD/% 平均回收率 /% RSD/% 平均回收率 /% RSD/% 由表 3 结果可以看出, 该方法的平均回收率在 80.7~116.4% 之间, 相对标准偏差 (RSD) 4.62% (n=5) 3 结论图 6 掺假 50% 核桃乳样品分离图 Fig.6 HPLC chromatogram of walnut milk of 50% adulteration 由图 4 和图 5 可知, 在掺假 50% 核桃乳样品中可以检测到大豆苷染料木苷大豆苷元和染料木素, 其含量分别为 μg/ml, 在核桃乳样品中四种大豆异黄酮均未检出回收率实验采用本方法对掺假核桃乳和核桃乳样品进行添加低水平和高水平的加标回收率实验其分析结果如表 3 所示表 3 不同添加水平的四种大豆异黄酮在掺假核桃乳和核桃乳中的回收率实验结果 (n=5) Table 3 Recoveries of the four soybean in walnut milk and adulterate walnut milk under different added levels 大豆异黄酮添加水平测定项目掺假核桃乳核桃乳本实验建立了一种简便快速灵敏的鉴别核桃乳中是否掺入大豆乳的检测方法该方法采用甲醇作为提取剂, 高效液相色谱法测定, 能够实现定性定量分析该方法中大豆苷和染料木苷的线性范围为 0.3~200 μg/ml, 大豆苷元和染料木素的线性范围为 0.1~150 μg/ml, 线性相关系良好 (r>0.99), 大豆苷和染料木苷的检测限为 0.1 μg/ml, 大豆苷元和染料木素的检测限分别为 0.03 μg/ml 和 0.05 μg/ml, 平均回收率在 80.73% 和 % 之间, 相对标准偏差 (RSD) 4.62%(n=5) 参考文献 [1] 李萍, 卢键鸣. 核桃的加工及其利用 [J]. 农产品加工, 2011, 5: [2] 范铮, 孙培龙, 赵培城, 等. 豆乳生产中去除豆腥味的工艺研究 [J]. 粮油加工与食品机械加工技术,2002,6:49-51 [3] 王晓燕, 张彩英, 贾晓艳. 河北省大豆品种脂肪酸组成与含量分析 [J]. 河北农业大学学报,2007,30(2):15-18 [4] A G Patil, M D Oak, S P Taware, et al. Nondestructive estimation of fatty acid composition in soybean Glycine max (L) Merrill seeds using Near-Infrared Transmittance Spectroscopy [J]. Food Chemistry, 2010, 120: [5] 毛晓英, 华欲飞, 卢伟. 核桃蛋白质的研究进展 [J]. 食品工业科技,2009,30(6): [6] 李艳艳, 周光明, 辛丹敏, 等.HPLC 法测定豆奶粉中四种大豆 884

5 异黄酮含量 [J]. 现代食品科技,2009,25(10): 王松, 丁立, 周荣琦.HPLC 法测定豆粕中大豆异黄酮的含量 [7] 于明, 何伟忠, 吴新凤. 鲜核桃乳工艺研究 [J]. 新疆农业科学, [J]. 化工进展,2005,24(2): , 47(10): [8] 范铮, 孙培龙, 赵培城, 等. 豆乳生产中去除豆腥味的工艺研究 [J]. 加工技术粮油加工与食品机械.2002,2:

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.

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