2009,29(7) 邓永康等 : 乳糖诱导重组尿酸酶基因在大肠杆菌中的表达 75 E.coliDH5α, 筛选出转化子然后用 NdeⅠ 和 Bam HⅠ 回收尿酸酶基因片段, 并将其插入 pet28a 的相同酶切位点之间, 得到重组质粒 pet?uricase, 将其转化 E.coli JM09(

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桓赵
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2009,29(7):74~79 乳糖诱导重组尿酸酶基因在大肠杆菌中的表达邓永康 2 吴民泸刘盛邦杜林方伍黎黎李曼孟延发 ( 四川大学生命科学学院成都成都医学院医学检验系成都 60083) 摘要对用乳糖替代异丙基?β?D? 硫代半乳糖苷 (IPTG) 诱导重组产朊假丝酵母尿酸酶基因在 E.coli JM09(DE3) 中表达进行了研究, 拟建立一种高效低成本的生产重组尿酸酶的工艺路线通过摇瓶试验对诱导所采用的乳糖浓度, 诱导时机和诱导持续时间进行了优化, 并考察在乳糖诱导下的目的产物表达动力学, 随后在 5L 发酵罐上进行扩大化培养以验证摇瓶优化的结果, 进一步将乳糖作为诱导剂应用于高密度发酵过程实验结果表明乳糖诱导的最佳浓度为 5g/L, 最佳诱导时机是对数生长期中后期, 诱导持续时间为 9~0h; 按照优化的条件在摇瓶和 5L 发酵罐上进行分批培养, 重组尿酸酶最大表达量可达菌体总蛋白的 26% 左右, 可溶性蛋白的 36% 左右, 略高于 IPTG 的诱导效果 ; 高密度发酵过程菌体终密度达到 OD 600 值 40 以上, 尿酸酶表达量占菌体总蛋白 25% 左右关键词尿酸酶乳糖诱导表达优化高密度发酵中图分类号 Q78 尿酸酶 (UrateOxidase,Uricase;EC.7.3.3) 是生物体内嘌呤代谢途径中的一种酶, 可以将尿酸氧化生成尿囊素二氧化碳和过氧化氢它广泛存在于植物真菌细菌及大多数哺乳动物组织中, 但鸟类爬行类和高等灵长类 ( 猿和人类 ) 缺乏这种酶, 所以尿酸就是这些生物体内嘌呤代谢的终产物尿酸及其盐类在血液中仅能维持很低的溶解度, 当人体内尿酸水平非正常的升高或者排泄减少, 就会形成高尿酸血症, 继而引发痛风等一系列疾病 [] ; 在临床上尿酸酶可以作为治疗高尿酸血症痛风和肿瘤溶解综合症的药物 [2], 也可以用于配制诊断试剂盒检测血清尿酸浓度 [3], 因此它是一种重要的医药用酶, 具有较高的市场价值目前国外已有多种来源的尿酸酶基因得到克隆表达并商品化, 广泛用于诊断试剂盒的配制, 其中拉布立酶 ( 重组黄曲霉尿酸酶 ) 被欧美批准用于临床预防治疗肿瘤化疗引起的急性高尿酸血症, 而国内虽然也有相关尿酸酶基因克隆高效表达的报道 [4~7], 但商品化程度远不如国外, 还是要大量进口国外产品以满足临床需求, 因此进行重组尿酸酶大规模生产研究很有必要收稿日期 : 修回日期 : 国家科技支撑计划资助项目 (2006BAF07B0) 通讯作者, 电子信箱 :yfmeng0902@63.com 目前文献报道的重组尿酸酶都是由 IPTG 诱导表达的, 然而 IPTG 价格较高且对人体有潜在毒性, 用于人用重组蛋白的工业化有局限性乳糖是一种廉价的二糖, 可以诱导携带 pet 表达质粒的 E.coliJM09(DE3) 的 lac 启动子表达 T7mRNA 聚合酶, 再由 T7mRNA 聚合酶诱导 pet 载体上的 T7 启动子表达目的蛋白本文以克隆在 pet 表达载体上的产朊假丝酵母尿酸酶基因为目的基因,pET28a 质粒为目的基因载体,E.coli JM09(DE3) 为宿主菌, 研究了乳糖诱导重组尿酸酶表达的基本参数并初步实现了 5L 全自动发酵罐规模的高密度诱导培养, 这将有助于建立一种高效低成本的重组尿酸酶生产方式材料与方法. 材料.. 菌种及构建背景含 pet?uricase 表达质粒的重组 E.coliJM09(DE3) 菌株在中国科学院微生物研究所构建, 主要参照文献 [4] 进行 : 尿酸酶基因 5 端引物中添加 HindⅢ 和 NdeⅠ 酶切位点,3 端引物中引入 BamHⅠ 酶切位点和终止密码子, 以提取出的产朊假丝酵母基因组 DNA 为模板进行 PCR, 产物通过 HindⅢ 和 BamHⅠ 位点克隆到 pbluescriptⅡ KS(+) 上并转化

2 2009,29(7) 邓永康等 : 乳糖诱导重组尿酸酶基因在大肠杆菌中的表达 75 E.coliDH5α, 筛选出转化子然后用 NdeⅠ 和 Bam HⅠ 回收尿酸酶基因片段, 并将其插入 pet28a 的相同酶切位点之间, 得到重组质粒 pet?uricase, 将其转化 E.coli JM09(DE3), 通过卡那霉素抗性筛选并经酶切检验得到表达尿酸酶的大肠杆菌工程菌..2 试剂胰化蛋白胨 (Tryptone) 和酵母粉 (Yeast Extract) 购自英国 OXOID 公司 ;IPTG 和硫酸卡那霉素购自 Merck 公司 ; 丙烯酰胺 (Acr) 及甲叉双丙烯酰胺 (Bis) 购自 Fluka 公司 ; 四甲基乙二胺 (TEMED) 购自 Bio?Rad 公司 ; 其余试剂均为国产分析纯..3 仪器 HZQ?C 型空气浴振荡器 ( 哈尔滨市东明医疗仪器厂 ); 高速冷冻离心机 (Eppendrf5804R); 紫外可见分光光度计 (Unico TM UC?202PC);VCX?750 超声波细胞粉碎机 (Sonics 公司 ); 电泳仪 (Bio?Rad 公司 PowerPAC300); 凝胶成像分析仪 (Bio?Rad 公司 76S/ 02324);5L 发酵罐 ( 江苏鼎兴生物工程公司 )..4 培养基种子培养基选用 LB 培养基 (g/l): Tryptone0,YeastExtract5,NaCl0; 摇瓶和上罐发酵培养基 (g/l):tryptone0,yeastextract5,nacl0, KH 2 PO 4 2,K 2 HPO 4 3,MgSO 4 7H 2 O0.2,Glycerol5; 补糖培养基 (g/l):glycerol200,mgso 4 7H 2 O5; 补氮培养基 (g/l):tryptone00,yeastextract00; 诱导液 (g/ L):Lactose200 种子培养基和摇瓶发酵培养基均含 50μg/ml 硫酸卡那霉素.2 方法.2. 工程菌摇瓶生长曲线从划线平板上挑取单菌落接种于 50ml(250ml 锥形瓶 )LB 培养基中,37, 200r/min 摇床过夜培养 2h,5% 接种于 00ml(500ml 锥形瓶 ) 发酵培养基中,37,200r/min 培养, 每隔 h 取样, 置于冰水中冷却, 用培养基适当稀释测定 OD 600, 以时间和 OD 值为横纵坐标, 绘制生长曲线.2.2 乳糖诱导最佳浓度确定以 5% 的接种量将种子液接入 600ml 发酵培养基中, 无菌条件下均分到 2 个 250ml 锥形瓶中, 于 37,200r/min 培养 7h 向瓶中分别加入不同浓度的乳糖溶液, 使终浓度分别达到 0.05, 0.,0.2,0.25,0.5,,2.5,5,0,5,20g/L, 诱导 7h 收获菌体 ; 另一瓶加入终浓度为 0.5mmol/L 的 IPTG, 诱导 4h 获菌体, 测定菌体 OD 600 并电泳分析表达量.2.3 最佳诱导时机的确定以 5% 的接种量将种子液接入 400ml 发酵培养基中, 无菌条件下均分 4 个 500ml 锥形瓶中, 分别在培养 0,3,7,h 时加入 200g/L 乳糖溶液, 使终浓度为 5g/L( 培养条件同前 ) 分别诱导 7~8h, 每隔或 2h 取样测定 OD 600 并进行菌体全蛋白电泳分析表达量.2.4 乳糖诱导持续时间的确定以 5% 的接种量将种子液接入 500ml 发酵培养基中, 无菌条件下均分到 0 个 250ml 锥形瓶中, 于 37,200r/min 培养到最佳诱导起始生长量后加入乳糖溶液使终浓度达到最佳诱导浓度, 持续诱导 0h, 每小时取出一瓶测定 OD 600 并电泳分析表达量.2.5 表达产物的分布按照优化后的乳糖诱导条件, 培养诱导重组尿酸酶, 诱导结束后取一定量发酵液,4,4000g 离心 0min 收集菌体, 按照 pet 载体损伤手册用适量超声缓冲液重悬菌体, 超声破碎后于 4,6000g 离心 5min 取上清, 沉淀用 %SDS 溶解, 电泳检测.2.6 发酵罐培养分批培养 : 在 5L 发酵罐中加入发酵培养基 4L,5 灭菌 30min, 接种量 5%, 流加 4mol/LNaOH 和 4mol/LHCl 控制发酵液中的 ph 为 7.0 左右通过调节搅拌转速和通气量使溶解氧大于 30% 饱和氧浓度,37 培养到最佳诱导时机后加入乳糖至最佳诱导浓度开始诱导分批补料培养 : 在 5L 发酵罐中装入 2L 发酵培养基,5 灭菌 30min, 以 5% 的接种量接入种子液后进行批式培养, 待溶氧迅速上升时, 开始流加补料液进行补料培养, 通过搅拌转速和通气量调节使溶氧维持在 40% 左右 ; 当 OD 值达到 35 时, 流加乳糖液至最佳诱导浓度, 开始诱导尿酸酶表达.2.7 乳糖和 IPTG 诱导效果比较方法在摇瓶和 5L 发酵罐中培养工程菌, 按照乳糖和 IPTG 各自的最佳诱导条件, 加入诱导剂诱导相应的时间, 收菌洗涤离心后, 取等量湿菌体用超声缓冲液按 (V V) 4 重悬, 超声破碎后于 4,6000g 离心 5min 取上清测定蛋白含量和酶活力, 并进行 SDS?PAGE 分析表达量.2.8 质粒稳定性检测方法在发酵过程中, 每隔 2h 取样, 用灭菌的生理盐水作适当稀释, 分别取 00μl 菌液涂布于不含硫酸卡那霉素 LB 平板, 置于 37 培养箱中培养 5h, 然后挑取 00 个单菌落点于含 50μg/ml 硫酸卡那霉素的 LB 平板上,37 培养 5h, 能在该平板上生长的菌落即含有质粒.2.9 生物量及目的蛋白表达量分析采用细菌光电比浊计数法, 用分光光度计测其 600nm 光吸收值表示菌体浓度 ; 取一定量的发酵液以 6000g 离心 0min 后去上清, 生理盐水洗涤离心后, 按文献 [8] 的方法进

76 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No.72009 行 SDS?PAGE, 而后用 Bio?Rad 凝胶成像仪扫描, QuantityOne 软件分析凝胶, 确定目的蛋白占菌体总蛋白的含量, 记为重组尿酸酶的表达量 (%).2.0 蛋白含量和酶活力测定蛋白含量测定采用 Bradford 法 [9], 以 BSA 为标准蛋白对照 ; 酶活定义及测定 [0] : 在 37 ph8.

3 76 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No 行 SDS?PAGE, 而后用 Bio?Rad 凝胶成像仪扫描, QuantityOne 软件分析凝胶, 确定目的蛋白占菌体总蛋白的含量, 记为重组尿酸酶的表达量 (%).2.0 蛋白含量和酶活力测定蛋白含量测定采用 Bradford 法 [9], 以 BSA 为标准蛋白对照 ; 酶活定义及测定 [0] : 在 37 ph8.5 条件下,min 内催化 μmol 尿酸分解所需要的酶量定义为一个酶活力单位 ; 具体过程 : 取 2.0ml 尿酸底物溶液 ( 含 0.00% 尿酸,pH8.5 的 50mmol/L 硼酸缓冲液,0.00% TritonX?00 和.0mmol/LEDTA 2Na), 加 0.5mlddH 2 O, 再取适当稀释的酶液 0.5ml,37 下准确反应 5min, 加入 0.2ml20% KOH 终止反应, 以水做空白, 在 290nm 处测定吸光值的减少 2 结果与分析图 2 不同浓度乳糖诱导 7h 时尿酸酶表达量和菌体密度 Fig.2 Expresionlevelofuricaseandceldensity inducedfor7hwithdiferentconcentrationoflactose 2. 工程菌摇瓶生长曲线如图所示, 工程菌在摇瓶中培养.5h 后进入对数生长期,0h 开始进入对数生长期末期, 约 3~4h 后进入稳定期图重组 E.coliJM09(DE3) 的摇瓶生长曲线 Fig. GrowthcurveofE.coliJM09(DE3) inshakeflask 图 3 不同浓度乳糖诱导 7h 时的 SDS?PAGE 分析 Fig.3 SDS?PAGEanalysisofexpresionprotein inducedfor7hwithdiferentconcentrationoflactose Lane:Purifieduricase;Lane2:InducedbyIPTG(0.05mmol/L); Lane3~3:Inducedbylactosewithdiferentconcentration(0.05, 0.,0.2,0.25,0.5,,2.5,5,0,5,20g/L) 后期加入乳糖进行诱导的效果比较理想 2.2 乳糖诱导最佳浓度确定从图 2,3 可以看到不同终浓度的乳糖均能诱导尿酸酶表达, 当浓度为 5g/L 时不仅得到了较高的表达量 (24.3%) 而且菌体生物量最大, 表明在此浓度时, 菌体对乳糖的分配利用最为合理, 既有效促进了生长又充分发挥了诱导效果所以确定乳糖诱导最佳浓度为 5g/L 2.3 最佳诱导时机的确定从工程菌摇瓶生长曲线上可以看出所选择的四个生长点 :0,3,7 和 h 对应于菌体生长的延滞期, 对数生长期初期, 对数生长期中后期和对数生长期末期由图 4~9 可知, 在菌体生长各个阶段加入乳糖至 5g/L 均能诱导尿酸酶表达, 表达量和菌体生物量随着诱导时间的延长而变化, 在培养 7h 左右即菌体对数生长中图 4 在延滞期 (0 时 ) 加入乳糖进行诱导的 SDS?PAGE 分析 Fig.4 SDS?PAGEanalysisofaddinglactosefor inductionatthelagphase(0hour) Lane:Purifieduricase;Lane2~8:Expresionofuricasefromthe 2ndhourto8thhourafteraddinglactose;Lane9:Expresionof uricaseatthe0thhourafteraddinglactose 2.4 乳糖诱导持续时间的确定在菌体对数生长期中后期加入终浓度为 5g/L 的

4 2009,29(7) 邓永康等 : 乳糖诱导重组尿酸酶基因在大肠杆菌中的表达 77 图 5 在对数生长期初期 (3h) 加入乳糖进行诱导的 SDS?PAGE 分析 Fig.5 SDS?PAGEanalysisofaddinglactose forinductionattheinitialstageoflogphase (the3rdhour) Lane:Purifieduricase;Lane2~9:Expresionof uricasefromthesthourto8thhourafteraddinglactose 图 8 在不同生长点加入乳糖后的尿酸酶表达动力学 Fig.8 Expresiondynamicsofuricaseafteradding lactoseatdiferentgrowingpoints 图 6 在对数生长期中后期 (7h) 加入乳糖进行诱导的 SDS?PAGE 分析 Fig.6 SDS?PAGEanalysisofaddinglactosefor inductionatthemidanaphaseoflogphase(the7thhour) Lane:Purifieduricase;Lane2~8:Expresionof uricasefromthestto7thhourafteraddinglactose 图 9 在不同生长点加入乳糖后的菌体生长曲线 Fig.9 Growthcurvesofbacteriaafteradding lactoseatdiferentgrowingpoints 图 7 在对数生长期末期 (h) 加入乳糖进行诱导的 SDS?PAGE 分析 Fig.7 SDS?PAGEanalysisofaddinglactosefor inductionattheendstageoflogphase(thethhour) Lane:Purifieduricase;Lane2~9:Expresionof uricasefromthesthourto8thhourafteraddinglactose 乳糖连续诱导 0h, 结果显示 ( 图 0~) 尿酸酶的表达量在诱导 9~0h 后基本达到恒定 ( 约为 26%), 在诱导 6h 后菌体生长进入稳定期, 所以确定乳糖诱导的持续时间为 9~0h 图 0 诱导持续时间对菌体生长和尿酸酶表达的影响 Fig.0 Efectcurvesofinductionpersistence timeonbacterialgrowthanduricaseexpresion 2.5 表达产物的分布和诱导效果比较采用优化的条件对工程菌进行培养诱导后, 按.2.5 和.2.7 方法处理菌体,SDS?PAGE( 图 2) 显示乳糖诱导表达的尿酸酶主要以可溶形式存在于胞内, 有少量以包涵体形式存在, 与用 IPTG 诱导的情况一致表达量分析显示, 在乳糖诱导下尿酸酶表达量占菌体总蛋白的 26% 左右, 占可溶性蛋白的 36% 左右, 略高于 IPTG 的诱导效果 ; 调整乳糖和 IPTG 诱导所得上

5 78 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No 图诱导持续时间对尿酸酶表达影响的 SDS?PAGE 分析 Fig. SDS?PAGEanalysisoftheefectofinduction persistencetimeonuricaseexpresion Lane~0:Expresionofuricaseinduced bylactosefordiferenttime(hto0h) 图 3 5L 发酵罐中分批培养结果 Fig.3 Resultsofbatchculturein5Lfermentor 清液的蛋白浓度一致 ( 约 3.5mg/L), 测得二者酶活分别为 78.7U/ml 和 77.6U/ml 图 4 5L 发酵罐中分批补料培养结果 Fig.4 Resultsoffed?batchculturein5Lfermentor 图 2 表达产物的分布 Fig.2 Distributionofexpresionproduct Lane~4:Totalsolubleprotein,inclusionbody,totalbacterial proteinandbrothwithiptgasinducer Lane5~8:Totalsolubleprotein,inclusionbody,totalbacterial proteinandbrothwithlactoseasinducer 2.6 发酵罐培养按照优化后的条件, 利用 5L 发酵罐进行分批发酵, 从图 3 可以看到, 与摇瓶培养相比, 尿酸酶的最终表达量没有变化, 但是 ph 和溶氧的改善使发酵周期缩短了 3~4h, 同时生物量也有提高分批补料培养过程如图 4 所示, 接种后随着菌体生长, 溶氧持续下降, 培养到 5h 左右, 溶氧开始迅速上升, 表明罐中营养物质基本耗尽, 当超过 50% 时, 流加补糖培养基, 使菌体比生长速率维持在 0.2~0.3/h; 当 OD 600 达到 27 左右时, 停止补糖, 流加补氮培养基 ; 当 OD 600 接近 35 时, 停止补氮, 流加乳糖至终浓度为 5g/L, 诱导 0h 后尿酸酶表达量约占菌体总蛋白的 25%, 而酶活约为 75U/ml( 蛋白含量约为 4mg/ml), 菌体密度达到 OD 600 约 44 取样检测上罐培养过程中菌体质粒稳定性, 结果表明分批培养全过程质粒分裂稳定性为 00%; 分批补料培养过程中补料培养阶段质粒出现丢失, 其分裂稳定性从 00% 下降到 93%, 这导致诱导阶段尿酸酶表达量下降, 其原因可能与补料培养阶段菌体比生长速率控制不合理有关系, 使得质粒的复制速度跟不上菌体分裂的速度, 这需要在以后的工作中进一步优化 3 结论本文以 E.coliJM09(DE3) 为表达宿主菌, 质粒 pet28a 为尿酸酶基因载体, 研究了以乳糖替代 IPTG 作为诱导剂时, 乳糖浓度诱导时机和诱导持续时间三个因素对目的产物表达和菌体生长的影响, 从而分析得到适合该工程菌株生长和诱导的最佳条件结果表明, 在对数生长期中后期添加乳糖至终浓度为 5g/L 并持续诱导 9~0h 对该工程菌的生长和诱导十分有利, 尿酸酶的表达量能够达到菌体总蛋白的 26% 左右, 可溶性蛋白的 36% 左右 ; 在 5L 发酵罐中进行高密度培养, 菌体密度达到 OD 600 约 44, 表达的尿酸酶约占菌体总蛋白 25.%, 发酵工艺还需进一步优化以 IPTG 为诱导剂的原核表达系统用乳糖替代 IPTG 进行诱导在理论上是完全可行的, 目前国内利用

6 2009,29(7) 邓永康等 : 乳糖诱导重组尿酸酶基因在大肠杆菌中的表达 79 乳糖诱导重组蛋白表达的应用研究多有报道 [0~2], 但多数表明乳糖诱导效果不及 IPTG, 这可能与选用的宿主菌, 目的基因质粒载体以及目的基因本身性质有关本文的研究表明对于尿酸酶基因而言,E.coliJM09 (DE3)/pET28a 是一种适宜于采用乳糖作为诱导剂的表达系统, 并且乳糖的诱导效果能够高于 IPTG 参考文献 []OdaM,SataY,TakenakaO,etal.Losofurateoxidase activityinhominoidsanditsevolutionaryimplications.molbiol Evol,2002,9(5):640~653 [2]RoncoC,BelomoR,InguaggiatoP,etal.Rasburicasetherapy inacutehyperuricemicrenaldysfunction. Contrib Nephrol, 2004,44:58~65 [3]DuncanPH,GochmanN,CooperT,etal.A candidate referencemethodforuricacidinserum.i.optimizationand evaluation.clinchem,982,28(2):284 [4] 朱献军, 刘建国, 黎高翔. 尿酸氧化酶基因的克隆表达及其产物应用. 生物工程学报,200,7():68 ZhuXJ,LiuJG,LiGX.ChineseJournalofBiotechnology, 200,7():68 [5] 吴伟立, 李彦英, 苗林, 等. 尿酸氧化酶的表达纯化及活性形式鉴定. 军事医学科学院院刊,2005,29(2):24~26,3 WuW L,LiY Y,MiaoL,etal.BulAcadMilMedSci, 2005,29(2):24~26,3 中国药科大学学报,2005,36(5):464~467 Liu G Z, Chen J H. JournalofChina Pharmaceutical University,2005,36(5):464~467 [7]LiJM,ChenZ,HouLH,etal.High?levelexpresion, purification, and characterization ofnon tagged Aspergilus XavusurateoxidaseinEscherichiacoli.ProteinExpresionand Purification,2006,49:55~59 [8]AusubelFM,BrentR,KingstonRE,etal.ShortProtocolsin MolecularBiology.3 rd ed,newyork:johnwiley& SonsInc, ~35 [9] 汪家政, 范明. 蛋白质技术手册. 北京 : 科学出版社,2002 WangJZ,FanM.ProteinTechnologyManual.Beijing:Science Pres,2002 [0] 张毅, 屈贤铭, 杨胜利. 乳糖作为诱导剂对重组目的蛋白表达的影响. 生物工程学报,2000,6(4):464~468 Zhang Y, Qu X M, Yang S L. Chinese Journal of Biotechnology,2000,6(4):464~468 [] 李兆鹏, 张栩, 徐斌, 等. 重组大肠杆菌高密度发酵中乳糖诱导表达 hblys. 过程工程学报,2005,5(4):446~449 LiZP,ZhangX,XuB,etal.TheChineseJournalofProces Engineering,2005,5(4):446~449 [2] 李春丽, 陈其新, 何国庆. 乳糖诱导植物甜蛋白 des?pglu? Brazein 在大肠杆菌中的表达. 生物工程学报,2006,22 (6):02~025 LiC L, Chen Q X, He G Q. Chinese Journal of Biotechnology,2006,22(6):02~025 [6] 刘广桢, 陈建华. 尿酸酶产生菌的筛选基因克隆及表达. ExpresionofRecombinantUricaseinE.coliJM09(DE3)InducedbyLactose DENGYong?kang WUMin?lu 2 LIUSheng?bang DULin?fang WULi?li LIMan MENGYan?fa (ColegeofLifeScience,SichuanUniversity,Chengdu 60064,China) (2DepartmentofLabMedicine,ChengduMedicalColedge,Chengdu 60083,China) Abstract UsinglactoseasasuccedaneousinducerofIPTGtoinducetheexpresionofCandidautilisuricase geneclonedine.colijm09(de3)wasdeeplyinvestigatedforestablishingahigh?performancebutlow?costmethodof recombinanturicaseproduction.theadoptedlactoseconcentrationforinduction,thetimepointofinduction,the durationofinductionandthedynamicsofuricaseexpresionwereoptimizedandstudiedindetailbyshakeflask experiment.theresultsofoptimizationwereverifiedbyenlargedfermentationin5lfermentorandthenlactosewas usedastheinducerinthehighdensityfermentation.asshowedbytheexperiments,thebestinducingconcentrationof lactosewas5g/l,themidanaphaseoflogarithmicphasewasthebesttimeforinductionandthedurationofinduction were9~0h;accordingtotheoptimumconditions,comparedwithiptg,bothintheshakeflaskand5lfermentor withbatchculture,thebeterinducingefectcouldbeobtained:theexpresionlevelofuricasewasabout26% ofthe totalbacterialproteinandabout36% ofthesolubleprotein,thefinalceldensity(od 600 )wasover40inthe5l fermentoranduricaseexpresionlevelwasabout25% withhighdensityfermentation. Keywords Uricase Lactose Inducedexpresion Optimization Highdensityfermentation

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材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌