50 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 方法种子培养将 -70 冷冻保藏的种子活化后接入种子培养基中, 在 r/min 下摇床培养 24h 摇瓶发酵培养将种子按照 10%(v/v) 的接种量接种至发酵培

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雍郎
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2013,33(8):49 54 柠檬酸钠促进 S 腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联合高产王玉磊朱健卫功元许宏庆汪成富 ( 苏州大学医学部基础医学与生物科学学院苏州 ) 摘要考察了柠檬酸钠对 S 腺苷蛋氨酸 (SAM) 和谷胱甘肽 (GSH) 联产发酵的影响, 发现柠檬酸钠有利于 SAM 和 GSH 的联合高产采用响应面分析法对柠檬酸钠浓度及其添加时间进行优化, 模型预测和验证实验结果均表明在联产发酵 6h 时一次性添加 10g/L 柠檬酸钠的效果最佳通过对 SAM 和 GSH 联产发酵过程进行分析, 发现柠檬酸钠能够显著提高胞内 NADH 和 ATP 的水平, 为 SAM 和 GSH 的过量合成提供了足够的能量物质, 也为类似耗能化合物的生物合成及其发酵高产提供了可行的优化策略关键词 S 腺苷蛋氨酸谷胱甘肽 ATP 联产发酵柠檬酸钠中图分类号 TQ464.7 Q S 腺苷蛋氨酸 (SAM) 和谷胱甘肽 (GSH) 是生物体内两种重要的含硫生物活性小分子化合物 SAM 在临床上常用于肝病关节炎和抑郁症的治疗 [1],GSH 在临床医学运动保健食品加工等诸多领域也都有着广泛的应用前景 [2] 酵母发酵法被认为是 SAM 和 GSH 生物合成的最有潜力的方法 [2 4] 由于 SAM 和 GSH 在酵母细胞中均为 L 蛋氨酸代谢途径中的关键节点物质 [5], 因此可以通过合适的菌种选育方法获得 SAM 和 GSH 联产的酵母菌株 [6] SAM 和 GSH 的生物合成都需要 ATP 的参与, 胞内 ATP 的水平决定着底物的转化效率以及 SAM 和 GSH 能否高效合成 [7] 相关研究也表明, 适时向发酵液中添加适当浓度的外源 ATP 可以有效地促进 GSH 产量的提高 [8], 但 ATP 价格昂贵, 外源添加 ATP 显然会大幅提高生产成本因此, 若能寻找到一种可替代 ATP 的廉价物质, 则对于 SAM 和 GSH 的过量合成, 乃至 SAM 和 GSH 的产业化生产无疑都具有重要意义近年来, 研究发现酵母细胞可以利用外源添加的辅助性能源物质, 如柠檬酸盐甲酸盐等, 有效地提高胞内 NADH 的含量 [9] 在氧供应充分的条件下, 这些 NADH 可以通过呼吸链直接氧化为 ATP, 从而为耗能代收稿日期 : 修回日期 : 国家自然科学基金 ( ) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :weigy@suda.edu.cn 谢物质的生物合成提供充足的 ATP [10] 柠檬酸钠是一种廉价的化学物质, 经好氧微生物代谢后可以提高胞内 ATP 的含量, 进而增强细胞抵抗酸胁迫环境的能力 [11 12] 基于此, 本文考察柠檬酸钠添加对产朊假丝酵母发酵联产 SAM 和 GSH 的影响, 同时采用数学统计方法探寻合适的添加方式, 从能量代谢和动力学等角度对发酵结果进行分析, 并对柠檬酸钠促进 SAM 和 GSH 过量合成的机理进行解释 1 材料与方法 1.1 材料菌株产朊假丝酵母 (CandidautilisCCTCCM ) 培养基种子培养基 (g/l): 葡萄糖 20, 蛋白胨 10, 酵母膏 10,pH6.0 发酵培养基 (g/l): 葡萄糖 35, 硫酸铵 10, 磷酸二氢钾 12.3,L 蛋氨酸 4.6, 硫酸镁 0.05, 氯化钙 0.05,pH 5.5 柠檬酸钠添加时间和浓度根据实验要求确定试剂及仪器 NADH ATP 谷胱甘肽还原酶 DTNB NADPH SAM GSH 和柠檬酸钠等试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司高效液相色谱 (HPLC) 采用 Waters1525 色谱仪, 色谱柱为反相 SunFireTMC18(5μm, mm) 5L 搅拌式发酵罐 (BIOTECH 2002, 上海保兴生物设备工程有限公司 )

2 50 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 方法种子培养将 -70 冷冻保藏的种子活化后接入种子培养基中, 在 r/min 下摇床培养 24h 摇瓶发酵培养将种子按照 10%(v/v) 的接种量接种至发酵培养基中 (50ml/500ml),30 200r/min 下发酵培养 30h 分批发酵培养将 300ml 种子接种至装有 3L 发酵培养基的发酵罐中, 搅拌转速 350r/min, 通气量 3.0L/min, 温度 30,pH 通过自动流加 3mol/LH 2 SO 4 或 3mol/LNaOH 稳定控制在 5.5±0.02 范围内分析方法 (1) 酵母生物量的测定 : 以细胞干重 (DCW) 表示取 25ml 发酵液于 3500r/min 下离心 10 min, 蒸馏水洗涤 3 次, 离心, 收集菌体,70 烘干至恒重 (2) 胞内 SAM GSH 的提取和测定 : 见参考文献 [6] (3) 葡萄糖浓度的测定 :3,5 二硝基水杨酸 (DNS) 法 [13] (4) 胞内辅因子的测定 :NADH NAD + ATP ADP 的定量检测采用 HPLC 法 [7] (5) 细胞比生长速率 (μ) 及产物比合成速率 (q P ) 的计算 : 见参考文献 [7] 1.3 实验设计与数据处理响应面分析试验采用 2 因素多水平组合, 通过 DesignExpert7.1.6 软件对试验数据进行分析, 预测最优工艺参数数据处理所有摇瓶实验数据均为 3 组独立实验样品的平均值, 所有分批发酵实验数据均为 2 次检测结果的平均值 2 结果与讨论 2.1 柠檬酸钠对 SAM 和 GSH 联产发酵影响结合参考文献 [6] 研究结果, 在产朊假丝酵母的不同摇瓶培养阶段 ( h), 向培养液中添加不同浓度的柠檬酸钠 ( 图 1), 结果发现柠檬酸钠的适时添加对细胞生长和产物合成均有利低浓度的柠檬酸钠特别有利于 GSH 的合成, 而高浓度的柠檬酸钠有利于胞内 SAM 的积累添加柠檬酸钠后,SAM 和 GSH 的联产量最大值为 541.9mg/L, 比对照提高了 23.4% 图 1 结果还表明, 在发酵后期 (22h) 添加柠檬酸钠对 SAM 和 GSH 联产发酵没有显著影响 2.2 柠檬酸钠添加条件的优化数学模型的提出为了获得较优的柠檬酸钠图 1 柠檬酸钠添加对 SAM 和 GSH 联产的影响 Fig.1 Efectofsodium citrateadditiononthe co productionofsam andgsh 添加条件, 采用二次多项式对摇瓶实验数据进行回归分析, 得到 SAM 和 GSH 联产量 (Y) 与柠檬酸钠添加时间 (X 1 ) 添加浓度 (X 2 ) 之间关系的回归方程 : Y= X X X 1 X X X 2 2 (1) 对方程 (1) 进行方差分析, 结果表明该模型显著 ( 表 1) 回归模型的相关系数 R 2 =0.934, 说明该方程能够很好地拟合 SAM 和 GSH 联产量的变化情况根据回归方程作出的响应面曲面及相应的等高线如图 2 对方程(1) 进行分析, 该模型预测柠檬酸钠添加的最佳点为 : 时间 6.03h 浓度 9.98g/L, 该条件下 SAM 和 GSH 联产量的估计值为 558.3mg/L 模型的验证为验证模型的准确性和有效性, 采用预测的最佳柠檬酸钠添加条件进行摇瓶培养, 平行实验重复 3 次考虑到可操作性, 选择 6h 添加 10 g/l 柠檬酸钠进行实验, 结果见表 2 在此条件下,SAM 和 GSH 的联产量为 556.9mg/L, 该结果与模型预测值很接近, 说明响应面优化的结果是可靠的 2.3 柠檬酸钠促进产朊假丝酵母分批发酵联产 SAM 和 GSH 分批发酵过程分析有文献报道, 柠檬酸钠具有碱化作用, 在被微生物利用后可以引起发酵液 ph 的提高, 从而有利于细胞生长和产物合成 [12] 那么, 在摇瓶中所得到的 SAM 和 GSH 联产量提高的结果是否因为碱化效应而引起的? 为此, 根据上文实验结果, 在分批培养 ( 恒定 ph) 的 6h 添加 10g/L 柠檬酸钠,SAM 和 GSH 联产发酵过程如图 3

3 2013,33(8) 王玉磊等 : 柠檬酸钠促进 S 腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联合高产 51 表 1 回归模型方差分析 Table1 Analysisofvariancewithregresionmodel Source Sumofsquares Df Meansquare FValue Prob>F Significantlevel Model X X X 1 X X X Residual CorTotal Note:R 2 =0.934,AdjR 2 =0.812 图 2 柠檬酸钠添加条件与 SAM 和 GSH 联产量关系的曲面图 Fig.2 Surfacechartoftherelationshipbetweensodium citrateconcentration, additiontimeandtheco productionofsam andgsh Experimentcondition 表 2 试验结果的验证 Table2 Resultofdemonstrationtests Sodiumcitrate (g/l) Additiontime (h) SAM+GSH (mg/l) Singleexperiment ±9.5 Predictedbymodel Verificationtest ±8.8 图 3 SAM 和 GSH 联产的分批发酵过程 Fig.3 Time coursesofbatchprocesfortheco productionsam andgsh with(closedsymbols) orwithout(opensymbols)theadditionofsodium citrate

52 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No.82013 由图 3 可见, 柠檬酸钠的添加基本没有影响葡萄糖的消耗速率, 也没有提高细胞干重, 说明柠檬酸钠在发酵过程中不是作为碳源而被利用然而, 柠檬酸钠的添加对 SAM GSH 以及二者的联产量均表现出了促进作用,SAM GSH 以及二者的联产总量分别比对照提高了 17.9% 5.0% 和 13.

4 52 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 由图 3 可见, 柠檬酸钠的添加基本没有影响葡萄糖的消耗速率, 也没有提高细胞干重, 说明柠檬酸钠在发酵过程中不是作为碳源而被利用然而, 柠檬酸钠的添加对 SAM GSH 以及二者的联产量均表现出了促进作用,SAM GSH 以及二者的联产总量分别比对照提高了 17.9% 5.0% 和 13.0% 对比摇瓶和发酵罐中的联产发酵结果, 发现在恒定 ph 下柠檬酸钠引起 SAM 和 GSH 联产量增加的幅度要比不控制 ph 时的低, 说明在摇瓶培养中 SAM 和 GSH 联产量的提高部分是因为柠檬酸钠的碱化效应那么, 在发酵罐中柠檬酸钠促进 SAM 和 GSH 生物合成是基于怎样的机理? 以下将从发酵动力学和能量代谢的角度进行探讨发酵动力学分析对 SAM 和 GSH 联产发酵过程进行动力学分析, 结果如表 3 在 6h 时添加 10g/L 柠檬酸钠, 酵母细胞合成 SAM 的能力有所提高, 因而 SAM 合成量一直高于对照组 ( 图 3);GSH 的合成能力虽然在 24h 前不如对照组, 但 24h 后 GSH 仍然继续过表 3 SAM 和 GSH 联产发酵动力学参数比较量合成因此, 柠檬酸钠的添加最终带来比对照组更多的 SAM 和 GSH 联产增加量能量代谢过程分析 SAM 和 GSH 的生物合成均为耗能代谢过程, 需要大量 ATP 的参与 [14 15] 因此, 酵母胞内与能量代谢有关的辅因子物质的含量就将成为 SAM 和 GSH 过量合成的关键影响因素取分批发酵对数生长期 (12h) 和产物合成期 (21h) 细胞, 分别测定胞内 ATP ADP NADH 和 NAD + 的含量, 结果如图 4 可以看出, 虽然在对数生长期柠檬酸钠的添加没有提高胞内 NADH 的含量和 NADH/NAD + 比率, 但胞内 ATP 含量和 ATP/ADP 比率均明显高于对照, 说明胞内 ATP 足以满足 SAM 和 GSH 生物合成的需要需要指出的是, 柠檬酸钠在联产发酵后期显著提高了胞内 NADH 的水平, 进而提高了胞内 ATP 的水平,NADH 和 ATP 含量分别比对照提高了 122.2% 和 20.3% 胞内充足的 NADH 和 ATP 供给可以很好地满足发酵后期产物过量合成对能量的需求, 进而促进了 SAM 和 GSH 联产量的提高 Table3 Comparisonofkineticparameterswithinthebatchco productionofsam andgsh Kineticparameters Citrateaddition Control Averageμafter6h(h 1 ) Averageq P SAM from6hto24h(mg/gh 1 ) Averageq P GSH from6hto24h(mg/gh 1 ) Averageq P SAM after24h(mg/gh 1 ) Averageq P GSH after24h(mg/gh 1 ) IncreasedSAM andgshco productionafter6h(mg/l) 图 4 胞内辅因子含量及其比率 Fig.4 TheintracelularcontentsofNADH andatpandtheratiosofnadh/nad + and ATP/ADPwithorwithoutsodium citrateaddition

5 2013,33(8) 王玉磊等 : 柠檬酸钠促进 S 腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联合高产 53 3 结论在 SAM 和 GSH 联产发酵过程中, 能量代谢与物质代谢一样都具有十分重要的作用本文采用数学分析方法, 通过在发酵过程中的适时添加能量辅助物质柠檬酸钠, 提高了细胞内与能量代谢相关辅因子的水平, 促进了产朊假丝酵母生物合成 SAM 和 GSH 的能力摇瓶和分批培养条件下 SAM 和 GSH 联产量为 mg/l 和 mg/l, 分别比对照提高 26.8% 和 13.0% 作为一种常见的化工原料, 柠檬酸钠价格低廉, 可以方便地应用于发酵过程优化的实践中本文研究思路和结果对于类似耗能物质的过量合成乃至产业化生产都具有一定的参考价值参考文献 [1] MatoJM,AlvarezL,OrtizP,etal.S adenosylmethionine synthesis: molecularmechanisms and clinicalimplications. Pharmacology&Therapeutics,1997,77(3): [2] LiY, WeiG Y, Chen J. Glutathione: a review on biotechnological production. Applied Microbiology and Biotechnology,2004,66(3): [3]ShiozakiS,ShimizuS,YamadaH.ProductionofS adenosyl l methioninebysacharomycessake.journalofbiotechnology, 1986,4(6): [4] 王玉磊, 叶子优, 贺秋萍, 等.S 腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵中盐胁迫的作用. 生物加工过程,2012,10(3): WangY L,YeZY,HeQ P,etal.Co productionofs- adenosylmethionineandglutathioneundersalt-stresbycandida utilis.chinesejournalofbioprocesengineering,2012,10(3): [5]BrosnanJT,BrosnanM E,BertoloRFP,etal.Methionine:a metabolicalyuniqueaminoacid.livestockscience,2007,112 (1):2 7. [6] 邵娜, 卫功元, 葛晓光, 等. 紫外线 γ 射线复合诱变筛选 S 腺苷甲硫氨酸和谷胱甘肽联产发酵菌株. 辐射研究与辐射工艺学报,2010,28(2): ShaoN,WeiG Y,GeX G,etal.Complexmutagenesisof CandidautilisbyUV andγ raysfortheco productionofs adenosyl L methionine and glutathione. JournalofRadiation ResearchandRadiationProces,2010,28(2): [7] 王玉磊, 卫功元, 邵娜, 等. 基于能量代谢分析的 S 腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联合高产方法. 化工学报,2012,63(1): WangYL,WeiGY,ShaoN,etal.Strategyforenhancedco productionofs adenosylmethionineandglutathionebycandida utilisbasedonenergymetabolicanalysis.journalofchemical IndustryandEngineering,2012,63(1): [8]LiangG,LiaoX,DuG,etal.Elevatedglutathioneproduction byaddingprecursoraminoacidscoupledwithatpinhighcel density cultivation of Candida utilis. Journal of Applied Microbiology,2008,105(5): [9] 秦义, 董志姚, 刘立明, 等. 工业微生物中 NADH 的代谢调控. 生物工程学报,2009,25(2): QinY,DongZY,LiuLM,etal.ManipulationofNADH metabolism in industrial strains. Chinese Journal of Biotechnology,2009,25(2): [10]ZhouJ,LiuL,ShiZ,etal.ATPincurentbiotechnology: regulation, application and perspectives. Biotechnology Advance,2009,27(1): [11]ZhouJ,LiuL,ChenJ.ImprovedATPsupplyenhancesacid toleranceofcandidaglabrataduringpyruvicacidproduction. JournalofAppliedMicrobiology,2011,110(1): [12] SanchezC,NevesA R,CavalheiroJ,etal.Contributionof citratemetabolismtothegrowthoflactococuslactiscrl264at lowph.appliedandenvironmentalmicrobiology,2008,74: [13] Miler G. Use of3, 5 dinitrosalicylic acid reagent for determinationofreducingsugars.analyticalchemistry,1959, 31: [14] ShiozakiS,Shimizu S,YamadaH.S adenosyl l methionine productionbysacharomycessake:optimizationoftheculture conditionsfortheproductionofcelswithahighs adenosyl l methioninecontent.agriculturalbiologyandchemistry,1989, 53(12): [15] PenninckxM J.Anoverview onglutathioneinsacharomyces versusnon conventionalyeasts.femsyeastresearch,2002, 2:

6 54 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No IncreasedCo productionofs adenosylmethionineandglutathione bysodium CitrateAddition WANGYu lei ZHUJian WEIGong yuan XUHong qing WANGCheng fu (SchoolofBiologyandBasicMedicalSciences,SoochowUniversity,Suzhou ,China) Abstract S adenosylmethionine(sam)andglutathione(gsh)arebothimportantsmals contained compoundsincels.theefectsofsodium citrateonthefermentativeco productionofsam andgsh with CandidautilisCCTCCM wereinvestigatedinflasks.Sodium citratewasfoundtobebeneficialforthe highco productionofsam andgsh.theresponsesurfaceanalysiswasappliedintheoptimizationofsodium citrateconcentrationandadditiontime,andastrategyof10g/lsodiumcitrateadditionat6hwaspredictedby astatisticalmodelandverifiedtobethebestapproachforincreasedco productionofsam andgsh.basedon theresultsderivedfromthekineticanalysisonthebatchfermentationproceses,intracelularlevelsofnadhand ATPcouldbesignificantlyimprovedbysodium citrate,andwhichinturnprovidedesentialenergysubstance neededfortheover productionofsam andgsh.theresultsalsoprovideapotentialapproachforeficient productionofanalogicalusefulchemicalsbiosynthesizedwiththeconsumptionofenergy. Keywords S adenosylmethionine Glutathione ATP Co production Sodiumcitrate

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析第卷第期年月食品与生物技术学报响应面优化绿色木霉菌培养基黄雪莲于新仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州利用响应面分析法对绿色木霉菌的培养基进行优化通过测量不同营养条件下绿色木霉菌落生长直径研究其生物学特性在单因素实验的基础上选定葡萄糖添加量丙氨酸添加量和磷酸二氢钾添加量个因素进行中心组合实验建立二次回归方程并应用响应面分析法进行优化结果表明绿色木霉菌最佳培养基为葡萄糖

50 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 方法 种子培养将 -70 冷冻保藏的种子活化后接入种子培养基中, 在 r/min 下摇床培养 24h 摇瓶发酵培养将种子按照 10%(v/v) 的接种量接种至发酵培

50 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 方法种子培养将 -70 冷冻保藏的种子活化后接入种子培养基中, 在 r/min 下摇床培养 24h 摇瓶发酵培养将种子按照 10%(v/v) 的接种量接种至发酵培