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产品资料 29-0344-97 AA Capto adhere ImpRes Capto adhere ImpRes 是一种用于单克隆抗体 (MAb) 和其他生物分子的高分辨率精细纯化的 BioProcess 层析介质 ( 树脂 ) 强阴离子交换复合模式配基与传统的离子交换剂相比显示出高选择性, 这为解决纯化中的挑战提供了方法在 MAb 工艺中的主要杂质如 DNA 宿主细胞蛋白 (HCP)

1 产品资料 AA Capto adhere ImpRes Capto adhere ImpRes 是一种用于单克隆抗体 (MAb) 和其他生物分子的高分辨率精细纯化的 BioProcess 层析介质 ( 树脂 ) 强阴离子交换复合模式配基与传统的离子交换剂相比显示出高选择性, 这为解决纯化中的挑战提供了方法在 MAb 工艺中的主要杂质如 DNA 宿主细胞蛋白 (HCP) 脱落 Protein A 聚体和病毒被有效地分离 Capto adhere ImpRes 是一种处理高聚体含量 MAb 项目纯化的极好选择由这种层析介质具有病毒去除作用, 也可以使利用 Capto adhere ImpRes 进行的两步 MAb 纯化工艺最后的精细纯化步骤 ( 图 1) 可以使用结合和洗脱 ( 结合 ) 或流穿模式 ( 非结合 ) 进行精细纯化细胞培养 protein A 捕获步骤病毒灭活与过滤复合模式层析 Capto adhere ImpRes 精细纯化步骤 : 去除病毒聚体 HCP 和脱落的 protein A Capto adhere ImpRes 的主要特点和优点 : 通过高分辨率颗粒和配基的选择性实现高产量在 MAb 工艺中聚体病毒和主要杂质的有效去除能够应用 MAb 平台工艺开发中可以分离 MAb 变异体用于 MAb 平台工艺的精细纯化介质 MAb 的相对均一性使它们非常适合在平台技术中使用, 它们是应用于一类分子的单元操作条件和方法平台方法在工艺开发中节省时间和金钱 GE Healthcare Life Sciences 的 MAb 生产工具箱采用 protein A 层析介质如 MabSelect SuRe 或 MabSelect SuRe LX 用于目标的捕获病毒过滤和制剂图 1. Capto adhere ImpRes 是一种精细纯化介质, 用于高效去除杂质, 如 DNA HCP 脱落 protein A 聚体和病毒 Capto adhere ImpRes 扩展了 GE Healthcare 的 MAb 纯化工具箱这种介质设计用于两步或三步纯化方法中捕获的步骤后使用此外,Capto adhere ImpRes 能够以 B/E 或 FT 模式工作, 以提供良好的 MAb 产量和纯度在 B/E 模式中, 高分辨率用于洗脱期间单体抗体与杂质的精细分离在 FT 模式中,MAb 直接穿过层析柱, 而杂质被结合

2 Capto adhere ImpRes 的特性优化用于高分辨率精细纯化的颗粒 Capto adhere ImpRes 是基于已确定的高流速琼脂糖骨架, 它具有出色的压力 / 流速性质 Capto adhere ImpRes 的刚性骨架可以在 MAb 精细纯化过程使用高流速与使用更大颗粒 (75 μm) 的相关复合模式阴离子交换剂 Capto adhere 相比, 小的颗粒大小 (~ 40 μm) 在精细纯化中有更高的分辨率复合模式配基 Capto adhere ImpRes 的复合模式阴离子交换配基被固定在骨架上 ( 图 2), 并与目标分子通过复合类型的相互作用力相互作用通常涉及离子相互作用, 但其他相互作用力如氢键和疏水作用也可能是明显的这些单个相互作用力的强度取决于工艺条件表 1. Capto adhere ImpRes 的特性骨架高流速琼脂糖配基复合模式强阴离子交换平均颗粒大小 μm (d 50v ) 1 结合能力 /ml 层 mg MAb/mL( 保留时间析介质 4-5 分钟,pH~ 8) 离子容量 mmol Cl-/mL 介质 ph 稳定性工作范围在位清洗 [CIP] 压力 / 流速特性小于 300 kpa 在 220 cm/h, 1 m 直径层析柱,20 cm 床高度条件下储存条件 4 到 30, 在 20% 乙醇中, 0.2 M 乙酸钠化学稳定性所有常用的水相缓冲溶液,1 M 乙酸,1 M NaOH, 2 M NaCl, 5% 1- 丙醇, 30% 异丙醇, 70% 乙醇避免使用氧化剂, 阴离子去污剂 1 d 50v 是累积体积分布的中位颗粒大小 2 ph 区间, 其中介质可以在功能没有明显改变下进行操作 3 ph 区间, 其中介质可以经过在位清洗而不明显改变功能有效的聚体去除以 B/E 或 FT 模式进行杂质如聚体 HCP 和脱落 protein A 的去除图 2. Capto adhere ImpRes 配基显示出与目标分子相互作用的复合功能最明显的是离子相互作用 (A) 疏水作用 (B) 和氢键 (C) 这种层析介质设计用于精细纯化, 它是基于具有小颗粒的高流速琼脂糖骨架, 提供良好的压力 - 流速特性和高分辨率与相关的复合模式阴离子交换层析介质 Capto adhere 相比, 由 Capto adhere ImpRes 具有高分辨率和高动态载量更高的上样密度小的洗脱体积和更高的杂质去除效率工艺的经济性的提高是通过 : 更高的产量更少的缓冲液消耗和更小的层析柱和缓冲液罐的使用结合 / 洗脱模式高抗体滴度通常能够增加细胞培养原料中聚体和其他杂质如 HCP 的量设计用于精细纯化的具有离子交换或复合模式性质的层析介质需要提供有效的杂质去除, 同时保持高产量使用 Capto adhere ImpRes 以 B/E 模式进行阶段洗脱实验, 用于从 protein A 亲和层析部分纯化的 MAb 中去除杂质, 结果如表 2 所示来自精细纯化步骤的组分被收集合并和分析产量聚体 protein A 和 HCP 含量表 1 总结了 Capto adhere ImpRes 的特性 AA

3 聚体含量 (%) 表 2. 使用 Capto adhere ImpRes 以 B/E 模式对 MAb 进行精细纯化的结果 ; 上样量 80 mg/ml 保留时间 ( 分钟 ) 洗脱收集体积 (CV) 单体产量 (%) 聚体含量 (%) HCP (log 10 reduction) Protein A (ppm) 起始收集低于检测限低于检测限 1 LOQ = 检测限 1 结果显示在阶段洗脱精细纯化中使用 Capto adhere ImpRes 获得低洗脱体积, 同时维持高产量利用 Capto adhere ImpRes 以 B/E 模式进行的聚体脱落 protein A 和 HCP 的去除被证明是有效的与 2 分钟保留时间相比,4 分钟的更长的保留时间提高聚体的去除然而, 用 2 分钟保留时间运行并因此缩短床高度可以缩短运行时间和获得更高的生产力流穿模式对于 Capto adhere ImpRes 以 FT 模式进行层析柱实验, 其中组分在上样期间通过凝胶过滤进行分析图 3 显示了在整个测试的保留时间范围内强大的聚体去除根据这个实验可以得出结论,80 mg/ml 的上样量是合适的 Capto adhere ImpRes 在不同保留时间以 FT 模式用于聚体和其他杂质去除的效率与 Capto adhere 进行比较流穿组分被收集并分析产量聚体含量 HCP 含量和脱落 protein A 含量两种介质都显示出有效的 MAb 纯化然而, 以 FT 模式运行的 Capto adhere ImpRes 产生更高的产量和更低的收集体积, 两者具有相似的纯度 ( 表 3) Capto adhere ImpRes 可以使用 2 分钟的更短的保留时间 ( 更高的流速 ), 尽管这导致略微小的聚体清除差异层析柱 : Tricorn 5/50, 床高度 5 cm, 柱体积 ~ 1 ml 介质 : Capto adhere ImpRes 样品 : MAb 样品, 使用 MabSelect SuRe 收集样品纯化上样量 : 80 mg/ml 层析介质起始缓冲液 :: 100 mm 乙酸盐,335 mm NaCl, ph 5.5 再生缓冲液 : 100 mm 乙酸盐,pH 3.0 保留时间 : 分钟系统 : ÄKTAexplorer 系统检测 : 在上样期间在 A 280 nm 检测的含有蛋白质组分通过凝胶过滤进行分析上样量 (mg/ml) 图 3. 使用 Capto adhere ImpRes 时聚体浓度作为上样量和保留时间 (RT) 的函数表 3. 使用 Capto adhere ImpRes 和 Capto adhere 以 FT 模式进行 MAb 精细纯化的结果 ; 上样量 80 mg/ml 保留时间 ( 分洗脱收集体聚体含量 (%) 层析介质钟 ) 积 (CV) 单体产量 (%) 起始收集 Capto adhere ImpRes Capto adhere ImpRes Capto adhere AA 3

4 病毒清除以两种病毒模型测试 Capto adhere ImpRes 从 MAb 清除病毒的能力 ; 包膜 RNA 逆转录病毒, 小鼠白血病病毒 (MuLV) 和非包膜 DNA 细小病毒, 小鼠细小病毒 (MVM) 通过 protein A 亲和层析纯化的收集 MAb 样品加入标准化病毒储液, 然后以 B/E 或 FT 模式上样到 Capto adhere ImpRes 通过收集滴定和大体积铺板分析进行洗脱组分的病毒滴度 Capto adhere ImpRes 显示出以 B/E 或 FT 模式有效的病毒清除 ( 表 4) 对于 MuLV 和 MVM, 在 B/E 模式中 log 10 病毒减少系数大约为 5.0 在 FT 模式中 log 10 病毒减少系数 > 4.0 层析柱 : Tricorn 5/50, 床高度 5 cm, 柱体积 ~ 1 ml 介质 : Capto adhere ImpRes 样品 : MAb 样品 (9.4 mg/ml), 由 protein A 亲和层析纯化后的样品上样量 : 图 4A,20 到 35 mg/ml 层析介质 ( 相当于在 10% 流穿时 45% 到 80% 的 DBC) 图 4B,45% 的 DBC 起始缓冲液 : 35 mm Tris, ph 8.0 洗脱缓冲液 : 20 mm Tris, 20 mm 柠檬酸盐, 20 mm 磷酸盐, 100 mm NaCl, ph 4.0 梯度洗脱 : 在 20 到 30 个柱体积内从 0% 到 100% 保留时间 : 在图 4A 中为 4 分钟 ; 在图 4B 中为 1 或 4 分钟系统 : ÄKTAexplorer 10 系统表 4. 使用 Capto adhere ImpRes 以 B/E 和 FT 模式纯化的小鼠白血病病毒 (MuLV) 和小鼠细小病毒 (MVM) 的病毒减少系数 (log 10 ) log 10 最小病毒减少系数工艺纯化模式 MuLV MVM B/E FT 2 > B/E 结合条件 :B/E 模式磷酸盐 / 柠檬酸盐,pH7.9( 结合 ); 磷酸盐 / 柠檬酸盐 + 45 mm NaCl, ph 5.4( 洗脱 ) 2 FT 结合条件 : 磷酸盐 / 柠檬酸盐,pH 5.5,19 ms/cm 电导率强大的上样和结合能力为了评估 Capto adhere ImpRes 的上样量和保留时间对聚体去除能力的影响, 以 B/E 模式进行研究在 1 分钟或 4 分钟保留时间时, 上样量在 45% 和 80% 的动态结合能力 (DBC) 之间变化组分被收集, 并通过分析型凝胶过滤分析聚体浓度单体的累积产量对累积的聚体作图结果显示 MAb 单体和聚体的相等和强大的分离, 因为它与上样量 ( 图 4A) 和保留时间 ( 图 4B) 无关累积单体产量 (%) 累积单体产量 (%) 累积聚体 (%) 累积聚体 (%) 上样 45% 的 DBC 上样 70% 的 DBC 上样 80% 的 DBC 图 4. 在 Capto adhere ImpRes 上的精细纯化中, 在 (A) 不同上样量和 (B)1 或 4 分钟保留时间 (RT) 的 MAb 单体的累积产量 (%) 对累积 MAb 聚体图 AA

5 收集的物质 (mg/ml) 洗脱缓冲液 (%) 在保留时间为 2 4 和 8 分钟时, 对于 Capto adhere ImpRes 在 10% 流穿时的 DBC 也与 Capto adhere 进行比较图 5 的结果显示 Capto adhere ImpRes 与 Capto adhere 相比提高了 DBC 层析柱 : Tricorn 5/100, 床高度 ~ 10 cm, 体积 ~ 2 ml 介质 : Capto adhere ImpRes 样品 : MAb 样品, 使用 MabSelect SuRe LX 纯化的后收集上样量 : 30 mg MAb/mL 起始缓冲液 : 35 mm Tris, ph 8.0 洗脱缓冲液 : 20 mm Tris, 20 mm 磷酸盐, 20 mm 柠檬酸盐, ph 4.0 保留时间 : 4 分钟系统 : ÄKTAexplorer 10 保留时间 (min) 图 5. 在 10% 流穿时的动态结合能力作为保留时间的函数 Capto adhere ImpRes 与 Capto adhere 的比较更复合 MAb 电荷变异体的检测 Capto ImpRes 骨架的高分辨率加上配基的选择性可以检测 MAb 的电荷变异体, 并且可以以 B/E 模式把它们去除在 MAb 以 B/E 模式在 Capto adhere ImpRes 上的梯度洗脱中, 含有单体 MAb 的主峰被分为两个峰, 后面一个峰 ( 或峰肩 ) 含有 MAb 聚体 ( 图 6A) 通过分析型阳离子交换层析分析从洗脱峰收集的组分的酸性主峰的和碱性带电异构体, 每种异构体的相对回收率如图 6B 所示在聚体去除的优化期间, 观察到更复合个带电的突变体峰 ( 数据没有显示 ) 随着更复合微调的使用, 因此应该能够解析出比本研究所显示的更复合的电荷变异体工艺经济性 Capto adhere ImpRes 较小的颗粒大小提供比 Capto adhere 更高的分辨率, 而且这影响产量当使用阶段洗脱步骤以 B/E 操作时, 利用 Capto adhere ImpRes 对于不同的 MAb 的产量提高比 Capto adhere 高 3%( 高达 12%)( 表 5) 为了评估更高产量的工艺经济性影响, 使用来自 Biopharm 服务公司的工艺经济模拟工具 BioSolve, 典型的 MAb 工艺被用作模板研究了产量提高的影响, 与 Capto adhere 相比, 使用 Capto adhere ImpRes 提高 3% 产量把生产能力从每年 17.5 kg 提高到 18.5 kg, 把生产成本从 $372/g MAb 降低为 $360/g MAb( 表 6) 体积 (ml) 组分聚体含量主要物质酸性物质碱性物质图 6.(A) 层析图显示 MAb 聚体在 Capto adhere ImpRes 上的梯度洗脱 (B) 主要的酸性碱性电荷变异体在 ph 梯度中的相对回收率 AA 5

6 流速 (cm/h) 表 5. 由三种不同的 MAb 在 Capto adhere 和 Capto adhere ImpRes 上使用阶段洗脱步骤的纯化得到的单体产量单体产量 (%) Capto adhere Capto adhere ImpRes MAb MAb MAb 表 6. 对于 MAb 使用 Capto adhere 的纯化与 Capto adhere ImpRes 相比的工艺经济性 Capto adhere Capto adhere ImpRes 产物滴度 (g/l) 3 3 目标生产能力利用率 (%) 生产生物反应器工作体积 (L) 每年估计的批次数每年生产能力 (kg) 生产成本 ($/g MAb) 操作柱床高度和流速对于一种给定的层析介质在工艺设计中提供的自由度可以被说明为其操作窗口图 7 显示了对于 Capto ImpRes 和 Sepharose High Performance 骨架在柱床高度和操作流速之间的关系两种介质都是由小颗粒 (40 μm 对 34 μm) 组成, 因此都显示出高分辨率, 被用于大规模纯化方案中的中间纯化 / 精细纯化步骤 Sepharose 6 Fast Flow 和 Capto 介质由较大的颗粒组成, 不具有如 Capto MMC ImpRes 所提供的高分辨率在压力限曲线下方的面积大小代表操作窗口, 即, 对于各种介质的有效操作范围如图 7 所示, Capto MMC ImpRes 的操作窗口在柱床高度和流速方面满足更多需要柱床高度 (cm) 图 7. 来自 GE Healthcare 的不同介质的操作窗口 ( 曲线下的面积 ) 数据对应于在 20 和粘度等于水时的工艺直径层析柱灰色等高线提供以分钟为单位的保留时间 AA

7 层析柱 Capto adhere ImpRes 可以与从实验室到生产规模的先进层析设备一起使用由于 Capto adhere ImpRes 更高的硬度, 在中试和生产规模层析柱中的装柱程序与 Sepharose High Performance 介质相比略有不同 ( 有关装填实验室规模的层析柱的详细信息, 请参阅合适的说明书 ) 在中试和生产规模层析柱的装柱程序之间也有差别表 8 列出来自 GE Healthcare 的合适层析柱表 8. 用于装填 Capto adhere ImpRes 的 GE Healthcare 层析柱家族层析柱内径 (mm) 实验室规模 Tricorn 5/100 5 Tricorn 10/ HiScale 16/20 16 HiScale 16/40 16 HiScale 26/20 26 HiScale 26/40 26 HiScale 50/20 50 HiScale 50/40 50 生产规模 AxiChrom 50 to 200 AxiChrom1 300 to 1000 BPG 100 to 300 Chromaflow 400 to 对于 AxiChrom 1000 最大床高度为 20 cm 高通量工艺开发在工艺开发早期阶段使用小规模形式筛选最适合的层析介质和 / 或工艺条件既节省时间又节省样品 Capto adhere ImpRes 可在 96 孔 PreDictor 板中使用, 这通过允许平行筛选层析条件如 ph 和电导率支持高通量工艺开发 (HTPD) 这种介质也可以以 PreDictor RoboColumn 形式使用这些小型化层析柱使用机器人液相处理工作站预装用于 HTPD 的 BioProcess 介质 Capto adhere ImpRes 也可以以小的预装层析柱形式使用, 如 HiTrap (1 ml) 和 HiScreen (4.7 ml) 当开发一种有效和强大的分离方法时, 通过与层析系统如 ÄKTA avant 一起使用,HiTrap 和 HiScreen 层析柱使用十分方便然后通过使用 Tricorn 或 HiScale 层析柱进行进一步开发和优化, 之后可以被直接放大清洗和灭菌在位清洗 (CIP) 是再生后去除残留在层析柱上的杂质的程序, 如脂类核酸和沉淀或变性的蛋白 Capto adhere ImpRes 耐受下列给定浓度的 CIP 试剂 :1 M NaOH 2 M NaCl 5%1- 丙醇 30% 异丙醇 70% 乙醇定期 CIP 防止杂质在介质床积累, 并有助于保持 Capto adhere ImpRes 的结合能力流动性和一般性能在 CIP 前建议酸洗, 例如 0.1 M 醋酸钠,pH 3.0 通常建议在每轮后进行在位清洗对于每个工艺应该根据存在的杂质类型设计特定的 CIP 程序 CIP 的频率取决于原料的性质和条件在 Capto adhere ImpRes 介质寿命研究中, 使用 1 M NaOH 超过 300 轮 CIP 后 DBC 仍保持稳定结果证明了这种介质经过许复合轮纯化后的稳定性, 这有助于整体提高工艺经济性注意在不同的纯化循环之间没有残留物轮数图 8. 经过复合轮 CIP 后介质的动态结合能力寿命研究 AA 7

8 BioProcess 层析介质 Capto adhere ImpRes 是一种 BioProcess 层析介质, 是被生物制药厂商广泛使用的一个纯化介质家族对于这些产品的支持包括经过验证的制造方法安全长期的介质供应安全和简单的处理以及法规支持文件 (RSF), 以协助工艺验证并提交给监管部门 Fast Trak Training & Education 团队为 BioProcess 开发和制造的所有关键部分提供高水平的现场培训订购信息

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