Microsoft Word - 19杨洋.doc

Size: px

Start display at page:

Download "Microsoft Word - 19杨洋.doc"

君佃弘
5 years ago
Views:

1 中国农业科学 2006,39(5): Scientia Agricultura Sinica PCR 检测乳品中金黄色葡萄球菌杨洋 1, 张伟 1, 袁耀武 1 2, 钟晓英, 马雯 1 ( 1 河北农业大学食品科技学院微生物检测研究室保定 ; 2 河北省保定市疾病预防控制中心保定 ) 摘要 : 目的利用 PCR 技术, 无需增菌, 直接检测乳品中的金黄色葡萄球菌方法通过溶剂提取的方法从人工样品中提取模板, 以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因 (nuc) 为靶基因, 经过 PCR 扩增得到 279 bp 的产物经过 DNA 测序证实该产物为目的扩增产物采用 PCR 方法实际检测了乳品中的金黄色葡萄球菌, 同时, 与国标 GB 方法及两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌测试片 Petrifilm RSA.Count Plate 及 Baird-parker+RPF Agar 进行了比较结果 PCR 方法的灵敏度高, 全脂乳和脱脂乳检测的检出限为 10 CFU/ml, 奶酪检测的检出限为 55 CFU/g, 可在 6 h 内完成对乳品中金黄色葡萄球菌的检测, 比目前普遍采用的先增菌再进行 PCR 检测的方法缩短了 12~24 h 与国标方法相比,PCR 方法的符合率为 94.3%, 敏感性为 100% 结论采用溶剂提取制备模板的方法可有效的用于 PCR 直接检测 ( 无需增菌 ) 乳及乳制品中的金黄色葡萄球菌关键词 :PCR; 检测 ; 乳品 ; 金黄色葡萄球菌 Detection of Staphylococcus aureus in Dairy Products by Polymerase Chain Reaction Assay YANG Yang 1, ZHANG Wei 1, YUAN Yao-wu 1, ZHONG Xiao-ying 2, MA Wen 1 ( 1 College of Food Science and Technology, Laboratory for Microorganism Detection Agriculural University of Hebei, Baoding ; 2 Baoding Center for Disease Control and Prevention in Hebei Province, Baoding ) Abstract: Objective A uniplex polymerase chain reaction(pcr) assay was developed for direct detection of Staphylococcus aureus without enrichment in dairy products. Method A solvent extraction procedure was successfully modified for extraction of Staphylococcus aureus DNA from artifically contaminated whole milk, skim milk and cheese. Primer targeting the thermostable nuclease gene (nuc) was used in the uniplex PCR. A DNA fragment of 279 bp was amplified. PCR product was confirmed by DNA sequencing. In this study, the uniplex PCR, GB , Perifilm RSA. Count Plate, and Baird-parker + RPF Agar were compared. Result The detection limit of the uniplex PCR is 10 CFU/ml of whole milk, skim milk and 55 CFU/g cheese. The developed methodology allows detection of Staphylococcus aureus in dairy products in less than 6 h, the time of this developed PCR assay is h less than the time of general PCR assay with enrichment method, and the coincidence rates of PCR is 94.3%, the sensitivity of PCR is 100%. Conclusion The solvent extraction procedure is an effective method for PCR assay of Staphylococcus aureus in milk and milk products. Key words: PCR; Detection; Dairy products; Staphylococcus aureus 0 引言本研究的重要意义金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 是一种普遍存在于自然界中的人兽共患病菌由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒是个世界性卫生问题, 近年来, 由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒越来越多, 据美国疾病控制中心报告, 由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒居第二位, 占整个细菌性食物中毒的 33%, 加拿大则高达 45% 中国每年发生此类中毒事件也非常多金黄色葡萄球收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 河北农业大学科研基金项目 ( ) 作者简介 : 杨洋, 男 (1979-), 河北秦皇岛人, 硕士研究生, 研究方向为有害微生物检测与控制 Tel: ; lanxingpijiu@yahoo.com.cn 通讯作者张伟 (1963-), 男, 河北保定人, 教授, 研究方向为有害微生物检测与控制 Tel: ; zhangwei631126@yahoo.com.cn

2 5 期杨洋等 :PCR 检测乳品中金黄色葡萄球菌 991 菌作为一种重要的食源性致病菌, 它对食品加工业及人们健康存在着潜在的危害由于传统检测方法, 检测时间长, 检测程序繁琐, 因此, 急需建立一种快速 [3] 有效的检测方法前人研究进展 Wilson 等利用 PCR 从脱脂乳中检测出 10 5 CFU/ml 的金黄色葡萄球菌, 但灵敏度 (10 5 CFU/ml) 较低, 分析其原因可能是由于提取的 DNA 中含有 PCR 反应干扰因子 [4] Brakstad 等利用 PCR 扩增金黄色葡萄球菌的 nuc 基因来检测营养肉汤培养基中的金黄色葡萄球菌, 灵敏度达到 10CFU/ml, 但从血样品中提取金黄色葡萄球菌的 DNA 进行扩增时, 其灵敏度降为 10 3 CFU/ml 这可能是从血样品提取的 DNA 中含有 PCR 反应干扰因子所致食品的成分极为复杂, 有些成分干扰 PCR 反应, 可导致 PCR 检测灵敏度的下降其中脂肪成分被认为是降低 PCR 检测灵敏度的主要因素之一 [5] Mclauchlin [6] 等报道从奶酪中提取的 DNA 中含有 PCR 反应干扰因子, 影响 PCR 检测本研究切入点以上研究均不能有效的消除 PCR 反应干扰因子, 制备出高纯度的模板乳及乳制品中的抑制因子主要为脂肪金属离子蛋白质等所以如何有效消除干扰因子, 成为试验的关键 [5] 拟解决的关键问题因而本研究采用溶剂提取的方法来消除脂肪等因素的抑制作用, 制备出高纯度的模板, 以耐热核酸酶的基因 nuc 为靶序 [1, 3, 4, 列 9], 进行 PCR 扩增, 从而达到快速检测 ( 无需增菌 ) 的目的 1 材料与方法 1.1 材料菌种及其来源菌种接种于营养肉汤培养基中,37, 振荡过夜培养至菌悬液浓度达到 10 9 CFU/ml ( 表 1) 表 1 供试菌种及其来源 Table 1 The bacteria used in experiment 编号 No. 菌种 Bacteria 来源 Source 1 表皮葡萄球菌 Staphylococcus epidermids-atcc26069 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 2 木糖葡萄球菌 Staphylococcus xylosus- ATCC29971 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 3 白色葡萄球菌 Staphylococcus albus 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 4 中间葡萄球菌 Staphylococcus intermedius-1109 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 5 大肠杆菌 Escherichia coli-atcc25922 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 6 大肠杆菌 E.coli-ATCC35401 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 7 伤寒杆菌 Salmonella typhimurium-atcc14028 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 8 伤寒杆菌 Salmonella typhimurium 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 9 痢疾志贺氏菌 Shigella dysenteriae 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 10 弗氏志贺氏菌 Shigella flexneri 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 11 鲍氏志贺氏菌 Shigella boydii-atcc9209 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 12 宋内氏志贺氏菌 Shigella sonnei-atcc9290 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 13 甲型溶血性链球菌 Streptococcus hemolytis-α 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 14 乙型溶血性链球菌 Streptococcus hemolytis-β 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 15 单核增生李斯特氏菌 Listeria monocytogenes-atcc35152 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 16 单核增生李斯特氏菌 Listeria monocytogenes-atcc35152 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 17 蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus-atcc11778 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 18 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis-atcc6051 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 19 小肠结肠炎耶尔森氏菌 Yersinia enterocolitica 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 20 副溶血性弧菌 Vibrio parahaemolyticus 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 21 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus-atcc6538 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 22 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus-atcc6538 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 23 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 24 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 25 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 26 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus-atcc25923 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 27 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus-atcc13565 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 28 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus-atcc14458 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 29 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus-atcc8095 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 30 另有 52 株金黄色葡萄球菌 Fifty-two strains of Staphylococcus aureus 本实验室保存 Laboratory for Microorganism Detection Agriculural University of Hebei CGMCC: China General Microbiological Culture Collectio Center; CMCC:China Medical Culture Collection Center

3 992 中国农业科学 39 卷培养基营养肉汤培养基营养琼脂培养基 Baird-Parker 培养基, 购自北京市陆桥技术有限公司 ; Petrifilm RSA. Count Plate 购自美国 3M 公司 ; Baird-parker+RPF Agar 购自法国梅里埃公司乳制品全脂乳脱脂乳和奶酪均购自当地超市仪器及试剂 10 PCR buffer dntps TaKaRa Taq DNA Marker DL2000, 购自大连宝生物工程公司 ; 引物 ( 正向引物, 反向引物 ) 由大连宝生物工程公司合成 ; 溶葡萄球菌酶购自上海高科技术有限公司 ; 无水乙醇石油醚氯仿氨水糖原均为国产分析纯产品 PCR 仪为 Whatman T Gradient 基因扩增仪, 电泳仪为北京市六一厂生产 DXY-33A 型电泳仪, 凝胶成像系统为华粤企业集团有限公司 UVIpro 凝胶成像系统 1.2 方法乳制品人工污染在人工污染金黄色葡萄球菌前, 全脂乳脱脂乳和奶酪均按国标法检测证实不含有金黄色葡萄球菌 (1) 将金黄色葡萄球菌人工污染到全脂乳和脱脂乳中, 使样品中金黄色葡萄球菌的浓度依次为 CFU/ml, 直接提取人工污染脱脂乳和全脂乳中金黄色葡萄球菌的 DNA (2) 奶酪人工污染金黄色葡萄球菌的方法为 : 取 20 g 奶酪在研钵中磨碎, 加入 40 2% 柠檬酸钠 90 ml 混匀制成均质液, 然后对奶酪均质液人工污染的浓度依次为 CFU/ml, 直接提取奶酪均质液中金黄色葡萄球菌的 DNA [10] DNA 提取步骤如下 :(1) 将 1 ml 无水乙醇 1 ml 氨水和 1 ml 石油醚分别加入到 5 ml 人工污染金黄色葡萄球菌的全脂乳脱脂乳和奶酪均质液中, 混匀 (2) 混合物以 g, 离心 10 min 弃去上清液, 沉淀用 300 µl 10 mmol L -1 TE(pH 7.8) 溶解后, 加入 5 µl 10 mg ml -1 溶葡萄球菌酶,37 温育 1 h, 期间不断剧烈振荡然后加入 50 µl 10% 的 SDS, 煮沸 5 min (3) 将等体积的氯仿加入上述混合液中, 充分振荡混匀, g 离心 10 min, 弃沉淀, 保留上清液 (4) 将上清液移入一新的离心管中, 用 0.1 倍体积 2.5 mol L -1 乙酸铵 (ph 5.4),2.5 倍体积预冷无水乙醇和 5 µl 10 mg ml -1 糖原沉淀 DNA, 混合物 g, 离心 20 min DNA 沉淀干燥后用 100 µl 灭菌双蒸水溶解, 备用 PCR 引物序列引自文献 [1, 4], 由大连宝生物公司合成正向引物 :5 -GCGATTGATGGTG ATACGGTT-3, 目的扩增产物大小为 279 bp; 反向引物 :5 -AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3 PCR 反应体系 : 总反应体系 50 µl 包括 5 µl 10 PCR buffer,4 µl dntps 混合物,0.5 µl 40 µmol 正向引物,0.5 µl 40 µmol 反向引物,0.25 µl(5 U µl -1 ) Taq, 模板 2 µl, 水 µl PCR 扩增程序 :PCR 反应采用冷启动 94 预变性 4 min, 再按 94 1 min min min 进行 35 个循环, 最后 72 延伸 3.5 min 电泳检测: 取 5 µl PCR 产物在 2% 琼脂糖凝胶上进行电泳, 利用凝胶成像系统观察结果并成像 PCR 产物鉴定 : 大连宝生物工程公司对 PCR 扩增产物进行 DNA 测序 PCR 方法与其它快速检测金黄色葡萄球菌方法比较 (1) 本研究利用 PCR 直接检测乳品中金黄色葡萄球菌方法与两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌的培养基及 GB 方法进行比较, 确定 PCR 直接检测乳品中金黄色葡萄球菌方法的特异性符合率灵敏度 (2) 所采用的两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌的培养基分别为 :Petrifilm RSA.Count Plate 是由美国 3M 公司生产的薄膜型快速检测金黄色葡萄葡萄球菌的计数平板 ;Baird-parker+RPF Agar 是由法国梅里埃公司研制生产的 Baird-parker 琼脂加兔血浆纤维蛋白原的金黄色葡萄球菌检测计数平板这两种快速检测培养基的接种方法均按生产商所提供的使用说明进行操作共检测乳品 35 件, 其中鲜牛奶 20 件 UHT 灭菌乳 5 件奶粉 5 件奶酪 5 件将 4 种检测方法作对比, 确定 PCR 直接检测乳品中金黄色葡萄球菌方法的符合率敏感性计算公式分别为 : 敏感性 = 真阳性数 /( 真阳性数 + 假阴性数 ) 符合率 =( 真阳性数 + 真阴性数 )/ 被检总数 2 结果与分析 2.1 引物特异性从所有供试菌株中提取 DNA 进行 PCR 扩增检测引物特异性 ( 图 1) 由图 1 可知, 只有金黄色葡萄球菌才可特异扩增出靶基因, 其余菌种均未扩增出任何产物因此该引物特异性强, 可用于 PCR 检测金黄色葡萄球菌

5 期杨洋等 :PCR 检测乳品中金黄色葡萄球菌 993 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

阴性对照 ; 11. 金黄色葡萄球菌 ; 12. 阳性对照 ; 13. DNA Marker 2000; 14. 弗氏志贺氏菌 ; 15. 鲍氏志贺氏菌 ; 16. 宋内氏志贺氏菌 ; 17. 甲型溶血性链球菌 ; 18. 乙型溶血性链球菌 ; 19. 单核增生李斯特氏菌 ; 20. 单核增生李斯特氏菌 ; 21. 蜡样芽孢杆菌 ; 22. 枯草芽孢杆菌 ; 23.

阴性对照 ; 11. 阳性对照 ; 12. Marker DL 2000; 13~23. 为金黄色葡萄球菌 A: 1. Staphylococcus epidermids;2. Staphylococcus xylosus;3. Staphylococcus albus;4. Staphylococcus intermedius;5. Escherichia coli;6.

Shigella flexneri;15. Shigella boydii;16. Shigella sonnei;17. Streptococcus hemolytic-α;18. Streptococcus hemolytis-β;19. Listeria monocytogenes;20. Listeria monocytogenes;21. Bacillus cereus; 22.

4 5 期杨洋等 :PCR 检测乳品中金黄色葡萄球菌 A B C D A:1. 表皮葡萄球菌 ; 2. 木糖葡萄球菌 ; 3. 白色葡萄球菌 ; 4. 中间葡萄球菌 ; 5. 大肠杆菌 ; 6. 大肠杆菌 ; 7. 伤寒杆菌 ; 8. 伤寒杆菌 ; 9. 痢疾志贺氏菌 ; 10. 阴性对照 ; 11. 金黄色葡萄球菌 ; 12. 阳性对照 ; 13. DNA Marker 2000; 14. 弗氏志贺氏菌 ; 15. 鲍氏志贺氏菌 ; 16. 宋内氏志贺氏菌 ; 17. 甲型溶血性链球菌 ; 18. 乙型溶血性链球菌 ; 19. 单核增生李斯特氏菌 ; 20. 单核增生李斯特氏菌 ; 21. 蜡样芽孢杆菌 ; 22. 枯草芽孢杆菌 ; 23. 小肠结肠炎耶尔森氏菌 ; 24. 副溶血性弧菌. B:1. Marker DL 2000;2~21. 金黄色葡萄球菌 ;22. 阴性对照 ;23. 阳性对照 ;24. Marker DL C:1. Marker DL 2000 ;2~ 21. 金黄色葡萄球菌 ;22. 阴性对照 ;23. 阳性对照 ;24. Marker DL D:1~9. 为金黄色葡萄球菌 ;10. 阴性对照 ; 11. 阳性对照 ; 12. Marker DL 2000; 13~23. 为金黄色葡萄球菌 A: 1. Staphylococcus epidermids;2. Staphylococcus xylosus;3. Staphylococcus albus;4. Staphylococcus intermedius;5. Escherichia coli;6. Escherichia coli; 7. Salmonella typhimurium;8. Salmonella typhimurium;9. Shigella dysenteriae;10. Negative control;11. Staphylococcus aureus;12. Positive control ; 13. Marker DL 2000;14. Shigella flexneri;15. Shigella boydii;16. Shigella sonnei;17. Streptococcus hemolytic-α;18. Streptococcus hemolytis-β;19. Listeria monocytogenes;20. Listeria monocytogenes;21. Bacillus cereus; 22. Bacillus subtilis;23. Yersinia enterocolitica;24. Vibrio parahaemolyticus. B: 1. Marker DL 2000; Staphylococcus aureus; 22. Negative control; 23. Positive control; 24. Marker DL C: 1. Marker DL 2000; Staphylococcus aureus; 22. Negative control;23. Positive control;24. Marker DL D: 1-9.Staphylococcus aureus; 10. Negative control; 11. Positive control; 12. Marker DL 2000; Staphylococcus aureus 图 1 金黄色葡萄球菌和非金黄色葡萄球菌 PCR 反应结果 Fig. 1 The detection result of Staphylococcus aureus and non-staphylococcus aureus by PCR 2.2 PCR 检测乳品中人工污染的金黄色葡萄球菌由图 2 可知, 除了含 10 0 CFU/ml 金黄色葡萄球菌的全脂乳脱脂乳奶酪均质液样品外, 其它人工污染的样品 ( 含 10 1 ~10 8 CFU/ml 金黄色葡萄球菌 ) 均成功检测出了金黄色葡萄球菌由于奶酪中脂肪含量比较高, 采用本方法虽可移除大部分的抑制因子, 但可能仍有少量抑制因子存在, 影响了 PCR 扩增, 所以图 2-C 的电泳带不甚清晰由表 2 可知, 全脂乳和脱脂乳的检出限为 10 CFU/ml, 奶酪均质液的检出限为 10 CFU/ml 因为本试验将 20 g 奶酪经研磨后与 90 ml 的 2% 柠檬酸钠溶液混合成 110 ml 的奶酪均质液, 进行人工污染, 然后进行 PCR 检测因此, 经换算奶酪中金黄色葡萄球菌的检出限为 55 CFU/g(10 CFU/ml 110 ml/20 g) 表 2 人工污染后乳及乳制品中 PCR 检测金黄色葡萄球菌的检出限 Table 2 The lower detection limit of Staphylococcus aureus in dairy products after artificially contaminated by PCR 样品 Samples 菌的浓度 Concentration (CFU/ml) 全脂乳 Whole milk 脱脂乳 Skim milk 奶酪均质液 Cheese 表示 PCR 检测结果阳性 ;- 表示 PCR 检测结果阴性 + The detectionresult of PCR was positive; - The detectionresult of PCR was negative

994 中国农业科学 39 卷 A 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 B 21 20 19 18 17 16 15 14 13 3 2 1 279 bp 279 bp 30 29 28 27 26 25 24 23 22 3 2 1 C 279 bp 1. Marker DL2 000;2. 阳性对照 ;3. 阴性对照 ;4~12.

Negative control;the concentration of Staphylococcus aureus from lane 4 to lane 12 is 10 8 CFU/ml to 10 0 CFU/ml respectively;the concentration of Staphylococcus aureus from lane 13 to lane 21 is 10

2 The detected result of Staphylococcus aureus by PCR in artifically contaminated whole milk (A), skim milk (B) and cheese (C) 2.

5 994 中国农业科学 39 卷 A B bp 279 bp C 279 bp 1. Marker DL2 000;2. 阳性对照 ;3. 阴性对照 ;4~12. 为金黄色葡萄球菌浓度分别为 10 8 ~10 0 CFU/ml 的全脂乳 PCR 检测结果 ;13~21. 金黄色葡萄球菌浓度分别为 10 8 ~10 0 CFU/ml 的脱脂乳 PCR;22~30. 金黄色葡萄球菌浓度分别为 10 8 ~10 0 CFU/g 的奶酪 PCR 检测结果 1. Marker DL2000;2. Positive control;3. Negative control;the concentration of Staphylococcus aureus from lane 4 to lane 12 is 10 8 CFU/ml to 10 0 CFU/ml respectively;the concentration of Staphylococcus aureus from lane 13 to lane 21 is 10 8 CFU/ml to 10 0 CFU/ml respectively;the concentration of Staphylococcus aureus from lane 22 to lane 30 is 10 8 CFU/g to 10 0 CFU/g respectively 图 2 人工污染的全脂乳 (A) 脱脂乳(B) 奶酪均质液(C) 中金黄色葡萄球菌 PCR 检测结果 Fig. 2 The detected result of Staphylococcus aureus by PCR in artifically contaminated whole milk (A), skim milk (B) and cheese (C) 2.3 PCR 产物鉴定大连宝生物工程公司对 PCR 扩增产物进行 DNA 测序通过序列测定可知,PCR 扩增产物 DNA 序列 [11] 与文献报道的靶基因序列的同源性达 99.6%, 从而证实 PCR 扩增产物确为目的扩增产物 ( 数据略 ) 2.4 PCR 方法与其它检测金黄色葡萄球菌方法比较为了验证本检测方法对实际乳品检测的效果, 本研究检测了从超市购买的 UHT 灭菌乳奶粉奶酪和鲜牛奶等样品, 共计 35 件该检测方法同时与 GB 方法及两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌测试片比较检测结果 ( 表 3) 表明,PCR 方法的敏感性为 100%, 符合率为 94.3%;Petrfilm RSA. Count Plate 方法的敏感性为 100%, 符合率为 97.1%; Baird-parker+RPF Agar 方法的敏感性为 100%, 符合率为 97.1% PCR 方法与 Petrfilm RSA. Count Plate 方法和 Baird-parker+RPF Agar 方法的敏感性相同, 检出率均高于这两种方法, 但符合率略低于这两种方法, 分析其原因可能是因为 PCR 方法灵敏度高, 且有时不能区分样品中的死菌与活菌所致表 3 PCR 方法敏感性特异性符合率 Table 3 The sensitivity, specificity, and coincidence rates of PCR 样品 Samples 总数 Total PCR Petrfilm RSA. Count Plate Baird-Parker + RPF Agar 国标法 Cultivation method 鲜牛奶 Milk UHT 乳 UHT milk 奶粉 Powdered milk 奶酪 Cheese 合计 Total 检出率 Detection rate (% ) 敏感性 Sensitivity (%) 符合率 Accordance rate (%)

6 5 期杨洋等 :PCR 检测乳品中金黄色葡萄球菌 995 Petrfilm RSA. Count plate 及 Baird-parker+RPF Agar 都在样品接种后 28~30 h 观察结果, 不必再做证实试验, 而 Baird-parker Agar 检测, 须在接种后 48 h 观察平板, 并挑取可疑菌落转到营养肉汤中, 再经 18~24 h 后做血浆凝固酶或耐热 DNA 酶试验进行证实, 前后须 80 h 美国 3M 公司生产的 Petrifilm RSA. Count Plate 培养基和法国梅利埃公司生产的 Baird-Parker +RPF Agar 培养基检测乳品中的金黄色葡萄球菌, 与国标检测方法相比, 时间可缩短一半, 但检测时间仍然较长而 PCR 方法从对样品的处理到检测结束约需 6 h, 大大缩短了检测时间, 该方法对于检测乳及乳制品中金黄色葡萄球菌是一种快速有效的方法该方法省略了样品前增菌的过程, 比目前采用的先增菌再进行 PCR 检测的方法, 检测时间可缩短 12~24 h 更加符合快速检测的要求 3 讨论食品的成分极为复杂, 有些成分为 PCR 反应抑制因子, 可导致 PCR 检测灵敏度的下降食品中的脂肪成分被认为是降低 PCR 检测灵敏度的主要因素之一 [5] [3] Wilson 等利用 PCR 从脱脂乳中检测出 10 5 CFU/ml 的金黄色葡萄球菌, 灵敏度较低, 可能是由于提取的 DNA 中含有 PCR 反应抑制因子或是 PCR [6] 反应条件没有优化到最佳所致 Mclauchlin 等报道从奶酪中提取的 DNA 中含有 PCR 反应抑制因子, 影 [7] 响 PCR 检测 Lantzetal 等利用多重 PCR 技术检测猪肉样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌, 该方法对样品进行增菌后, 使检测灵敏度达到 10 2 CFU/ml Jinneman [8] 等利用多重 PCR 扩增技术检测原料奶牛肉等样品中 E coli O 157 :H 7 的 DNA, 也是利用增菌来提高检测的灵敏度虽然增菌提高了检测灵敏度, 但也延长了检测时间, 一般可延长 12~24 h 本研究无需增菌, 直接从污染金黄色葡萄球菌的乳品中提取 DNA, 利用 PCR 技术对金黄色葡萄球菌的 nuc 基因进行扩增来检测该菌该方法可直接从人工污染的全脂奶脱脂奶和奶酪中检测出金黄色葡萄球菌, 全脂奶检出限为 10 CFU/ml 脱脂奶检出限亦为 10 CFU/ml 奶酪的最低检出限 55 CFU/g, 整个检测过程可在 6 h 内完成, 比目前普遍采用的先增菌再进行 PCR 检测的方法缩短了 12~24 h 其检测灵敏度远高于导致食物中毒所需的金黄色葡萄球菌数 [12] 该方法对于检测乳及乳制品中金黄色葡萄球菌是一种快速有效的方法而且还可以用来监测 HACCP 的危害分析关键控制点, 以监控在牛奶的收集过程以及产品加工后金黄色葡萄球菌的污染情况但在对实际样品检测中还无法区分样品中的死菌与活菌, 且需要专门的仪器设备和专业人员操作此外在推广 PCR 方法时还应尽量完善 PCR 检测方法的标准, 便于其推广使用 4 结论 4.1 本研究采用的 DNA 提取方法先用溶剂除去脂肪等抑制因子, 然后用溶菌酶和裂解细胞, 采用醋酸铵冷乙醇和糖原沉淀核酸, 可高效地从乳制品中提取金黄色葡萄球菌的 DNA 4.2 本研究利用 PCR 技术可直接检测乳制品中的金黄色葡萄球菌, 灵敏度高, 全脂乳和脱脂乳检测的检出限为 10 CFU/ml, 奶酪检测的检出限为 55 CFU/g, 可在 6 h 内完成对乳品中金黄色葡萄球菌的检测, 比目前普遍采用的先增菌再进行 PCR 检测的方法缩短了 12~24 h 4.3 本研究建立的 PCR 检测方法与国标方法相比, 敏感性为 100%, 符合率为 94.3% References [1] Kim C H, Khan M, Morin D E, Hurley W L, Tripathy D N, Kehrli M J, Oluoch A O, Kakoma I. Optimization of the PCR for detection of Staphylococcus aureus nuc gene in bovine milk. Journal of Dairy Science, 2001, 84: [2] Drake M, Small C L, Spence K D, Swanson B G. Rapid detection and identification of Lactobacillus spp. in dairy products by using the polymerase chain reaction. Journal of Food Protection, 1996, 59: [3] Wilson I G, Cooper J E, Gilmour A. Detection of enterotoxigeic Staphylococcus aureus in dried skimmed milk: use of the polymerase chain reaction for amplification and detection of staphlococcal enterotoxin genes entb and entc1 and the thermonuclease gene nuc. Applied and Environmental Microbiology, 1991, 57: [4] Brakstad O G, Aasbakk K, Maeland J A. Detection of Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction amplification of the nuc gene. Journal of Clinical Microbiology, 1992, 30: [5] Wilson I G. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63: [6] Mclauchlin J, Narayanan G L, Mithani V, O Neill G. The detection of enterotoxins and toxic shock syndrome toxin genes in Staphylococcus aureus by Polymerase chain reaction. Journal of Food Protection,

7 996 中国农业科学 39 卷 2000, 63: [7] Lantz P G, Knutsson R, Blixt Y, Al-Soud W A, Borch E, Rådström P. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica in enrichment media and pork by a multiplex PCR: a study of sample preparation and PCR-inhibitory components. International Journal of Food Microbiology, 1998, 45: [8] Jinneman K C, Trost P A, Hill W E, Weagant S D, Bryant J L, Kaysner C A, Wekell M M. Comparison of template preparation methods from foods for amplification of Escherichia coli O 157 shiga-like toxins type I and II DNA by multiplex polymerase chain reaction. Journal of Food Protection, 1995, 58: of different approaches to quantify Staphylococcus aureus cells by real-time quantitative PCR and application of this technique for examination of cheese. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67: [10] Herman L M F,de Block J H G E, Moermans R J B. Direct detection of Listeria monocytogenes in 25 milliliters of raw milk by a two-step PCR with nested primers. Applied and Environmental Microbiology, 1995, 61: [11] Brakstad O G. Thermostable nuclease and the nuc gene in the diagnosis of staphylococcus aureus infections. University of Trondheim Press, 1995: [9] Hein I, Lehner A, Rieck P, Klein K, Brandl E, Wagner M. Comparison ( 责任编辑曲来娥 )

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析