42 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 技术公司 1.4 培养方法种子培养 : 从 -80 保藏的甘油管中接 100μl 菌液于含 100μg/ml 氨苄霉素的种子培养基中 (50ml 培养基 /250ml 三角瓶 ), 于 r/min

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磋日潘
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2013,33(2):41 46 重组大肠杆菌产 Streptomycessp.FA1 来源木聚糖酶的摇瓶发酵优化何 1,2 洁 1,2 宿玲恰吴 1,2 敬 (1 江南大学食品科学与技术国家重点实验室无锡 ) (2 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡 ) 摘要为了实现来源于 Streptomycessp.FA1 的木聚糖酶的高效胞外分泌表达, 对 E.coliBL21 (DE3)/pET20b(+)/coe/xynA 基因工程菌的发酵产酶诱导条件进行优化, 获得最优的诱导条件为 25 发酵 6h 后添加终浓度为 0.4mmol/L 的 IPTG 在此基础上对发酵培养基进一步优化, 得到最优培养基成分为 : 甘油 11g/L, 酵母粉 24g/L, 蛋白胨 8g/L, 磷酸盐浓度 89mmol/L, 镁离子 4 mmol/l 最终酶活达到 780.2U/ml, 为未优化前的 2.2 倍, 是目前大肠杆菌摇瓶发酵产木聚糖酶的最高表达水平, 为实现该酶的工业化生产奠定基础关键词链霉菌木聚糖酶重组大肠杆菌发酵优化中图分类号 Q819 木聚糖 (Xylan) 是植物细胞壁半纤维素组分的主要成分, 占植物碳水化合物总量的三分之一在自然界中, 木聚糖是继纤维素之后含量最为丰富的多聚糖 [1] 木聚糖的主链由多个毗喃木糖基通过 β 1,4 糖苷键连结形成, 侧链含多种不同取代基 [2] 木聚糖酶属于 O glycosidehydrolases(ec3.2.1.x), 可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖单糖它是一种复合酶, 主要包括 endo β 1,4 xylanase(ec ) 和 β xylosidase (EC ) 前者从主链内部随机作用于 β 1,4 糖苷键, 将木聚糖分解成低聚木糖 ; 后者则作用于低聚木糖的末端, 释放出木糖单糖 [3] 木聚糖酶可广泛应用于制浆造纸饲料食品和能源工业中 [4] 迄今, 已经有一些关于放线菌来源的木聚糖酶的报道, 其中大部分为链霉菌, 如 Streptomycessp. SWU10 [5],StreptomycesmegasporusDSM [6],Streptomyces sp.s27 [7],S.olivaceoviridisE 68 [8] 等等 ; 并且也有不少链霉菌来源的木聚糖酶在酵母大肠杆菌及链霉菌中表达, 其中, 木聚糖酶在酵母中的表达水平普遍较高, 收稿日期 : 修回日期 : 国家自然科学基金 ( )( ) 江苏省科学与技术支持项目 (BE ) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :jingwu@jiangnan.edu.cn 而在大肠杆菌中表达水平普遍很低, 一般在 4.4U/ml ~23.5U/ml [9 11] 本实验室前期工作从来源于天然沤竹体系的一株 Streptomycessp.FA1 中分离纯化出一种木聚糖酶, 并成功地在大肠杆菌中表达本研究在此基础上对基因工程菌 E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)/coe/xynA 的发酵产酶进行优化, 以实现高效胞外分泌表达木聚糖酶, 为进一步工业化廉价生产木聚糖酶奠定基础 1 材料与方法 1.1 菌株由本实验室构建并保藏的基因工程菌 E.coliBL21 (DE3)/pET20b(+)/coe/xynA, 含 Streptomycessp. FA1 木聚糖酶基因 1.2 培养基 LB 培养基 (g/l): 蛋白胨 5g, 酵母粉 5g,NaCl10g TB 培养基 (g/l): 蛋白胨 12g, 酵母粉 24g, 甘油 5 g,k 2 HPO 4 3H 2 O16.43g,KH 2 PO 4 2.3g 1.3 试剂蛋白胨酵母粉购自 Oxoid 公司, 其他试剂均为国产分析纯, 购自国药化学试剂有限公司卡那霉素和异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG) 购自上海生工生物

2 42 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 技术公司 1.4 培养方法种子培养 : 从 -80 保藏的甘油管中接 100μl 菌液于含 100μg/ml 氨苄霉素的种子培养基中 (50ml 培养基 /250ml 三角瓶 ), 于 r/min 回转式摇床培养 8h 发酵培养 : 将培养 8h 的种子以 5% 的接种量接入含 100μg/ml 氨苄霉素的发酵培养基 (100ml 培养基 / 500ml 三角瓶 ),25 200r/min 回转式摇床培养 48h 1.5 分析方法菌体干重的测定取 2ml 菌液,10000 g 离心 10min, 将沉淀下来的细胞用 0.9% (w/v)nacl 漂洗 2 次, 然后在 105 烘干 16h 以达到恒重 DCW (g/l)= 烘干后恒重 (g)/0.002(l) 酶活力测定方法参照 DNS 还原糖量测定法 [12] : 取 1ml 适当稀释的酶液, 加入到 1ml 用 50 mmol/l,ph5.5 的磷酸缓冲液配制的 1% (w/v) beechwoodxylan 底物溶液中,50 反应 10min 后加入 3mlDNS, 煮沸 10min 迅速冷却, 稀释后 540nm 下测吸光度 ( 以灭活的酶液同样操作作为空白对照 ) 以木糖作标准曲线测定释放的还原糖量木聚糖酶活力单位 (U) 的定义为 : 在上述条件下, 每分钟水解木聚糖生成 1μmol 还原糖所需要的酶量 2 结果与讨论 2.1 菌体生长曲线及产酶曲线研究对发酵过程来说, 种龄的选择至关重要, 可影响发酵周期和产物的生成为了确定合适的种龄, 本实验对 LB 培养基中菌体生长曲线进行了研究, 结果见图 1 在图 1 中,0~4h 菌体生长较慢, 为延滞期 ;4~8h 菌体快速生长, 为对数生长期 ;8~12h 菌体干重不再增加, 进入稳定期 ;12h 以后菌体干重开始下降, 进入衰亡期因此, 最佳接种时间为对数生长的中后期, 选择生长 6~8h 种龄的菌体转接入 TB 培养基, 结果如图 2 所示菌体生长和产酶良好, 延滞期较短,48h 后酶活可达到 346.8U/ml, 因此可选用培养 6~8h 的种子 2.2 诱导条件的优化诱导温度的影响温度是影响菌体生长和诱导重组蛋白表达的重要因素, 在发酵过程中应严格地控制培养温度本实验比较了三种培养温度下大肠杆菌生长及产酶的情况, 从表 1 可见, 随着培养温度的升高, 大肠杆菌的生长越好, 但产酶情况与菌体的生长规图 1 重组菌在 LB 培养基中的生长曲线 Fig.1 GrowthcurveofE.coliinLBmedium 图 2 重组菌在 TB 培养基中的生长曲线和产酶曲线 Fig.2 Celsgrowthandxylanasesproduction bye.coliintbmedium 律截然不同, 当诱导温度为 25 时的胞外酶活最高, 为 345.3U/ml, 分别是 30 和 37 的 1.3 倍和 1.7 倍因此, 选择 25 低温诱导表 1 诱导温度对重组大肠杆菌生长和产酶的影响 Table1 EfectoftemperatureontheE.coli growthandxylanasesproduction Temperature( ) DCW Activity(U/ml) IPTG 诱导时间及浓度的影响目前,T7 启动子启动的诱导剂主要有两种 : 异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG) 和乳糖 IPTG 是一种极强的诱导剂, 十分稳定, 不易被菌体代谢, 而乳糖可能在菌体的代谢过程中充当碳源和能源被降解 [13] 因此, 本实验选用 IPTG 作为诱导剂, 并采用单因素实验考察 IPTG 诱导时间及浓度对菌体生长和产酶的影响结果如图 3 4 所示, 当 25 发酵 6h 后在培养基中添加终浓度为 0.4mmol/L 的 IPTG, 酶活达到最高, 为 516.5U/ml, 是优化前酶活 (345.3U/ml) 的近 1.5 倍

3 2013,33(2) 何洁等 : 重组大肠杆菌产 Streptomycessp.FA1 来源木聚糖酶的摇瓶发酵优化 43 酶活达到最高, 为 611.1U/ml, 并且由图 6 可见适当提高甘油浓度有利于菌体的生长, 但是当甘油浓度达到 15g/L 以上时, 菌体的产酶能力明显受限图 3 诱导时间对重组大肠杆菌生长和产酶的影响 Fig.3 EfectofthetimeofaddingIPTG onthe 图 5 碳源对重组菌生长及产酶的影响 Fig.5 Efectsofdiferentcarbonsourcesonthe 图 4 诱导浓度对重组大肠杆菌生长和产酶的影响 Fig.4 EfectoftheconcentrationofIPTG onthe 2.3 发酵培养基的优化培养基是微生物生存的营养来源, 不同微生物所需要的营养成分及浓度配比并不完全相同, 需要按照实际情况加以选择因此, 在优化了诱导产酶条件的基础上, 本实验对初始发酵培养基 (TB) 实施进一步优化, 以促进菌体的生长并提高产酶量碳源及其浓度对重组菌产酶的影响碳源作为培养基的主要成分之一, 是生命过程中的重要的能源物质, 它参与菌体的生长和产物的合成, 对菌株的发酵生产影响重大 [14] 按照含碳质量分数相等的原则, 分别以葡萄糖乳糖蔗糖麦芽糖可溶性淀粉代替 TB 培养基中的甘油 (5g/L) 为碳源进行单因素实验如图 5 所示, 重组菌对 6 种碳源的利用情况有所不同, 最容易利用的是甘油, 其次是葡萄糖, 而对其他碳源利用程度较差当以甘油为碳源时, 菌体生成良好, 且酶活最高, 因此选用甘油作为最佳碳源在甘油作为唯一碳源的基础上, 选择合适的甘油浓度至关重要由图 6 可知, 随着甘油浓度的增加, 胞外酶活先增加后降低的趋势当甘油浓度为 8g/L 时, 胞外图 6 甘油浓度对重组菌生长及产酶的影响 Fig.6 Efectsofdiferentconcentrationsofglycerol onthe 氮源及其浓度对重组菌产酶的影响氮源是构成菌体细胞物质的主要成分, 如氨基酸蛋白质核酸等和含氮代谢物等按照上述碳源的研究方法, 通过改变发酵培养基中的氮源来研究不同氮源对重组菌生长和产酶的影响按照含氮质量分数相等的原则 (TB 培养基中含氮量为 4.32g/L), 分别以 NH 4 Cl (NH 4 ) 2 SO 4 NaNO 3 尿素酵母粉蛋白胨为氮源进行单因素实验如图 7 所示, 菌体对蛋白胨和酵母粉利用较好, 酶活相应较高进而考察酵母粉和蛋白胨复配使用的效果, 酵母粉蛋白胨的比例为如图 8 所示, 当酵母粉蛋白胨的比例为 3 1 时, 菌体生长良好, 且酶活最高, 达到 627.7U/ml 为了进一步提高木聚糖酶的产量在此基础上对复配氮源浓度进行考察, 结果如图 9 所示, 复配氮源浓度对菌体的生长影响很小, 而对菌体产酶影响较大当氮源浓度为 24g/L 时 ( 酵母粉浓度为 18g/L, 蛋白胨 6

4 44 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No g/l), 酶活达到最高, 为 646.6U/ml 大肠杆菌生长及胞外产酶的影响由图 10 可知, 当磷酸盐浓度低于 50mmol/L 时, 菌体生长受到抑制 ; 而胞外酶活则随着磷酸盐浓度的增加先上升后下降, 其中磷酸盐浓度为 89mmol/L 时的胞外酶活最高, 为 U/ml 图 7 不同氮源对重组菌生长及产酶的影响 Fig.7 Efectsofdiferentnitrogensourcesonthe 图 10 磷酸盐浓度对重组菌生长及产酶的影响 Fig.10 Efectsofdiferentconcentrationsofphosphate onthe 图 8 氮源复配比对重组菌生长及产酶的影响 Fig.8 EfectsofdiferentritioofYeastExtract Peptone onthe 金属离子及其浓度对重组菌产酶的影响金属离子对细胞的生长和酶的活性具有重要的影响, 因此在微生物发酵生产酶的过程中也经常会在培养基中添加相应的金属离子为了考察不同金属离子对重组大肠杆菌胞外生产木聚糖酶的影响, 本实验在发酵培养基中添加了终浓度为 2.5mmol/L 的不同金属离子由图 11 可知, 钙离子和锰离子均能促进菌体的生长, 图 9 复合氮源浓度对重组菌生长及产酶的影响 Fig.9 Efectsofdiferentconcentrationsofnitrogen sourceonthe 磷酸盐浓度对重组菌产酶的影响磷是构成核酸脂和三磷酸腺苷的重要组分, 在能量代谢中起重要的调节作用磷的存在有利于糖代谢, 并能缓冲培养基的 ph 变化, 但当培养基中磷的含量过高时, 某些酶的活性和产物的合成会受到抑制本实验以初始培养基 TB 中 K 2 HPO 4 3H 2 O KH 2 PO 4 =7 1 的比例配置不同浓度的磷酸盐溶液, 考察不同浓度磷酸盐对重组图 11 金属离子对重组菌生长及产酶的影响 Fig.11 Efectsofdiferentmetalicionsonthe 铜离子和钴离子明显抑制菌体生长至于产酶能力, 只有镁离子对大肠杆菌的胞外产酶能力有一定的帮助, 酶活可达到 681.6U/ml; 而锌离子铜离子钴离子和锰离子则抑制了大肠杆菌的胞外产酶不同浓度的镁离子对大肠杆菌生长及产酶的影响不同如图 12 所示, 随着镁离子浓度的增加, 菌体生长基本无影响 ; 而酶活则随着镁离子浓度的增加, 先上

5 2013,33(2) 何洁等 : 重组大肠杆菌产 Streptomycessp.FA1 来源木聚糖酶的摇瓶发酵优化 45 升后降低, 当镁离子浓度为 4mmol/L 时, 胞外酶活最高, 为 723.5U/ml 素选取三个水平, 实验设计如表 2 所示 : 表 2 正交实验方案设计 Table2 Factorsandlevelsoforthogonalexperiment Levels A Glycerol (g/l) B Nitrogen source(g/l) Factors C PO 4 3 (mmol/l) D Mg 2+ (mmol/l) 图 12 Mg 2+ 在不同浓度对重组菌生长及产酶的影响 Fig.12 EfectsofdiferentconcentrationsofMg 2+ onthe 发酵培养基的正交试验研究为综合考察各因素对菌体生长和产酶的效果, 选取甘油复配氮源磷酸盐浓度 Mg 2+ 浓度四个因素进行正交实验, 每个因对正交试验结果进行极差分析, 表格 3 表明各指标对重组酶的影响大小依次为 : 甘油 > 磷酸盐浓度 > 复合碳源 >Mg 2+ 浓度 ; 较好的实验方案应该是 :A 3 B 3 C 2 D 2, 即甘油 11g/L, 酵母粉 24g/L, 蛋白胨 8g/L, 磷酸盐浓度 89mmol/L, 镁离子 2.5mmol/L 采用此较优组合的发酵培养基进行发酵验证, 酶活为 780.2U/ml, 相对于未优化前 (516.5U/ml), 酶活提高了 51% 左右 Factors 表 3 正交试验极差分析结果 Table3 Orthogonalexperimentresultanalysis A B C D Glycerol Nitrogensource PO 4 3 Mg 2+ Activity (U/ml) , k k k R Theoptimallevel A 3 B 3 C 2 D 2 3 结论本文以含 Streptomycessp.FA1 木聚糖酶基因的重组大肠杆菌为出发菌株, 从发酵过程中诱导温度时间及浓度入手进行优化, 使得重组木聚糖酶在大肠杆菌中的表达得到了较大的提高在考察诱导产酶条件的基础上, 对发酵培养基中的营养成分进行了研究, 考察了碳源氮源磷酸盐和金属离子对重组大肠杆菌产酶的影响, 确定了最佳培养基成分通过正交试验优化得到的培养基为甘油 11g/L, 酵母粉 24g/L, 蛋白胨 8 g/l, 磷酸盐浓度 89mmol/L, 镁离子 4mmol/L, 在此条件下 25 发酵 6h 后添加终浓度为 0.4mmol/L 的 IPTG, 酶活从初始 346.8U/ml 提高到 780.2U/ml, 是未优化前的 2.2 倍, 是目前所报道的大肠杆菌摇瓶发酵产木聚糖酶的最高表达水平, 为实现该酶的工业化生产打下基础参考文献 [1]BegQ,KapoorM,MahajanL,etal.Microbialxylanasesand their industrial applications: a review. Appl Microbiol

6 46 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No Biotechnol,2001,56(3 4): [2]ColinsT,GerdayC,FelerG.Xylanases,xylanasefamiliesand extremophilicxylanases.femsmicrobiolrev,2005,29(1):3 23. [3]BielyP.Microbialxylanolyticsystems.TrendsBiotechnol1985; 3(11): [4] PolizeliM L,RizatiA C,MontiR.Xylanasesfrom fungi: propertiesandindustrialapplications.applmicrobiolbiotechnol, 2006,67(5): [5] DeesukonW,NishimuraY,HaradaN,etal.Purification, characterizationandgenecloningoftwoformsofathermostable endo xylanasefrom Streptomycessp.SWU10.ProcesBiochem, 2011,46(12): [6]QiuZ,ShiP,LuoH,etal.A xylanasewithbroadph and temperature adaptability from Streptomyces megasporus DSM 41476,anditspotentialapplicationinbrewingindustry.Enzyme MicrobTech,2010,46(6): [7]LiN,ShiP,YangP,etal.AxylanasewithhighpH stability fromstreptomycessp.s27anditscarbohydrate bindingmodule with/withoutlinker region truncated versions. ApplMicrobiol Biotechnol,2009,83(1): [8]JiangZ,DengW,YanQ,etal.Subunitcompositionofalarge xylanolytic complex ( xylanosome) from Streptomyces olivaceoviridise 86.JBiotechnol,2006,126(3): [9] LiN,MengK,WangY,etal.Cloning,expresion,and characterization ofa new xylanase with broad temperature adaptability from Streptomyces sp. S9. Appl Microbiol Biotechnol,2008,80(2): [10] LiN,YangP,WangY,etal. Cloning, expresion, and characterizationofprotease resistantxylanasefrom Streptomyces fradiaevar.k11.jmicrobiolbiotechnol,2008,18(3): [11]ChoiJH,LeeO S,ShinJH,etal.Thermostablexylanase encodedbyxynaofstreptomycesthermocyaneoviolaceus:cloning, purification, characterization and production of xylooligosaccharides.jmicrobiolbiotechnol,2006,16(1): [12]MilerGL.Useofdinitrosalicylicacidreagentfordetermination ofreducingsugar.analchem,1959,31(5): [13] 纪丽萍, 吴丹, 吴敬等. 重组大肠杆菌产 γ 环糊精葡萄糖基转移酶的摇瓶发酵优化. 中国生物工程杂志,2011,31(10): JiLP,WuD,WuJ,etal.Optimizationoffermentationin ShakeFlasksforrecombinantγ CGTaseexpresioninE.coli. ChinaBiotechnology,2011,31(10): [14] 张芙华. 重组枯草芽孢杆菌生产角质酶发酵条件优化. 无锡 : 江南大学, 生物工程学院,2008. ZhangFH.Fermentationoptimizationforcutinaseproductionwith a recombinantbacilussubtilis. Wuxi: Jiangnan University, SchoolofBiotechnology,2008. OptimizationofFermentationinShakeFlasksforthe XylanaseinRecombinantE.coli HEJie 1,2 SULing qia 1,2 WUJing 1,2 (1StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi ,China) (2SchoolofBiotechnologyandKeyLaboratoryofIndustrialBiotechnologyMinistryofEducation,JiangnanUniversity,Wuxi ,China) Abstract Inordertoachievehighproductionofthexylanase,theoptimizationofculturemedium was investigatedine.colibl21(de3)harboringtheplasmidpet20b(+)/coe/xyna.theoptimizedmedium and inductionconditionwereasfolows:11g/lglycerol,24g/lyeastextract,8g/lpeptone,89mmol/lpo 3 4,4 mmol/lmg 2+,inducedby0.4mmol/LIPTG at6hofculture.underthiscondition,theenzymeactivity increasedfrom346.8u/mlto780.2u/ml,whichwas2.2timesashighasthatwhenitwasnotoptimized. Keywords Streptomycessp. FA1 Xylanase RecombinantE.coli Optimization

纪丽萍等重组大肠杆菌产 - 环糊精葡萄糖基转移酶的摇瓶发酵优化! 氨苄青霉素 / 的培养基中 6 7 / 过夜培养将过夜培养的细菌按!4 的接种量接入含氨苄青霉素 / 的发酵培养基中 6 7 / 培养定时取样离心发酵液收集上清水解活性的测定碘液法测定 ; 9 的水解活性取样品对照

纪丽萍等重组大肠杆菌产 - 环糊精葡萄糖基转移酶的摇瓶发酵优化! 氨苄青霉素 / 的培养基中 6 7 / 过夜培养将过夜培养的细菌按!4 的接种量接入含氨苄青霉素 / 的发酵培养基中 6 7 / 培养定时取样离心发酵液收集上清水解活性的测定碘液法测定 ; 9 的水解活性取样品对照中国生物工程杂志!!" 重组大肠杆菌产环糊精葡萄糖基转移酶的摇瓶发酵优化纪丽萍吴丹吴敬陈坚江南大学食品科学与技术国家重点实验室无锡, 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡, 摘要为了实现来源于碱性芽孢杆菌 ", 的 - 环糊精葡萄糖基转移酶的高效胞外表达对./01 信号肽介导的 0 2 - 基因工程菌进行发酵培养基及发酵条件的优化并进行正交试验获得最优培养基