2009,29(10) 张姝等 : 基因重组大肠杆菌表达 HrpNEcc 蛋白的发酵条件及诱导条件优化 45 联电子技术开发有限公司 ),QL?861 振荡仪 ( 江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司 ),Belta320pH 计 ( 梅特勒? 托利多仪器有限公司 ),DHP?9052 电热恒温培养箱

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士金
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2009,29(10):44~49 基因重组大肠杆菌表达 HrpNEcc 蛋白的发酵条件及诱导条件优化张 1,2 姝王 2 敏 2 韩梅琳 2 马荣才陈 1 强 2 高俊莲 (1 四川农业大学资源环境学院微生物学系雅安北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心北京 ) 摘要对已构建好的表达 HrpNEcc 蛋白的工程菌 BL21(DE3)/pET30a(+)hrpNEcc 的摇瓶发酵条件及乳糖诱导进行优化, 通过在 7L 发酵罐中放大发酵实验, 以期提高蛋白产量并降低生产成本在摇瓶中优化的发酵及诱导条件是 :5% 的接种量,TB 培养基, 菌体培养至对数生长前期, 添加 3g/L 外源诱导剂乳糖时,HrpNEcc 蛋白产量可达 mg/L, 比不添加乳糖时提高了 36.73%, 比用 IPTG 诱导时提高了 16.85% 7L 发酵罐中发酵, 获得菌体湿重达到 57.24g/L (WCW), 可溶性 HrpNEcc 蛋白产量占细胞总蛋白的 50.2%, 为 3.29g/L 关键词 HrpNEcc 蛋白重组大肠杆菌发酵及诱导条件优化中图分类号 Q Hrp 基因 (hypersensitivereactionandpathogenicity gene) 是决定病原菌对寄主植物致病性和诱导非寄主植物过敏反应的基因 Hrp 基因簇中的 hrpn(hrpz,hrpw) 基因编码的胞外分泌蛋白 Harpins 是引发非寄主植物过敏性反应的主要因子, 能广泛诱导植物对病虫害和逆境胁迫的防卫反应机制, 并刺激植物的生长发育系统, 对作物具有显著的增产效果 [1] 自 1986 年首次报道 hrp 基因以来, 人们对植物病原细菌 hrp 基因的分布结构功能等方面进行了广泛的研究本实验室从大白菜软腐病组织中分离鉴定了一株新的胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种 (Erwinia carotovora subsp. carotovora,ecc)bc1 [2], 从中克隆了 hrpnecc 基因, 构建了基因工程菌 EscherichiacoliBL21(DE3)/pET30a (+)hrpn Ecc, 温室实验表明, 由该工程菌表达的 HrpNEcc 蛋白能够有效防治胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种 (Erwiniacarotovorasubsp.carotovora) 引起的蔬菜花卉的软腐病 [3] 本研究对已构建好的大肠杆菌基因工程菌 BL21(DE3)/pET30a(+)hrpNEcc 摇瓶发酵收稿日期 : 修回日期 : 北京市科学技术委员会农业科技成果转化专项 (Z ) 北京市科学技术委员会重大项目专项 (Z ) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :qiangchencq@ yahoo.com.cn;gaojunlian@ baafs.net.cn 条件及基因表达的诱导条件进行优化, 以确定出适合工程菌生长的摇瓶培养条件及 HrpNEcc 蛋白表达的诱导条件, 并进行 7L 发酵罐发酵试验, 旨在为实现 HrpNEcc 蛋白低成本高产量的大规模生产奠定基础 1 材料与方法 1.1 材料供试菌株及来源含 hrpnecc 基因的工程菌 E.coliBL21(DE3)/pET30a(+)hrpNEcc, 卡那霉素抗性, 由本实验室构建并保存培养基 [4] LB,TB,LB+M9,2 YT+M9, 改进的 SB( 酵母提取物 20g, 蛋白胨 32g,NaCl5g) 培养基发酵罐培养基 : 酵母提取物 80g, 蛋白胨 48g,KH 2 PO g,K 2 HPO g, 丙三醇 16ml, 泡敌 4ml; 补料液培养基 : 酵母提取物 25g,60% 甘油 800ml,50% 氨水 400ml,1mol/LHCl200ml 仪器与试剂考马斯亮蓝 R 250(Amresco), 牛血清白蛋白 ( 上海生工 ) 考马斯亮蓝 G 250(BBI), IPTG( 异丙基硫代半乳糖苷 )(Amresco), 蛋白胨 (OXOID), 酵母提取物 (yeastextract, 简称 YE), 其它试剂均为分析纯 Spectrum722E 型可见分光光度计 ( 上海光谱 ), 美国 NBSBioFlo1107L 发酵罐, 蛋白电泳仪 ( 北京六一仪器厂 ),HZQ?QX 全温振荡器等 ( 哈尔滨东

2 2009,29(10) 张姝等 : 基因重组大肠杆菌表达 HrpNEcc 蛋白的发酵条件及诱导条件优化 45 联电子技术开发有限公司 ),QL?861 振荡仪 ( 江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司 ),Belta320pH 计 ( 梅特勒? 托利多仪器有限公司 ),DHP?9052 电热恒温培养箱 ( 上海一恒科技有限公司 ) 1.2 方法摇瓶种子培养挑取一环 % 甘油保存的菌种, 接种于 LB 固体培养基中,37 培养 24h, 然后挑单菌落于 100mlLB 摇瓶培养基中,37,200r/min 过夜培养接种量优化分别以 1% 3% 5% 7% 9% 的接种量接种于 100mlLB 液体培养基中,37,200r/min 振荡培养 12h, 定时取样测摇瓶发酵培养将种子液接种于 100ml 发酵培养基中, 接种量 5%,37,200r/min 振荡培养 12h 分析方法 (1) 细胞密度 ( ) 测定 : 发酵液经稀释适当倍数后, 用可见分光光度计在 600nm 处测其光吸收值 (2)HrpNEcc 蛋白表达量测定 : 工程菌发酵结束后, 从摇瓶发酵液中取 0.5ml 置于 1.5ml Eppendorf 离心管中,4,10000r/min 高速离心 1min, 弃上清得菌体将菌体重悬于 250μl 蒸馏水中, 取 40μl 加入 10μl5 蛋白上样缓冲液,100 水煮裂解 10min,6000r/min 离心 3min, 取上清液 10μl 上样, 进行 SDS PAGE 电泳 (15% 分离胶,5% 浓缩胶 ), 具体操作步骤详见参考文献 [5] (3) 蛋白质浓度测定 : 采用考马 [6] 斯亮蓝染色法法测定 (4)HrpNEcc 蛋白含量测定 : 考马斯亮蓝染色法测定菌体总蛋白后, 采用 Bandscan 软件扫描 SDS?PAGE 电泳图, 分析出每条泳道 HrpNEcc 蛋白占菌体总蛋白的百分含量, 再根据菌体总蛋白量与 HrpNEcc 的百分含量计算出 HrpNEcc 蛋白含量培养基配方的优化选用 LB TB 改进的 SB LB+M9 和 2 YT+M95 种常用的工程菌发酵培养基, 按节描述的方法培养, 在培养至等于 2.0 时加入浓度为 1mmol/LIPTG 进行诱导,12h 后测定和蛋白质浓度乳糖诱导条件的优化 (1) 乳糖浓度的确定摇瓶培养至等于 2.0 时, 加入 3g/L 6g/L 9g/ L 12g/L 15g/L 等不同浓度的乳糖, 并以不添加乳糖和只添加 1mmol/LIPTG 作为对照,37,200r/min 振荡培养, 发酵 12h 后测和 HrpNEcc 蛋白产量 (2) 乳糖诱导时机的确定 : 分别在对数生长的前期中期后期加入外源诱导剂乳糖, 发酵至 12h 测和 HrpNEcc 蛋白产量 L 发酵罐培养 (1) 制备种子液 : 挑取转化的单菌落于 5mlLB(Kan + ) 培养液中活化后, 转接于含 200mlLB 培养基 1000ml 摇瓶中,37,200r/min 振荡培养 12h (2) 按 5% 接种量接种种子液于发酵罐中 (Kan + ), 发酵温度控制在 37, 通气量为 4L/min, 罐中的起始工作体积为 4L (3) 设定搅拌转速与溶氧偶联, 发酵初始阶段为分批培养阶段, 溶氧逐渐下降, 当基础料中碳源耗尽, 溶氧在短时期迅速上升时, 进入补料阶段, 按 5% 流速 ( 即每 20min 内流加补料时间为 1min) 流加补料物, 整个发酵过程中用 50% 氨水和 1mol/LHCl 控制发酵液 ph 值为 6.8~7.0 (4) 在菌体对数生长前期添加外源诱导剂 3g/L 乳糖进行诱导, 每小时取样测定, 发酵结束后, 收获培养物, 10000r/min 离心 15min, 收集菌体, 测定蛋白质浓度 2 结果与分析 2.1 接种量的优化从图 1 可以看出, 除 1% 的接种量外, 其余几条曲线几乎重叠, 按 3% 5% 7% 9% 接种培养基后菌体的生长速度差不多, 考虑到在大规模发酵过程中, 接种量过小菌体增殖缓慢和接种量过大对菌体生长和酶转化得率会产生一定抑制作用, 因此确定 5% 为最佳接种量图 1 接种量对重组大肠杆菌 BL21(DE3)/ pet30a(+)hrpnecc 生长的影响 Fig.1 Efectofinoculationvolumeonthegrowthofthe recombinante.colibl21(de3)/pet30a(+)hrpnecc 2.2 培养基的筛选从图 2 可以看出, 重组大肠杆菌 E.coliBL21 (DE3)/pET30a(+)hrpNEcc 在 TB 培养基中生长迅速, 培养 12h 后为 10.33, 且蛋白产量也是 5 种培

46 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No.102009 养基中最高, 为 698.94mg/L 而用 LB 培养基培养后仅为 5.1, 细胞总蛋白为 318.7mg/L, 仅为 TB 培养基的 45.60% 图 3 添加不同浓度乳糖后 HrpNEcc 蛋白的 SDS?PAGE Fig.3 SDS?

3 46 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No 养基中最高, 为 mg/L 而用 LB 培养基培养后仅为 5.1, 细胞总蛋白为 318.7mg/L, 仅为 TB 培养基的 45.60% 图 3 添加不同浓度乳糖后 HrpNEcc 蛋白的 SDS?PAGE Fig.3 SDS?PAGEanalysisoftheexpresion ofhrpneccproteinafteraddingdiferent 图 2 不同培养基对菌体和蛋白产量的影响 Fig.2 Efectofdiferentmedium onceldensity andcelartotalproteinyield 2.3 乳糖诱导条件的优化乳糖浓度的优化采用不同浓度的乳糖进行诱导表达后, 工程菌 E.coliBL21(DE3)/pET30a(+) hrpnecc 的蛋白表达情况见图 3, 从图 3 可以看出, 不添加乳糖时, 用 TB 培养基培养 E.coliBL21(DE3)/ pet30a(+)hrpnecc, 已可观察到 HrpNEcc 蛋白大量表达 ( 见泳道 1) 但当添加 3g/L 和 6g/L 乳糖时, HrpNEcc 蛋白表达条带加粗, 说明添加少量乳糖能够提高 HrpNEcc 蛋白产量结合泳道 7 可以看出, 乳糖完全能够代替 IPTG 诱导 HrpNEcc 表达蛋白产量定量分析结果如表 1 所示, 不添加乳糖时, 发酵终点时, 细胞总蛋白为 mg/L,HrpNEcc 蛋白产量为 mg/L; 添加 3g/L 乳糖和 6g/L 乳糖时, 细胞总蛋白和 HrpNEcc 蛋白产量均大大增加, 并且高于用 1mmol/LIPTG 诱导后细胞总蛋白和 HrpNEcc 蛋白产量 ; 随着乳糖含量的继续添加, 细胞总蛋白和 HrpNEcc 蛋白产量反而下降, 可能高浓度乳糖对蛋白的表达有一定的抑制作用且从表 1 可以看出, 添加 6g/L 乳糖时,HrpNEcc 蛋白产量为 mg/L, 添加 3g/L 乳糖时,HrpNEcc 蛋白产量为 mg/L, 比不添加乳糖时提高了 36.73%, 比用 IPTG 诱导时提高了 16.85% 而添加 3g/L 乳糖与添加 6g/L 乳糖时得到的 HrpNEcc 蛋白产量相差不大因此, 确定乳糖最适添加量为 3g/L 表 1 添加不同浓度乳糖对 HrpNEcc 蛋白产量的影响 Table1 Efectofaddingdiferentconcentration concentrationslactose M:LWM ProteinMarker(kDa);1~6:Adding0g/L,3g/L, 6g/L,9g/L,12g/L,15g/Llactoserespectively; 7:Adding1mmol/LIPTG lactoseonhrpneccproteinyield 诱导剂浓度细胞总蛋白 (mg/l) HrpNEcc 蛋白 (mg/l) 乳糖 0g/L 乳糖 3g/L 乳糖 6g/L 乳糖 9g/L 乳糖 12g/L 乳糖 15g/L IPTG 1mmol/L 诱导时机的优化从图 4 和表 2 可以看出, 不同的诱导时期添加 3g/L 乳糖时, 细胞总蛋白和 HrpNEcc 蛋白产量均有所不同在对数生长前期 ( 即 =2) 时添加乳糖, 细胞总蛋白产量为 mg/L,HrpNEcc 蛋白产量为 mg/L, 比在对数生长中期 ( 即 =5) 和对数生长后期 ( 即 =7) 添加时 HrpNEcc 蛋白产量分别增加了 18.45% 和 32.90% 因此, 确定乳糖的最佳添加时间为菌体对数生长前期表 2 诱导时期对 HrpNEcc 蛋白产量的影响 Table2 Efectofdiferentinductionperiod onhrpneccproteinyield 诱导时期细胞总蛋白 (mg/l) HrpNEcc 蛋白 (mg/l) 对数生长前期对数生长中期对数生长后期升发酵罐发酵发酵前期采用 DO?stat 方式培养, 以期得到较快的比生长速率, 当设备的供氧能力达到上限以后,DO( 溶氧 ) 会在短时期内迅速上升, 此

4 2009,29(10) 张姝等 : 基因重组大肠杆菌表达 HrpNEcc 蛋白的发酵条件及诱导条件优化 47 图 4 不同诱导时期 HrpNEcc 的 SDS?PAGE 分析 Fig.4 SDS?PAGEanalysisofHrpNEcc proteinduringdiferentinductionperiod M:LWM ProteinMarker(kDa);1~3:Addinglactoserespectively ontheprophase,metaphaseandanaphaseoftogarithmicphase 时进入补料阶段, 不断补入碳源的同时, 用盐酸和氨水控制发酵液的 ph 值, 使发酵液 ph 值保持在 7.0 左右, 直到发酵结束从图 5 可以看出, 发酵至第 2h, 发酵罐还能为菌体生长提供足够的氧气,DO 为 23.3%; 到第 3h 下降为 0.4%; 发酵至第 5h 时,DO 由 0.1% 急剧上升至 20%, 成为补料的标志此时按 5% 的流速泵入补料液, 首先流加限制性底物甘油和酵母提取物, 随着菌密度的增长, 逐步提高补料速率, 提高生物量, 在对数生长前期 ( 发酵至第 7h, =21.08) 时, 加入 3g/L 乳糖由摇瓶实验结果可知, 高浓度乳糖存在抑制效应, 故乳糖的加入采用流加的方式培养至 23h, 菌体达到最大, 为 43.26, 发酵结束后收集菌体得 g/L(WCW), 用考马斯亮蓝法测得蛋白含量为 g/L,SDS?PAGE 电泳和 Bandscan 软件分析得 HrpNEcc 蛋白占细胞总蛋白的 50.2%, 为 3.29g/L 因 TB 培养基含有丰富的碳源和氮源, 用 TB 培养基代替 LB 培养基, 菌体生长速率得到很大提高, 但由于菌体生长速率很快, 且整个操作过程中又未通入纯氧, 在培养至第 3h 时溶氧即趋于零由于经实验证实, 酵母提取物因可能含有某些诱导因子, 可引起 HrpNEcc 蛋白表达, 因此, 本实验中的酵母提取物既为细胞生长提供营养物质, 又能起到引起 HrpNEcc 蛋白表达的作用 3 讨论培养基是微生物生长繁殖和目的产物积累的物质来源和能量来源, 只有合理的培养基组成和培养基总量, 才能提高微生物发酵经济效益,LB 培养基是大肠杆菌培养中通用的合理的培养基但是 LB 培养基中, 图 5 发酵过程中溶氧 ph 的变化曲线 Fig.5 Thechangeofceldensityanddisolved oxygenandph duringfermentation 有机物的含量仅有 1.5%, 单纯使用现有的 LB 培养基配方进行基因工程大肠杆菌发酵, 难以提高基因工程菌发酵的经济效益和生产规模本研究结果表明,TB 培养基不需要添加无机盐和微量元素, 就能提供足够的营养满足基因工程大肠杆菌 BL21(DE3)/pET30a (+)hrpnecc 的生长需求原因可能是 TB 培养基是一种酵母提取物含量较高的天然培养基, 含有丰富的碳氮源氨基酸肽核苷酸碳水化合物生长因子和微量元素此外, 可能 TB 培养基中的甘油作为碳源, 使得菌体生长过程中不会产生乙酸, 利于重组蛋白的积累, 而磷酸盐中的钾离子能够维持细胞渗透压, 磷酸根能保持菌体生长过程中稳定的 ph, 培养基中的酵母提取物和蛋白胨保证细胞培养过程中的质粒的高拷贝数乳糖 (lac) 操纵子是研究得最为详尽的大肠杆菌基因操纵子, 利用其调控机理为基础设计和构建的表达系统已得到了广泛的应用 IPTG 是 lac 操纵子最有效的诱导剂, 但它并不适合于大规模制备重组蛋白, 其原因在于它本身具有毒性根据 lac 操纵子的调控机理, 乳糖也可以对 lac 操纵子控制的基因产生诱导作用 [7], 并且乳糖是一种二糖, 没有毒性, 价格低廉, 其本身作为一种碳源, 可以被菌体代谢所利用本研究中选择基因工程菌生长较好的 TB 培养基进行乳糖诱导条件的优化, 实验结果表明 : 在 TB 培养基中不添加乳糖时, 该基因工程菌也可表达产生一定量的 HrpNEcc 蛋白, 产量为 mg/L, 其原因是 TB 培养基中的酵母提取物可以诱导目的基因表达 [8] ; 但添加 3g/L 乳糖时, HrpNEcc 蛋白产量大大提高, 达到 mg/L, 比不添加乳糖时提高了 36.73%, 比用 IPTG 诱导时提高了

5 48 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No %, 而成本却比用 IPTG 诱导时降低许多同时说明在 TB 培养基中加入一定量的乳糖可以增强对目的基因的诱导表达 7L 发酵罐也证实了 TB 培养基是生产 HrpNEcc 蛋白的最适培养基, 菌体达到 43.26, 菌体湿重得 57.24g/L(WCW), 细胞总蛋白含量为 6.546g/L, HrpNEcc 蛋白为 3.29g/L 在整个发酵过程中, 未使用任何特殊手段, 如纯氧加压等, 简化了发酵工艺, 降低了发酵成本在高密度发酵培养时, 由于细菌生长过快, 相对固定的培养基成分不足以维持其生长的需要, 同时由于大量代谢产物的增加, 细菌生长的内环境会发生变化, 需要不断加入缓冲液及碳源氮源以维持其 ph 值的稳定 [9,10] 在进入对数生长期后, 随着代谢产物的增多, 溶液 ph 值会下降, 此时需加入氨水以维持 ph 在 7.0 左右工程菌发酵是一个很复杂的过程, 要通过优化培养基补料方式最佳诱导时机温度等来实现工程菌的高密度发酵当用摇瓶培养时, 得菌率一般在 10g/L 以下 ; 而优化后的发酵可获得 57.24g/L 的湿菌, 虽然离实现高密度发酵还有一定的差距, 但是能在溶氧趋于零且不通入纯氧的条件下,HrpNEcc 蛋白产量仍能达到 3.29g/L, 为今后 HrpNEcc 蛋白的大规模生产奠定了基础参考文献 [1] 曹茂林, 张珏, 汤承, 等. 胡萝卜软腐欧文氏菌 CSSY002 菌株 hrpn 基因的克隆鉴定及其表达产物 Harpin 蛋白的活性分析. 应用与环境生物学报,2007,13(2):161~165 CaoM L,ZhangY,TangC,etal.ChineseJournalofApplied andenvironmentalbiology,2007,13(2):161~165 [2] 远方, 曹鸣庆, 马荣才, 等. 一株新的胡萝卜软腐欧文氏菌的分离和鉴定. 微生物学报,2004,44(2):136~140 YuanF,CaoM Q,MaRC,etal.ActaMicrobiologicaSinica, 2004,44(2):136~140 [3] 孙晓红, 王敏, 马荣才, 等.HrpNEcc 蛋白农药的中试生产条件和药效研究. 哈尔滨商业大学学报 ( 自然科学版 ),2008, 24(3):300~304 SunXH,WangM,MaRC,etal.JournalofHarbinUniversity ofcommerce(naturalsciencesedition),2008,24(3):300~ 304 [4]J. 萨姆布鲁克,D.W. 拉塞尔. 分子克隆实验指南. 黄培堂, 等译.( 第 3 版 )( 下册 ). 北京 : 科学出版社, ~ 1597 SambrookJ, RuselD W. MolecularCloningofLaboratory Manual.Beijing:SciencePres,2005:1596~1597 [5] 汪家政, 范明. 蛋白质技术手册. 北京 : 科学出版社, ~92 WangJZ,FanM.ATechnologicalManualofProtein.Beijing: SciencePres, ~92 [6] 李建武, 余瑞元, 袁明秀, 等. 生物化学实验原理和方法. 北京 : 北京大学出版社, ~176 LiJW,YuR Y,YuanM X,etal.PrincipleandMethodof Biochemistry Experiment. Beijing: Beijing University Pres, ~176 [7] 吴一凡, 张双全, 高秀玉, 等. 乳糖诱导 pet 载体表达重组蛋白的研究. 南京师大学报 ( 自然科学版 ),2002,25(1):89~ 93 WuYF,ZhangSQ,GaoXY,etal.JournalofNanjingNormal University(NaturalScience),2002,25(1):89~93 [8] 张姝, 王敏, 高俊莲, 等. 酵母提取物诱导重组大肠杆菌合成 HrpNEcc 蛋白的研究. 中国农业科学,2009( 排印中 ) ZhangS,WangM,GaoJL,etal.AgriculturalSciencesin China,2009,(inpres) [9]MakridesSC.Strategiesforachievinghigh?levelexpresionof genesinescherichiacoli.microbiologicalreview,1996,60(3): 512~538 [10]LeeSY.HighceldensitycultureofEscherichiacoli.Trends Biotechnol,1996,14(3):98~105

2009,29(10) 张姝等 : 基因重组大肠杆菌表达 HrpNEcc 蛋白的发酵条件及诱导条件优化 49 OptimizationofFermentationandInductionConditionsofRecombinant E.coliBL21(DE3)/pET30a(+)hrpNEcc ZHANGShu 1,2 WANGMin 2 HANMei?lin 2 MARong?

6 2009,29(10) 张姝等 : 基因重组大肠杆菌表达 HrpNEcc 蛋白的发酵条件及诱导条件优化 49 OptimizationofFermentationandInductionConditionsofRecombinant E.coliBL21(DE3)/pET30a(+)hrpNEcc ZHANGShu 1,2 WANGMin 2 HANMei?lin 2 MARong?cai 2 CHENQiang 1 GAOJun?lian 2 (1DepartmentofMicrobiology,ColegeofResourcesandEnvironmentScience,SichuanAgriculturalUniversity,Ya an ,China) (2Agro?BiotechnologyResearchCentre,BeijingAcademyofAgricultureandForestry,Beijing ,China) Abstract InordertoobtainhighyieldoftheHrpNEccproteinwithalowertotalcost,fermentationand lactoseinductionconditionsforrecombinante.colibl21(de3)/pet30a(+)hrpneccwereoptimizedinflasks andtherecombinante.coliwasfermentatedin7lfermenter.theoptimizedincoulumconcentrationwas5% and theoptimizednutrientmedium wastbmedium.thehrpneccproteinyieldreached417.60mg/lbyadding 3g/Lexogenousinducerlactoseinthegrowthprophaseoflog?phasefortherecombinantE.coli.TheHrpNEcc proteinyieldwashigher36.73% thanthatofthecaseofnoanyinducer,andwashigher16.85% thanthatof thecaseofaddingiptg.thewetweightofcelpeletoftherecombinante.colireached57.24g/lafter fermentationin7lfermenter,thehrpneccproteinreached3.29g/l,about50.2% oftotalcelularprotein. Keywords HrpNEccprotein RecombinantE.coli Optimizationoffermentationandinductionconditions 庆祝 XS 分析天平荣获 R&D100 大奖 5 周年梅特勒 - 托利多 XP/XS 分析天平以旧换新活动梅特勒 - 托利多 XS 分析天平自问世以来, 受到了众多专家及用户的一致好评, 并在 2004 年荣获了由美国著名科技杂志 R&D 颁发的 R&D100 大奖, 以此表彰梅特勒 - 托利多为称量技术的创新做出的卓越贡献! 为了庆祝 XS 分析天平荣获 R&D100 大奖 5 周年, 回报并感谢广大中国用户对梅特勒 - 托利多天平产品的一贯支持, 同时使来自瑞士梅特勒 - 托利多的中文触摸屏和易巧称量组件等创新称量技术不断的服务中国用户, 让中国用户更深入的了解良好的称量管理规范 (GWP ), 特推出以下 XP/XS 分析天平产品的置换补贴促销活动只要您购买 XP/XS 分析天平, 用于替代 AE/AG 分析天平, 并同意梅特勒 - 托利多公司回收替代型号天平或天平主要部件, 您就能享受额外的替换补贴, 同时免费获得良好的称量管理规范 (GWP ) 建议书一 XP 分析天平 XS 分析天平份具体详情, 请联系梅特勒 - 托利多公司活动截止时间 : 2009 年 12 月 15 日本次置换促销活动最终解释权归梅特勒 - 托利多仪器 ( 上海 ) 有限公司天平部所有梅特勒 - 托利多客户互动中心 : 梅特勒 - 托利多官方网站 :htp:// 或 htp://

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