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吊勇戴
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1 微生物学通报 Microbiology China 简报 MAY 20, 2010, 37(5): by Institute of Microbiology, CAS 人胰高血糖素样肽 -1 突变体融合蛋白在大肠杆菌中的自诱导表达优化 * 顾娟劳勋金明飞黄静吴自荣 ( 华东师范大学生命科学学院上海 ) 摘要 : 考察了在大肠杆菌中自诱导表达人胰高血糖素样肽 -1 突变体融合蛋白的可行性, 并对自诱导培养条件及培养基成分进行优化, 以提高实验结果表明, 最优培养基成分为蛋白胨 g/l, 酵母膏 9.59 g/l, Na 2 HPO g/l, KH 2 PO g/l, (NH 4 ) 2 SO g/l, NaCl 3.33 g/l, 甘油 2% (V/V), 葡萄糖 0.68 g/l, 乳糖 6.33 g/l, MgSO g/l 在温度 33 C 接种量 1% ph 7 装瓶量 20 ml/100 ml 培养条件下, 用该最优培养基自诱导表达人胰高血糖素样肽 -1 突变体融合蛋白的产量可达 mg/l 关键词 : 人胰高血糖素样肽 -1 突变体, 自诱导, 优化, 正交设计, 均匀设计 Auto-inducing Expression Optimization of Mutant Human Glucagon-like Peptide-1 Fusion Protein in Escherichia coli BL21 (DE3) GU Juan LAO Xun JIN Ming-Fei HUANG Jing * WU Zi-Rong (School of Life Science, East China Normal University, Shanghai , China) Abstract: The auto-inducing expression of mutant human glucagon-like peptide-1 fusion protein in Escherichia coli BL21 (DE3) was studied. In order to increase the protein yield, we optimized both the auto-induction fermentation conditions and medium. The results showed that the optimal auto-induction medium is: tryptone g/l, yeast extract 9.59 g/l, Na 2 HPO g/l, KH 2 PO g/l, (NH 4 ) 2 SO g/l, NaCl 3.33 g/l, glycerol 2% (V/V), glucose 0.68 g/l, lactose 6.33 g/l, MgSO g/l. The genetically engineered strain was cultivated at 33 C, ph 7, in a 100 ml flask containing 20 ml such medium, with the inoculum size of 1%, for 12 h. Then the yield of mutant human glucagon-like peptide-1 fusion protein reached mg/l. Keywords: Mutant human glucagon-like peptide-1, Auto-induction, Optimization, Orthogonal design, Uniform design 基金项目 : 国家重大新药创制项目 (No. 2009ZX ); 上海市科委登山计划资助项目 (No. 06DZ19016) * 通讯作者 :Tel: ; : jhuang@bio.ecnu.edu.cn 收稿日期 : ; 接受日期 :

2 顾娟等 : 人胰高血糖素样肽 -1 突变体融合蛋白在大肠杆菌中的自诱导表达优化 727 人胰高血糖素样肽 -1 (Human glucagon-like peptide-1, hglp-1) 是人进食后由远端回肠结肠和直肠的 L 细胞分泌释放的一种活性多肽激素, 它能通过与胰岛 β 细胞表面的受体特异性结合, 使葡萄糖诱导的胰岛素分泌作用显著增强 [1] 同时, hglp-1 还能作用于中枢神经系统抑制人的食欲 [2], 具有维持并增加胰岛 β 细胞数目抑制胃肠排空及抑制胰高血糖素的分泌等作用, 可调节餐后的胰岛素水平和血糖代谢 [3 4] hglp-1 的肠促胰岛素作用依赖于葡萄糖的浓度, 用其治疗糖尿病不会发生低血糖, 在 II 型糖尿病的治疗中具有重要的价值 [5] 但是, hglp-1 在体内极易被二肽基肽酶 Ⅳ (Dipeptidyl peptidase Ⅳ, DPP- Ⅳ ) 降解, 半衰期只有 2 6 min [6], 极大地限制了其临床应用本实验室已通过定点突变得到能够延长半衰期的人胰高血糖素样肽 -1 突变体 (DTrGLP-1) 基因, 并将其克隆到 pet-32a 载体上进行诱导表达 [7], 但较低, 有待于进一步提高一般 pet 系统采用非代谢性乳糖类似物异丙基 -β-d- 巯基半乳糖苷 (IPTG) 作为诱导物进行诱导, 但由于 IPTG 具有潜在的毒性, 对菌体生长有一定的抑制作用, 且价格昂贵, 目前国内外已有很多研究用乳糖代替 IPTG 作为乳糖启动子的诱导剂 [8 10] 2005 年, Studier F William 研究出一套自诱导表达系统 [11], 该系统中含有一定比例的葡萄糖和乳糖, 葡萄糖耗尽后乳糖才被利用, 目的蛋白开始表达自诱导发酵的最终菌体密度大, 高, 但目前该系统的应用研究较少, 且各菌株所需的生长条件不同, 需进一步研究本研究考察了在大肠杆菌中自诱导表达人胰高血糖素样肽 -1 突变体融合蛋白的可行性, 然后对培养条件及培养基成分进行优化, 以提高降低生产成本 0.24 g/l] [11] 1.2 实验方法菌种的活化 : 取 70 C 保存的甘油种划板, 37 C 培养 16 h; 挑单菌落接种于 LB 液体培养基, 37 C 210 r/min 培养 12 h, 即成为活化种子自诱导培养条件 : 2% (V/V) 转接活化菌种至 ph 7 装瓶量 20 ml/100 ml 的自诱导培养基中, 37 C 210 r/min 培养菌体密度的测定 : 发酵液稀释合适倍数, 用分光光度计测定 600 nm 处的吸光值, 其与稀释倍数的乘积即发酵液的菌体密度 (OD 600 ) 目的蛋白表达量的测定 : 发酵液稀释至 OD 600 = 6 后进行 15% SDS-PAGE, 考马斯亮蓝染色脱色后用凝胶成像系统分析目的蛋白占总蛋白的百分比目的的计算 : 目的 = 菌体湿重每克湿菌体含总蛋白量目的蛋白表达量 / 菌液体积 2 结果与讨论 2.1 发酵时间的选择用 ZYP 自诱导培养基对重组 DTrGLP-1 基因工程菌进行自诱导发酵, 每小时取样测 OD 600 并进行电泳结果如图 1 所示, 在 0 5 h 内菌体密度呈对数增长, 5 h 后增长缓慢 ; 目的蛋白从 4 h 时开始表达, 4 6 h 内表达量急剧升高, 9 h 时达到最高表达量, 之后表达量逐渐降低 ; 目的在 4 6 h 内迅速增加, 6 h 后增长缓慢, 12 h 时达到最大值, 之后稍微有所下降, 因此确定发酵时间为 12 h 1 材料与方法 1.1 材料菌株 : 基因工程菌 E. coli BL21 (DE3)/pET- 32a-DTrGLP-1, 由本实验室构建并保存培养基 : 种子培养基 : LB 培养基 ; 自诱导培养基 : ZYP 培养基 [ 蛋白胨 10 g/l, 简称 Z; 酵母膏 5 g/l, 简称 Y; Na 2 HPO g/l, KH 2 PO g/l, (NH 4 ) 2 SO g/l, 三者合并简称 P; 另含甘油 0.5% (V/V), 葡萄糖 0.5 g/l, 乳糖 2 g/l, MgSO 4 图 1 不同发酵时间的菌体密度目的蛋白表达量及产量 Fig. 1 Cell density, target protein expression level and yield in different fermentation time

3 728 微生物学通报 2010, Vol.37, No 培养基的改进在以 Studier [11] 给出的 ZYP 培养基对重组 DTrGLP-1 基因工程菌进行自诱导发酵时, 发现在培养基中添加 NaCl ( 终浓度 5 g/l) 后不但最终菌体密度有所增加, 而且目的蛋白表达量显著提高这说明适量的 NaCl 对该菌株的生长及目的蛋白表达有促进作用因此, 我们在 ZYP 培养基中添加 NaCl 至终浓度 5 g/l, 并将这种培养基命名为 ZYPB 培养基 (B 表示 NaCl 5 g/l) 用 ZYPB 培养基对重组 DTrGLP-1 基因工程菌进行自诱导发酵, 可达 mg/l, 是用 ZYP 培养基发酵产量的 2.5 倍 ( 图 2) 表 1 培养条件单因素实验设计及结果 Table 1 Single factor experiments design and results 因素 Factors 温度 Temperature ( C) 接种量 Inoculum size (%) ph 装瓶量 Liquid volume (ml/100 ml) 水平 Levels OD 600 蛋白表达量 Expression level (%) Protein yield (mg/l) 图 2 ZYP 及 ZYPB 自诱导培养基发酵的菌体密度目的蛋白表达量及产量 Fig. 2 Cell density, target protein expression level and yield in auto-induction midia of ZYP and ZYPB 2.3 培养条件的优化单因素实验优化培养条件 : 选择影响发酵的 4 种培养条件 : 温度接种量 ph 装瓶量分别进行单因素实验, 各因素取值及结果见表 1 实验结果表明, 28 C 时, 自诱导发酵重组 DTrGLP-1 基因工程菌的最终菌体密度目的蛋白表达量及产量最高 ; 接种量 ph 对菌体生长目的蛋白表达量及产量影响较小 ; 随着装瓶量的增加, 目的蛋白表达量增加, 但最终菌体密度降低, 导致降低通过前面的实验可知, 菌体密度及蛋白表达量共同影响着蛋白的最终产量因为优化的最终目的是提高, 所以之后的实验以为指标, 省略菌体密度及蛋白表达量数据正交设计实验优化培养条件 : 以温度接种量 ph 装瓶量为研究对象, 在前期单因素实验的基础上各选择 3 个合适的水平进行 4 因素 3 水平正交设计实验, 实验设计及结果分析见表 2 由表 2 可知, 4 种培养条件对的影响由大到小依次为 : 装瓶量温度 ph 接种量, 最优培养条件为 : 温度 33 C 接种量 1% ph 7 装瓶量 5 ml/100 ml 但考虑到在摇瓶发酵中 5 ml/100 ml 的装瓶量不便于实际操作, 且较浪费实验资源, 所以后续实验采用 20 ml/100 ml 的装瓶量, 其他实验条件不变 2.4 培养基成分的优化自诱导培养基中的各成分对于菌株的生长和目的蛋白的表达有着不同的作用, 因此需要摸索一个合适的配方用于该菌株的自诱导发酵单因素实验优化培养基成分 : 以 ZYPB 自诱导培养基中的各成分 : Z Y P B 甘油葡萄糖乳糖 MgSO 4 为研究对象进行单因素实验, 其中 Z 和 Y 既可作为碳源又可作为氮源, 所以将二者合并为一个因素进行研究, 称之为 ZY 研究某成分时, 以 ZYPB 自诱导培养基中该成分浓度为基准, 将该成分终浓度设置为和 4 倍, 其

4 顾娟等 : 人胰高血糖素样肽 -1 突变体融合蛋白在大肠杆菌中的自诱导表达优化 729 因素 Factors Protein yield (mg/l) 表 2 L 9 (3 4 ) 正交设计表及结果分析 Table 2 The L 9 (3 4 ) orthogonal design table and the analysis of results 温度 Temperature ( C) 接种量 Inoculum size (%) ph 装瓶量 Liquid volume (ml/100 ml) Protein yield (mg/l) Test Test Test Test Test Test Test Test Test k k k 极差 R 他成分浓度不变实验结果表明, ZYPB 自诱导培养基中各成分浓度对均有影响, 其影响从大到小依次为 : ZY P B 甘油乳糖葡萄糖 MgSO 均匀设计实验优化培养基成分 : 通过均匀设计实验不但可以找到最优的实验组合, 而且还可建立能定量描述指标和因素间关系的数学模型因此本研究在实验结果的基础上, 排除影响较小的因素 MgSO 4, 选取 ZY P B 甘油葡萄糖乳糖 6 个因素为研究对象进行均匀设计实验通过单因素结果可知, 各因素对的影响可拟合为二次函数, 所以在进行均匀设计建模分析时对各因素均采用二次多项式回归模型本实验采用 U * 28(28 8 ) 均匀设计表, 各因素浓度以 ZYPB 自诱导培养基中各成分浓度为基准, 下限设为 0.25 倍, 上限设为 4 倍, 各因素水平数相等, 均等于实验次数, 实验设计及结果见表 3 用均匀设计软件对实验结果进行全回归分析, 得出与自诱导培养基各因素关系的方程 : y = X X X X X X 6 18 X X X X X X 2 6, 决定系数 R 2 =0.9526, 显著性水平 α = 0.05, 检验值 F t =25.13, 临界值 F 0 =2.475, F t >F 0, 回归方程显著据模型预测, 当 ZY 为倍 P 为 0.25 倍 B 为 0.25 倍甘油为 4 倍葡萄糖为 4 倍乳糖为倍时最高, 预测值为 (418 ± 53.6) mg/l 按该预测最优配方进行实验验证, 目的为 mg/l, 这与预测值有一定偏差, 可能是由于蛋白表达量较高时, 目的蛋白在 SDS-PAGE 中聚集成团, 凝胶成像系统分析胶图时, 分析值会略小于实际值但根据均匀设计实验点布点均匀代表性强的特性, 可用直接观察法从实验中挑选表现最好的实验条件组合本研究中最优配方为均匀设计表实验 13 的配方, 即 : 蛋白胨 g/l, 酵母膏 9.59 g/l, Na 2 HPO g/l, KH 2 PO g/l, (NH 4 ) 2 SO g/l, NaCl 3.33 g/l, 甘油 2% (V/V), 葡萄糖 0.68 g/l, 乳糖 6.33 g/l, MgSO g/l 2.5 重组 DTrGLP-1 基因工程菌在 4 种培养基中的发酵情况的比较用优化后的 ZYPB 自诱导培养基对重组 DTrGLP-1 基因工程菌进行自诱导发酵, 并以 IPTG 诱导的 LB 培养基文献 [11] 给出 ZYP 自诱导培养基及 Novagen 公司推荐的 Overnight Express Instant TB Medium 为对照进行比较结果见表 4, 优化后的 ZYPB 自诱导培养基的发酵产量最高, 依次是 LB ZYP Instant TB 培养基发酵产量的倍

5 730 微生物学通报 2010, Vol.37, No.5 因素 Factors ZY P B 表 3 U * 28 (28 8 ) 均匀设计表及结果 Table 3 The U * 28 (28 8 ) uniform design table and results 甘油 Glycerol 葡萄糖 Glucose 乳糖 Lactose Protein yield (mg/l) Test Test Test Test Test Test Test Test Test Test Test Test Test Test Test Test Test Test Test Test Test Test Test Test Test Test Test Test 表 4 四种培养基发酵的菌体密度目的蛋白表达量及产量 Table 4 Cell density, target protein expression level and yield in four types of media 培养基 Medium OD 600 蛋白表达量 Expression level (%) Protein yield (mg/l) LB ZYP Instant TB ZYPB 结论 (1) 用 ZYP 培养基自诱导表达人胰高血糖素样肽 -1 突变体融合蛋白的产量 (75.5 mg/l) 是用 IPTG 诱导的 LB 培养基产量 (26.5 mg/l) 的 3 倍, 说明在大肠杆菌中自诱导表达人胰高血糖素样肽 -1 突变体融合蛋白具有可行性 (2) ZYP 培养基改进为 ZYPB 培养基后, 蛋白产量可从改进前的 75.5 mg/l 提高到改进后的 mg/l 说明在自诱导发酵中, 适量的 NaCl 对于该菌株的生长及目的蛋白表达有促进作用 (3) 经过优化得出最优培养基成分为 : 蛋白胨 g/l, 酵母膏 9.59 g/l, Na 2 HPO g/l, KH 2 PO g/l, (NH 4 ) 2 SO g/l, NaCl 3.33 g/l, 甘油 2% (V/V), 葡萄糖 0.68 g/l, 乳糖 6.33 g/l, MgSO g/l 在温度 33 C 接种量 1% ph 7 装瓶量 20 ml/100 ml 培养条件下, 用该最优培养基自诱导表达人胰高血糖素样肽 -1 突变体融合蛋白的

6 顾娟等 : 人胰高血糖素样肽 -1 突变体融合蛋白在大肠杆菌中的自诱导表达优化 731 产量可达 mg/l, 且高于 Novagen 公司推荐的 Overnight Express Instant TB Medium 发酵产量, 这不仅降低了生产成本, 为大规模生产提供了理论依据, 还为自诱导在其他蛋白生产上的应用提供了参考参考文献 [1] Ahren B, Pacini G. Dose-related effects of GLP-1 on insulin secretion, insulin sensitivity, and glucose effectiveness in mice. Am J Physiol, 1999, 277(6): E996 E1004. [2] Wilding JP, Smith DM, Ghatei MA, et al. A role for glucagon-like peptide-1 in the central regulation of feeding. Nature, 1996(379): [3] Parkes DG, Pirrner R, Jodka C, et al. Insulinotropic actions of exendin-4 and glucagon-like peptide-1 in vivo and in vitro. Metab, 2001, 50(5): [4] Toft-nielsen MB, Madsbad S, Holst JJ. Determinants of the effectiveness of glucagon-like peptide-1 in type 2 diabetes. J Clin Endocrinol Metab, 2001, 86(8): [5] Drucker MD. Enhancing incretin action for the treatment of type 2 diabetes. Diabetes Care, 2003, 26(10): [6] Hansen L, Deacon CF, Orskov C, et al. Glucagon-like peptide-1-(7-36) amide is transformed to glucagon-like peptide-1-(9-36) amide by dipeptidyl peptidase Ⅳ in the capillaries supplying the L cells of the porcine intestine. Endocrinology, 1999, 140(11): [7] 金明飞. 口服胰高血糖素样肽 -1 的筛选和应用研究. 华东师范大学博士学位论文, [8] 张毅, 屈贤铭, 杨胜利. 乳糖作为诱导剂对重组目的蛋白表达的影响. 生物工程学报, 2000, 16(4): [9] 陈亮, 任随周, 许枚英, 等. 乳糖替代 IPTG 诱导脱色酶 TpmD 基因在大肠杆菌中的高效表达. 微生物学通报, 2009, 36(4): [10] Gombert AK, Kilikian BV. Recombinant gene expression in Escherichia coli cultivation using lactose as inducer. J Biotechnol, 1998, 60(1/2): [11] Studier FW. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expr Purif, 2005, 41(1): 编辑部公告关于微生物学通报专题刊申请的通知当前, 随着生物技术的飞速发展, 微生物学涵盖的领域越来越广, 交叉学科的研究也越来越受到关注除了已有的微生物学病毒学基因工程细胞工程酶工程发酵工程之外, 基因组学代谢工程纳米科学生物炼制生物质能等也逐步成为微生物学研究的热门领域为了更加系统集中地反映各个领域的研究成果, 以及该领域学科的热点难点问题, 充分发挥微生物学通报的学科引领和导向作用, 促进学科发展, 为某个领域的科研人员提供一个交流的平台, 微生物学通报编委会决定自 2008 年起, 每年出版一定数量的专题刊专题刊将系统地反映微生物学相关领域或新学科生长点的最新进展, 及时介绍国内外微生物相关前沿领域的突破性成果, 以及面向国家和社会发展需要并具有重大应用前景的研究成果真诚欢迎本领域各学科的学术带头人, 申请并组织专题刊申请得到编委会批准后, 申请人将被邀请担任本专题刊的特邀编辑, 负责组织稿件确定审稿专家, 并撰写专题刊序言根据专刊工作计划, 现将有关事项通知如下 : 1. 专刊申请的有关规定附在通知的下面, 请申请者仔细阅读 ; 2. 提交形式 : 请到我刊主页 () 的文件下载专区下载专题刊申请表 ; 填写好之后, 以附件的形式发送到编辑部信箱 : tongbao@im.ac.cn, 并请在邮件主题中注明 : 专题刊申请字样 ; 3. 申请者如有疑问, 请咨询编辑部联系方式 : Tel: ; tongbao@im.ac.cn

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Microsoft Word - 崔宝臣.doc 微生物学通报 DEC 20, 2009, 36(12): 1871~1875 Microbiology tongbao@im.ac.cn 2009 by Institute of Microbiology, CAS 简报正交实验优选光合细菌混合菌群产氢的最佳条件 * 崔宝臣张国欣侯博邵姝媛 ( 163318) 摘要 : 对光合细菌混合菌群产氢影响因子进行了实验研究通过单因素实验和正交实验, 系统考察了碳源