24 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No PAC300/MiniProtean 电泳仪 QuantityOne 凝胶分析软件 (Bio Rad 公司 );Waters600HPLC 装配 TSK Gel G2000SWXL 层析柱 (Waters

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烟施
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2009,29(11):23~28 PEG 重组酵母尿酸酶结合物的基本特性研究 1 赵兴秀 1 何义国 2 姚兴川 2 杜林方 2 孟延发 (1 四川理工学院自贡四川大学生命科学学院成都 ) 摘要重组 Candidautilis 尿酸酶由含 PET Uricase 表达质粒的重组 E.coliJM109(DE3) 经乳糖诱导表达, 菌体破碎后依次经过硫酸铵沉淀阴离子交换层析和凝胶过滤层析可以获得纯度 95% 的重组尿酸酶还原性 SDS PAGE 和 HPLC 测得其亚基表观分子量和天然分子量分别约为 33kDa 和 130kDa 获得的纯酶与 20kDa(mPEG) 2 Lys NHS 在特定的条件下反应合成 PEG 重组酵母尿酸酶结合物, 考察了重组酵母尿酸酶 PEG 化前后的基本性质, 结果显示 PEG 化尿酸酶的最适 ph 为 7.5, 较修饰前下降了 1 个 ph 单位, 酸碱稳定范围与修饰前类似, 都在 ph6~10 范围内稳定 ; 修饰前后最适温度均为 40, 重组酵母尿酸酶的热稳定性和抗蛋白酶水解能力较 PEG 修饰前有较大提高 ;PEG 化尿酸酶可保留修饰前酶活力的 87.5%; 在最适条件下,PEG 尿酸酶结合物的 Km 为 mol/l, 而修饰前测得的 Km 为 mol/l 研究结果为深入探讨 PEG 化尿酸酶的结构与功能奠定了基础关键词 Candidautilis 尿酸酶 PEG 化尿酸酶蛋白质化学修饰中图分类号 Q544 尿酸是鸟类爬行类和包括人在内的灵长类动物体内嘌呤代谢的终产物, 因为在这些动物体内缺乏以分子氧为受体催化尿酸进一步分解为尿囊素 CO 2 和 H 2 O 2 的尿酸酶富嘌呤食物摄入过多白血病和淋巴瘤及其化疗过程所引起的嘌呤代谢增加均可使人体内尿酸水平异常升高而形成高尿酸血症, 而尿酸及其盐类在血液中的低溶解度和易沉积性, 又使得高尿酸血症成为痛风等系列疾病和肿瘤治疗中出现急性肾衰竭的直接原因 [1,2] 目前治疗高尿酸血症等疾病的常规疗法是采用别嘌呤醇治疗, 但别嘌呤醇并非理想的药物 [3,4] 尿酸酶则能够成为未来治疗高尿酸血症等疾病的理想药物, 尤其对于那些禁忌常规疗法和采用常规疗法无效的病人来说可能是唯一特效药然而对于人体来说尿酸酶是一种异源蛋白, 直接使用不仅体内半衰期短且易引起机体免疫反应, 从而使疗效大大降低甚至无法发挥利用聚乙二醇 (PEG) 修饰剂对尿酸酶进行修饰是解决上述问题的有效途径之一国外, 对于 PEG 尿酸酶结合物作为药物开发进度较快, 由美国杜克大学研制的收稿日期 : 修回日期 : 四川省教育厅资助项目 (08ZB043) 电子信箱 :zhaoxingxiu@sohu.com PEG 重组猪尿酸酶结合物二期临床试验取得可喜结果, 现已进入三期临床试验阶段而在国内, 关于 PEG 化尿酸酶药物开发的研究报道却罕见 [5], 面对我国受高尿酸血症及其继发症侵害的人群日益增大的事实, 加快我国同类药物的研发尤为迫切本文报道 (mpeg) 2 Lys NHS(M.W.20kDa) 修饰重组 Candida utilis 尿酸酶的初步研究结果, 而进一步的深入研究将另文报道 1 材料与方法 1.1 材料试剂 (mpeg) 2 Lys NHS(M.W.20kDa) (Shearwater 公司 ); 尿酸胰蛋白酶 (Sigma 公司 ); DEAE SepharoseF.F HiPrep16/60SephacrylS 200HR (Pharmacia 公司 ); 胰化蛋白胨和酵母粉 (OXOID 公司 ); 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺 (Fluka 公司 ); 四甲基乙二胺 (Bio Rad 公司 ); 硫酸卡那霉素 (Merck 公司 ); 其余试剂为国产分析纯和色谱纯主要仪器 HZQ C 型空气浴振荡器 ( 哈尔滨东明医疗仪器厂 );5804R 高速冷冻离心机 (Eppendorf 公司 );UV 2102PC 紫外可见分光光度计 (Unico 公司 ); VCX 750 超声波细胞粉碎机 (Sonics 公司 );Power

2 24 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No PAC300/MiniProtean 电泳仪 QuantityOne 凝胶分析软件 (Bio Rad 公司 );Waters600HPLC 装配 TSK Gel G2000SWXL 层析柱 (Waters 公司 ) 培养基 LB 培养基 (g/l): 胰化蛋白胨 10, 酵母粉 5,NaCl10; 发酵培养基 (g/l): 胰化蛋白胨 10, 酵母粉 5,NaCl10,KH 2 PO 4 2,K 2 HPO 4 13,MgSO 4 7H 2 O 0.2, 甘油 5; 种子培养基和发酵培养基均含 50μg/ml 的硫酸卡那霉素 1.2 方法菌种培养及诱导表达从划线平板上挑取含 PET Uricase 表达质粒的重组 E.coliJM109(DE3) 单菌落接入 LB 培养基,37 200r/min 振荡培养 12h,5% 接种于 500ml 锥形瓶 ( 每瓶含 100ml 发酵培养基 ) 中,37 200r/min 培养 7h 后加入乳糖至终浓度为 5g/L, 诱导 9~10h 后将发酵液 6000r/min 离心 10min 收集菌体重组尿酸酶的分离纯化及纯度鉴定生理盐水洗涤菌体后用适量硼砂硼酸缓冲液 (ph mol/l) 悬浮,4 下超声破碎, 破碎液经 15000g/min 离心 10min 收集上清 ; 上清进行 0% ~30%,30% ~60% 硫酸铵分级沉淀 ;30% ~60% 部分沉淀用硼砂硼酸缓冲液 (ph mol/L) 溶解并透析 ; 透析液经 15000g/min 离心 10min 除去变性蛋白后适量上样于 DEAE SepharoseF.F 柱 (1.6cm 10cm), 用 0~0.2 mol/lnacl,ph mol/L 硼砂硼酸缓冲液进行线性梯度洗脱, 分步收集, 检测合并酶活性峰部分 ; 离子交换所得组分继续上样于 HiPrep16/60SephacrylS 200HR(1.6cm 60cm), 硼砂硼酸缓冲液 (ph mol/L) 洗脱, 检测收集酶活性峰部分 ; 凝胶过滤得到的样品用 Waters600HPLC 检测纯度, 层析柱 TSK GelG2000SWXL(7.8mm 30cm), 流动相为 0.2mol/ LNa 2 SO 4,pH mol/LTris HCl, 流速为 0.8ml/ min, 检测波长 220nm 重组尿酸酶的结构组成分析在 Tris 甘氨酸缓冲液 (ph8.3) 中进行电泳, 浓缩胶浓度 4%, 分离胶浓度 10%, 电压 140V, 上样 10μg 蛋白质样品, 在还原条件下进行电泳, 用考马斯亮蓝 R 250 染色, 脱色照相后用 QuantityOne 软件分析计算重组尿酸酶亚基表观分子量 ; 在 Waters600HPLC 上以甲状腺球蛋白 ( Da) BSA(67000Da) RNase(13750Da) 和对氨基苯甲酸 (137Da) 为标准参照蛋白, 以相对保留体积 (Ve/ Vo) 对分子量对数作图, 求出尿酸酶相对分子量, 层析条件同纯度检测 PEG 尿酸酶结合物的合成用硼砂硼酸缓冲液 (ph mol/L) 调节纯品尿酸酶溶液蛋白质浓度至 4mg/ml, 将固体 (mpeg) 2 Lys NHS 以 10 1 (PEG 尿酸酶,w/w) 的量加入, 反应混合液置于 4 轻微振荡 30min 后直接上样于 HiPrep16/60SephacrylS 200HR(1.6cm 60cm), 硼砂硼酸缓冲液 (ph mol/L) 洗脱, 部分收集 ; 含有 PEG 化尿酸酶的洗脱峰用 HPLC 检测纯度, 层析条件同测 PEG 尿酸酶结合物的蛋白质含量, 再取相同浓度的未修饰酶, 在各自最适条件下测定酶活, 计算修饰后活性保留最适作用 ph 和酸碱稳定性的测定取不同 ph 缓冲液配制的尿酸溶液 ( 含 0.001% 尿酸 ) 在 25 下保温 5min, 加入用水适当稀释的尿酸酶或 PEG 尿酸酶结合物, 准确反应 5min 后加入 20%KOH 终止, 于 290nm 处测定光吸收值的减少, 得酶活力随 ph 变化的曲线用 0.2mol/L 的不同 ph 缓冲液分别将尿酸酶和 PEG 尿酸酶结合物稀释适当倍数 ( 以酶溶液本身 ph 不改变缓冲液 ph 为准 ), 于 4 放置 24h 后用各自最适 ph 缓冲液稀释到活性测定所需倍数, 在各自最适条件下测定剩余酶活力最适作用温度和热稳定性的测定在各自最适 ph 条件下, 将适当稀释的尿酸酶 PEG 尿酸酶结合物在不同温度下保温 5min 后分别加入不同温度下水浴的尿酸底物液 ( 含 0.001% 尿酸 ), 准确反应 5min 后加入 20%KOH 终止, 于 290nm 处测定光吸收值的减少, 绘制酶活随温度变化曲线在不同温度下将尿酸酶保温 40min,PEG 尿酸酶结合物保温 1h 后迅速冷却至室温, 稀释后在各自最适条件下测定剩余酶活力米氏常数 (Km) 的测定分别在尿酸酶和 PEG 尿酸酶结合物的最适条件下, 取浓度分别为 24μmol/L 30μmol/L 36μmol/L 42μmol/L 48μmol/L 54μmol/L 60μmol/L 的尿酸溶液, 按照酶活力测定方法, 测定不同尿酸浓度下 OD 290 的变化, 计算出反应速度 V, 根据 Lineweaver Burk 双倒数作图法计算二者的 Km 抗胰蛋白酶水解能力测定将尿酸酶和 PEG 尿酸酶结合物溶液调整到相同适当蛋白质浓度后, 分别加入等体积 0.05mg/ml 胰蛋白酶, 充分混合后 37 保温反应, 在反应过程中的不同时间点取样在最适条件下, 测定二者的残留活性以反应时间为横坐标, 尿酸酶和 PEG 尿酸酶结合物相对残留活性为纵坐标作图, 比较修饰前后尿酸酶抗胰蛋白酶水解能力的变化酶活性及蛋白含量测定方法最适条件下,1

2009,29(11) 赵兴秀等 :PEG 重组酵母尿酸酶结合物的基本特性研究 25 min 内催化 1μmol 尿酸分解所需酶量定义为一个酶活力单位, 测定方法参考 Toyoboenzymes [6] 并适当修改尿酸酶修饰前蛋白含量测定采用 Bradford 法 [7],BSA 为标准蛋白 ; 修饰后采用近紫外吸收法 [7] 2 结果与分析 2.

3 2009,29(11) 赵兴秀等 :PEG 重组酵母尿酸酶结合物的基本特性研究 25 min 内催化 1μmol 尿酸分解所需酶量定义为一个酶活力单位, 测定方法参考 Toyoboenzymes [6] 并适当修改尿酸酶修饰前蛋白含量测定采用 Bradford 法 [7],BSA 为标准蛋白 ; 修饰后采用近紫外吸收法 [7] 2 结果与分析 2.1 重组尿酸酶的分离纯化及纯度鉴定菌体经超声或高压匀浆破碎后, 进行 30% ~60% 硫酸铵分级沉淀, 透析或超滤脱盐后经阴离子交换和凝胶过滤层析两步可以得到高纯度的样品 ( 图 1), 还原性 SDS PAGE 显示为单一条带, 非还原 SDS PAGE 显示为两条极为靠近的条带 ( 图 2), 其原因可能是因为酶分子亚基上存在链内二硫键, 非还原条件下并非所有二硫键都打开, 使亚基构像与还原条件下有区别, 从而导致在凝胶中的泳动率有差异 HPLC 检测样品纯度达到 95%( 图 3), 可用于 PEG 修饰图 2 尿酸酶纯品的还原 / 非还原 SDS PAGE Fig.2 Reduced/Non reducedsds PAGE ofpurifieduricase 1:Non reduced;2:standardproteins;3:reduced 图 3 尿酸酶的在 HPLC 上的层析图 Fig.3 Chromatogram ofuricaseonhplc 图 1 尿酸酶纯化各步还原性 SDS PAGE Fig.1 ReducedSDS PAGEanalysisofuricase purifiedfrom varioussteps 1:Standardproteins;2:Samplefromsaltingout;3:Samplefrom anion exchange;4:samplefromsievechromatography 2.2 重组尿酸酶结构组成还原性条件下, 纯酶经 SDS PAGE 显示单一着色带, 由图 2 和图 4 可计算出重组尿酸酶表观分子量为 33kDa; 在 HPLC 上通过 TSK GelG2000SWXL 凝胶过滤层析测得重组尿酸酶 Ve/Vo 约为 1.11, 计算相对分子量约为 130kDa( 图 5), 由此推测重组尿酸酶活性形式是由 4 个相同分子量亚基所组成的四聚体 2.3 PEG 重组尿酸酶结合物的纯化修饰反应混合液经 HiPrep16/60SephacrylS 200 HR 层析, 以先后顺序出现两个洗脱峰, 前峰为 PEG 尿图 4 SDS PAGE 测定尿酸酶亚基分子量 Fig.4 Determinationofmolecularweightof subunitofuricasebysds PAGE 酸酶结合物, 后峰为 N 羟基琥珀酰亚胺, 没有出现未修饰尿酸酶洗脱峰. 将 PEG 尿酸酶结合物进行还原性梯度 SDS PAGE, 电泳结果与文献 [5] 类似 ( 图 6), 出现了未修饰亚基和修饰亚基, 修饰亚基的分子量分布在 50 ~200kDa 及以上, 以 100kDa 居多 ; 进行 PAGE(5% 分离胶,4% 浓缩胶,15μg 蛋白上样量 ) 发现样品弥散在

26 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No.112009 图 5 HPLC 测定尿酸酶分子量 Fig.

4 26 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No 图 5 HPLC 测定尿酸酶分子量 Fig.5 Standardcurvefordeterminationof uricasemolecularweightonhplc 浓缩胶和分离胶交界处, 泳道下方没有任何条带出现 ; 进一步将样品用 HPLC 检测, 显示为单一峰 ( 图 7) 由此推测在这样修饰条件下, 几乎所有酶分子都与 PEG 结合, 但并不是每个天然状态尿酸酶分子的 4 个亚基都结合了 PEG, 结合物的分子量至少分布在 150kDa 以上 ; 经测定, 修饰后酶活约保留了修饰前的 87.5% 在 ph7~9 的碱性环境中具有较好反应活力, 在 ph6 ~10 的环境中稳定良好 ; 最适温度是 40, 在 30 ~ 45 的作用温度下, 能够发挥 60% 以上的反应活力, 在 60 以下具有良好的热稳定性,60 下处理 40min 仍保持了 70% 以上活力 ; 最适反应条件下, 重组尿酸酶 Km= mol/l PEG 化尿酸酶的最适 ph 则是 7.5, 在 ph6~9 的环境中具有较好反应活力, 能在人生理 ph 环境中发挥 95% 以上的活力, 在 ph6~10 环境中的具有很好的稳定性 ; 最适温度仍为 40, 但是钟罩幅度变宽, 在 25 ~55 的作用温度下, 能够发挥 60% 以上反应活力, 同样在 60 以下具有良好的热稳定性, 并且在热处理时间延长 20min 的情况下, 所有测定温度下热稳定性仍比未修饰酶高, 表明 PEG 修饰确实较好增强了酶的热稳定性 ; 最适条件下,PEG 化尿酸酶 Km= mol/l 图 6 PEG 化尿酸酶的梯度 SDS PAGE(7.5% ~15%) Fig.6 GradiantSDS PAGEofpegylated uricase(7.5% ~15%) 1:Standardproteins;2:Pegylateduricaseeluted fromsievechromatography 图 8 尿酸酶和 PEG 化尿酸酶的最适 ph 比较 Fig.8 Comparisonofoptimum ph ofuricase andpegylateduricase 图 7 PEG 化尿酸酶在 HPLC 上的层析图 Fig.7 Chromatogram ofpegylateduricaseonhplc 图 9 尿酸酶和 PEG 化尿酸酶的 ph 稳定性比较 Fig.9 ComparisonofpH stabilityofuricase andpegylateduricase 2.4 PEG 修饰前后重组尿酸酶的酶学性质比较图 8~ 图 13 显示 : 重组尿酸酶的最适 ph 是 8.5,

5 2009,29(11) 赵兴秀等 :PEG 重组酵母尿酸酶结合物的基本特性研究 27 图 10 尿酸酶和 PEG 化尿酸酶的最适温度比较 Fig.10 Comparisonofoptimum temperature ofuricaseandpegylateduricase 图 13 PEG 化尿酸酶的米氏常数测定曲线 Fig.13 Lineweaver Burkplotofpegylateduricase 图 11 尿酸酶和 PEG 化尿酸酶的热稳定性比较 Fig.11 Comparisonofthermalstabilityof uricaseandpegylateduricase 图 12 尿酸酶的米氏常数测定曲线 Fig.12 Lineweaver Burkplotofuricase 2.5 PEG 修饰前后重组尿酸酶抗胰蛋白酶水解能力比较 PEG 化尿酸酶抗胰蛋白酶水解能力明显高于未修饰的酶 ( 图 14), 在胰蛋白酶作用 150min 后,PEG 化尿酸酶仍保留原有活性的 35%, 而未修饰的酶只剩下不到 10% 的活性图 14 尿酸酶修饰前后抗胰蛋白酶水解能力 Fig.14 Abilityofantitrypsinhydrolysisofuricase beforeandafterpegylation 3 讨论聚乙二醇是一种具有较好生物相容性的高分子化合物, 本身无免疫原性和蛋白酶识别位点, 对人体无毒性, 用 PEG 活性酯修饰蛋白质药物可能掩盖其某些抗原决定位点和蛋白酶作用位点从而降低蛋白质免疫原性并保护其不被降解, 而修饰后蛋白质分子量的增加有助于减小肾小球滤过率, 增加药物在体内循环的半衰期因此尿酸酶作为药物直接用于人体时会产生的问题正好可以通过聚乙二醇 (PEG) 修饰技术来加以解决或缓解以重组 Candidautilis 尿酸酶作为 PEG 化尿酸酶开发的酶源, 因为研究认为该酶对尿酸的亲和力较高且在人体血浆中能够保持较高比活性, 所以是一种理想的药用酶源 [8~10] 在进行修饰前, 首先测定了重组酶的相对分子质量和亚基组成, 这对于选择多大分子量的修饰剂来说是很有必要的, 因为该酶表观分子质量达到 130kDa, 由 4 个相似亚基构成, 可供修饰位点较多, 如果选用小分子量修饰剂如 M.W 5kDa, 修饰后可能对抗原位点掩盖不充分 ; 而选用大分子量的如 M.W

6 28 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No kDa, 则可能加重肾脏清除负担鉴于此, 首先选择 M.W 20kDa 的 PEG 修饰剂进行研究在 4 ph8.5 的反应体系中, 尿酸酶浓度为 4mg/ml,(mPEG) 2 Lys NHS 和尿酸酶质量比为 10 1, 反应 30min 时, 几乎所有尿酸酶都和 PEG 结合, 经检测活性约保留了修饰前的 87.5%, 比 M.W 40kDaPEG 尿酸酶结合物要高 [5] ; 分别测定修饰前后的酶学性质, 对比发现 PEG 化尿酸酶的热稳定性和抗胰酶水解能力比天然酶有明显提高, 但抗胰酶水解能力不及 M.W 40kDaPEG 尿酸酶结合物 [5] ; 最适作用 ph 为 7.5, 比之修饰前向中性偏移, 这意味着修饰酶在人体血浆中能够更大程度发挥自身活力 ; 最适作用温度在修饰前后均为 40, 但修饰后能够发挥有效酶活 ( 大于 60%) 的温度范围变宽 ; 修饰前后的 ph 稳定范围均为 ph6~9 M.W 20kDaPEG 尿酸酶结合物还会在药代动力学免疫学性质和体内降血尿酸效果等方面有别于天然酶以及 M.W 40kDaPEG 尿酸酶结合物, 目前正在进一步探索中参考文献 [1]OdaM,SataY,TakenakaO,etal.Losofurateoxidaseactivity inhominoidsanditsevolutionaryimplications.molbiolevol, 2002,19(5):640~653 [2]BaeksgaardL,SorensenJB.Acutetumorlysissyndromeinsolid tumors a case reportand review ofthe literature. Cancer ChemotherPharmacol,2003,51(3):187~192 [3]BardinT.Curentmanagementofgoutinpatientsunresponsiveor alergictoalopurinol.jointbonespine,2004,71(6):481~ 485 [4]NukiG.Treatmentofcrystalarthropathy historyandadvances. RheumDisClinNorthAm,2006,32(2):333~357 [5] 才蕾, 高向东, 朱姝, 等. 聚乙二醇修饰尿酸酶的研究. 中国药科大学学报,2008,39(6):557~562 CaiL,GaoXD,ZhuS,etal.JournalofChinaPharmaceutical University,2008,39(6):557~562 [6]Toyoboco.lid.Toyoboenzymes.Japan:Biochemicaloperations department, [7] 汪家政, 范明. 蛋白质技术手册. 北京 : 科学出版社, ~50 WangJZ,FanM.ProteinTechnicalManual.Beijing:Science Pres, ~50 [8] BomalaskiJS,HoltsbergFW,EnsorC M,etal.Uricase formulated with polyethylene glycol (uricase PEG 20): biochemicalrationale and preclinicalstudies. J Rheumatol, 2002,29(9):1942~1949 [9] LiaoF,ZhuX Y,WangY M,etal.Thecomparisonofthe estimationofenzymekineticparametersbyfitingreactioncurveto theintegratedmichaelis Mentenrateequationsofdiferentpredictor variables.jbiochembiophysmethods,2005,62(1):13~24 [10]DavisS,ParkYK,AbuchowskiA,etal.Hypouricaemicefect ofpolyethyleneglycolmodifiedurateoxidase.lancet,1981,2 (8241):281~283 StudyonGeneralPropertiesofPEGylatedRecombinantUricase ZHAOXing xiu 1 HEYi guo 1 YAOXing chuan 2 DULin fang 2 MENGYan fa 2 (1SichuanUniversityofScience&Engineering,Zigong ,China) (2ColegeofLifeScience,SichuanUniversity,Chengdu ,China) Abstract Inducedbylactose,therecombinantCandidautilisuricasewasexpresedintheE.coliJM109 (DE3)thatcariedthePET uricaseexpresionplasmid.thecrudeextractionwasprocesedbythefolowing purificationproceduresincludingammonium sulfateprecipitation, anion exchangechromatographyand gel filtrationchromatographyandtherecombinanturicasewith95% puritycouldbeobtained.usinghplc and reducedsds PAGE,thenativemolecularweightofthisenzymeandtheapparentmolecularweightofitssubunit weredeterminiedas130kdaand33kda.the(mpeg) 2 Lys NHSof20kDawasusedtomodifythepurified uricaseandthestudyonzymologicalpropertiesofuricasebeforeandaftermodificationwascariedon.the resultsshowedthattheoptimum ph ofpeg modifieduricaseandnativeuricasewereph 7.5andpH 8.5 respectivelyandbothofthem hadgoodph stabilityfrom ph6to10;bothofthetwohadthesameoptimum temperatureof40,butthethermalstabilityandtheabilityofantitrypsinhydrolysisofthepegylatedenzyme weremuchbeterthanthoseofnativeenzyme;themodifieduricaseretained87.5% oftheenzymaticactivityof nativeuricase;undereachoptimum condition,thedeterminedkm ofuricasebeforeandafterpegylationwere mol/land mol/lrespectively.thesefindingsmayprovidesomeinformationfordeep investigationofstructureandfunctionofpegylateduricase. Keywords Candidautilis Uricase Pegylateduricase Chemicalmodificationofprotein

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌