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1 微生物学通报 Microbiology China 研究快报 MAR 20, 2011, 38(3): by Institute of Microbiology, CAS 改良环介导等温扩增技术快速检测肉类中的大肠杆菌 O157: H7 * 刘道亮胡连霞赵占民孙晓霞张峻峰 ( 河北出入境检验检疫局河北石家庄 ) 摘要 : 针对大肠杆菌 O157: H7 (Escherichia coli O157: H7, E. coli O157: H7) 传统检测方法检测周期长的问题, 建立了肉类中的 E. coli O157: H7 的改良环介导等温扩增 (LAMP) 快速检测方法以 E. coli O157: H7 的 O157 特异性抗原 rfbe 基因鞭毛 H7 特异性抗原 flic 基因序列作为靶序列, 分别设计 2 套增加了环引物的改良 LAMP 引物序列, 单管同时检测, 通过肉眼观察白色沉淀, 判断检测结果采用 36 株细菌验证了该改良 LAMP 引物的特异性热裂解法提取的 DNA 经改良 LAMP 体系扩增 20 min, 检测 E. coli O157: H7 的灵敏度为 1.4 CFU/mL, 人工污染肉中的 E. coli O157: H7 检出限为 1.8 CFU/g 137 份实样中, 检测出 1 份 E. coli O157: H7 假阳性, 与行业标准 SNT 符合率达到 99.3% 关键词 : 环介导等温扩增, LAMP, 检测, 大肠杆菌 O157: H7, 肉类 Rapid detection of Escherichia Coli O157: H7 in meat using an improved loop-mediated isothermal amplification technology LIU Dao-Liang HU Lian-Xia * ZHAO Zhan-Min SUN Xiao-Xia ZHANG Jun-Feng (Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shijiazhuang, Hebei , China) Abstract: The detection period of Escherichia coli O157: H7 (E. coli O157: H7) using traditional testing methods is relatively long. Therefore a kind of rapid detection method, namely a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology with two loop primers detection E. coli O157: H7 in meat, was developed to address this problem. Two sets LAMP primers with loop primers were respectively designed based on the target sequences of rfbe and flic genes of E. coli O157: H7. The detection results were judged by observing the white precipitate at simultaneous detection of single-tube. The specificity of the improved LAMP was verified using 36 strains of bacteria. DNA extracted by pyrolysis was amplified 20 min by the LAMP system. The detecting sensitivity of E. coli O157: H7 was 1.4 CFU/mL. * 通讯作者 :Tel: ; Fax: ; : hulianxia168@tom.com 收稿日期 : ; 接受日期 :

2 刘道亮等 : 改良环介导等温扩增技术快速检测肉类中的大肠杆菌 O157: H7 431 The detection limit of E. coli O157: H7 from artificial contamination meat was 1.8 CFU/g. One false positive of 137 meat samples was detected, which can obtain compliance rate of 99.3% with the industry standard SNT Keywords: Loop-mediated isothermal amplification, LAMP, Detection, Escherichia coli O157: H7, Meat 大肠杆菌 O157: H7 (Escherichia coli O157: H7) 是一类能引起严重食物中毒的致泻性大肠杆菌, 是出血性大肠杆菌的主要血清型 [1], 感染剂量极低, 在食入不足 5 个细菌就可引起疾病 [2] 它除了引起腹泻出血性肠炎外, 还可发生溶血性尿毒综合症 (Hemo-lyticuremic syndrome, HUS) 血栓性血小板减少性紫癜 (Thrombocytopenic purpura, TTP) 等严重的并发症 [3], 且后者病情发展快, 死亡率高, 给人民健康和社会造成严重危害, 自 1982 年美国首次被报告后, 在世界范围内得到普遍关注 [4] 国内外检测 E. coli O157: H7 的方法很多, 我国进出口食品对 E. coli O157: H7 目前采用的方法是以行业标准 SNT 作为依据 [5] 通过对样品增菌处理后, 进行平板划线, 然后挑取可疑菌落进行形态染色及血清学试验生化鉴定等进行判定检测过程耗时长达 4 7 d, 难以适应快速检验的要求本研究针对 E. coli O157: H7 的 O157 特异性抗原基因 (rfbe 基因 ) 鞭毛 H7 特异性抗原基因 (flic 基因 ) 设计引物, 单管同时检测, 建立了肉类中的 E. coli O157: H7 改良 LAMP 快速检测方法, 其灵敏度高, 特异性好, 简便, 快速, 解决了传统检测方法耗时长灵敏度低, 血清凝集有交叉反应等问题 [6], 对于及时有效应对食源性突发公共卫生事件具有重大意义现将研究结果报道如下 : 1 材料与方法 1.1 材料主要仪器设备 : 电热恒温水浴锅 DK-98-1 ( 天津市泰斯特仪器有限公司 ) 小型台式离心机 SIGMA1-14 ( 德国西格马公司 ) 恒温培养箱 LRH-150B ( 广东省韶关市鑫腾科普仪器有限公司 ) 凝胶成像系统 MINIBIS Pro ( 以色列 DNI 公司 ) 电泳仪 DYCP-31DN 型 ( 北京市六一厂生产 ) 微量移液器 μl Finnpipette ( 美国 ) 等主要试剂 : BstDNA 聚合酶 dntps 10 loading buffer DNA Marker DL100 溴化乙锭琼脂糖等购自于大连宝生物工程有限公司, LAMP 引物合成于上海英潍捷基 ( 上海 ) 贸易有限公司, mec 肉汤 SMAC 琼脂新生霉素 E. coli O157: H7 生化试剂鉴定套装购自北京陆桥技术有限责任公司, E. coli O157: H7 血清购自兰州生物制品研究所, 营养肉汤培养基, 营养琼脂培养基等购自北京路桥公司菌株 : E. coli O157: H7 标准菌株 (ATCC43889) E. coli O157: H7 (IQCL10102) E. coli O157: H7 (EDL933) E. coli O157: H7 (CMCC44828) 大肠艾希氏菌 (E. coli CGMCC 11229) 沙门氏菌(Salmonella CMCC47005 CMCC50047 CMCC50083 CMCC50104) 阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii ATCC29544 ATCC51007 ATCC51024) 鲍氏志贺氏菌 (Shigella boydii CMCC51149) 痢疾志贺氏菌 (Shigella dysenteriae CMCC51054) 福氏志贺氏菌 (Shigella flexneri CMCC51061) 产气荚膜梭菌 (Clostridium perfringens CICC22949) 蜡样芽孢杆菌 (Bacillus cereus ATCC 7064) 绿脓杆菌 (Pseudomonas aeruginosa CMCC10104) 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus CGMCC26003) 单核细胞增生李斯特菌 (L. monocytogenes ATCC7644) ATCC 购自美国菌种保藏中心 ; IQCL 购自中国检验检疫科学研究院 ; EDL 购自中国医学细菌保藏管理中心 ; CMCC 购自中国药检所 ; CGMCC 和 CICC 购自中国工业微生物菌种保藏中心 E. coli O157: H7 6 株其它大肠杆菌血清型 (E. coli O6: K15 E. coli O20: K17 E. coli O 144 : K 90 E. coli O 128 : K 67 E. coli O 125 : K 70 E. coli O 124 : K 72 ) 蜡样芽孢杆菌 (Bacillus cereus) 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 单核细胞增生李斯特菌(L. monocytogenes) 弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter

3 432 微生物学通报 2011, Vol.38, No.3 freundii) 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 副溶血性弧菌 (V. parahaemolyticus) 为本实验室分离保藏样品来源 : 鸡肉猪肉羊肉牛肉购自集贸市场和送检样品 1.2 方法 LAMP 引物的特异性分析 : 各取中 36 株过夜培养菌悬液 1 ml, 直接用热裂解法提取其基因组 DNA 作为模板进行 LAMP 引物的特异性分析 LAMP 检测 E. coli O157: H7 (ATCC43889) 纯培养的灵敏性试验 : E. coli O157: H7 接种于新鲜无菌的营养肉汤培养基中, 37 C 培养 12 h 用生理盐水进行 10 倍系列稀释, 采用稀释平板法, 测定其纯培养物活菌数为 CFU/mL; 同时从每稀释度菌悬液中取 1 ml 直接用热裂解法提取 E. coli O157: H7 基因组 DNA, 进行 LAMP 灵敏度试验人工污染 E. coli O157: H7 (ATCC43889) 检出限的确定 : 用 E. coli O157: H7 对牛肉样品进行人工污染前, 牛肉样品已按 SNT 的常规检验法证实 E. coli O157: H7 阴性取 10 g 牛肉样品于 90 ml 灭菌生理盐水中, 混匀, 人工加入 1 ml E. coli O157: H7 过夜培养菌悬液, 混匀, 用灭菌生理盐水进行 10 倍系列稀释, 采用稀释平板法计数得人工污染的牛肉样品混合液中 E. coli O157: H7 活菌数为 CFU/g 同时从每稀释度混合液中取 1 ml, 直接用热裂解法提取 E. coli O157: H7 基因组 DNA, 进行 LAMP 检测, 确定检出限 DNA 模板的制备 [7] : 取样液 1 ml, r/min 离心 1 min, 弃上清, 加入 100 μl 灭菌去离子水悬浮沉淀, 重复操作一次, 100 C, min, 冷却至室温, r/min 离心 1 min, 取上清, 4 C 冷藏保存, 备用引物设计 : 针对 E. coli O157: H7, GenBank: S 编码 O157 抗原的 rfbe 基因序列和 GenBank: AF 编码鞭毛 H7 特异性抗原的 flic 基因序列, 运用引物设计软件 ( jp/lamp3.0.0/index.html) 在线进行 LAMP 引物设计引物设计的原则如 notomietal [8] 所述设计的 6 对引物是 : 2 个外引物被描述为上游外引物 (F3) 和下游外引物 (B3) 2 个内引物被描述为上游内引物 (FIP) 和下游内引物 (BIP) 此外, 2 个环引物被描述为上游环引物 (LF) 和下游环引物 (LB) 两套 LAMP 引物的名称和具体序列见表 1 和表 2 表 1 E. coli O157: H7 rfbe 基因 LAMP 引物序列 Table 1 The LAMP primers of E. coli O157: H7 rfbe Primer name Sequence (5 3 ) Forward outer (F3) GATGGTCTCAATTCTAACTAGG Backward outer (B3) GCTCATTCGATAGGCTGG Forward inner primer (FIP) Backward inner primer (BIP) Forward loop primer (LF) Backward loop primer (LB) TAAAAAACTGGCCTTGTTTCACCGCAG AGGAAAGAGAG ACACGATGCCAATGTACTCTAAATTAAT TCCACGCCA GAGTTTATCTGCAAGGTGATTCCT GCACCCTATAGCTGAGGATCTTGGT 表 2 E. coli O157: H7 flic 基因 LAMP 引物序列 Table 2 The LAMP primers of E. coli O157: H7 flic Primer name Sequence (5 3 ) Forward outer (F3) CTGTCTTCTGGCTTGCGTAT Backward outer (B3) GTCCAGGTCAGAATCGGAGT Forward inner primer (FIP) Backward inner primer (BIP) Forward loop primer (LF) Backward loop primer (LB) CCGCCTGAGTCAGGCCTTTAATTAACA GCGCGAAGGATGAC GTTGCGCAGACCACCGAAGGAACCGT CAGTTCACGAA AGAAGTAAAACGGTTAGCAATCGCC CCGAAATCAACAACAACTTACAGCG 改良 LAMP 反应 : 分别优化引物浓度 Mg 2+ Bst DNA 聚合酶 dntps 甜菜碱反应温度反应时间等条件, 建立 E. coli O157:H7 LAMP 检测 25 μl 反应体系为 : 内引物 (FIP 和 BIP) 各 1.6 μmol/l, 外引物 (F3 和 B3) 各 0.2 μmol/l, 环引物 (LF 和 LB) 各 0.8 μmol/l, 2.5 mmol/l dntps, 1.6 mol/l 甜菜碱 (Sigma, St. Louis, Mo.), 4 mmol/l MgSO 4, 10 Bst DNA 聚合酶反应缓冲液 (New England Biolabs, MA) [20 mmol/l Tris-HCl (ph 8.8), 10 mmol/l KCl, 10 mmol/l (NH 4 ) 2 SO 4, 2 mmol/l MgSO 4, 0.1% Triton X-100], 8 U 的 Bst DNA 聚合酶 (New England Biolabs, Beverly, MA), 3 μl DNA 模板和用灭菌双蒸水补足体系 LAMP 反应过程是首先在 63 C 水浴

刘道亮等 : 改良环介导等温扩增技术快速检测肉类中的大肠杆菌 O157: H7 433 锅中反应 20 min, 然后将其放入 80 C 水浴锅中, 水浴 10 min 终止反应, 通过肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀此外, 取扩增产物 5 μl, 与 1 μl

coli O157: H7 改良 LAMP 反应 rfbe 基因是合成 O157 菌体抗原的特异酶基因, flic 基因是 H7 鞭毛特异性抗原基因, 即 LAMP 检测 rfbe 基因和 flic 基因, 同时为阳性, 才判定结果为阳性

1 The visual results of the improved LAMP reaction Note: 1: Positive result of rfbe; 2: Positive result of flic; 3: Negative

2 The electrophoretic analysis of the improved LAMP reaction Note: M: 100 bp DNA ladder marker; 1: Positive result of rfbe; 2:

coli O157: H7 及 12 种 30 株食源性肠道细菌进行检测, 除 E.

coli O157: H7 有很好的特异性菌株 Strain Table 3 表 3 改良 LAMP 引物的特异性 The specificity of the improved LAMP primers 数量 LAMP 检测结果 LAMP test

coli (CGMCC11229 O6: K15 O20: K17 O144: K90 O128: K67 O125: K70 O124: K72) 7 Salmonella (CMCC47005 CMCC50047 CMCC50083 CMCC50104)

4 刘道亮等 : 改良环介导等温扩增技术快速检测肉类中的大肠杆菌 O157: H7 433 锅中反应 20 min, 然后将其放入 80 C 水浴锅中, 水浴 10 min 终止反应, 通过肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀此外, 取扩增产物 5 μl, 与 1 μl 的 Loading buffer 混合均匀, 进行 1.5% 琼脂糖凝胶电泳, 观察梯形条带, 以证实是否发生了 LAMP 反应 2 结果与分析 2.1 E. coli O157: H7 改良 LAMP 反应 rfbe 基因是合成 O157 菌体抗原的特异酶基因, flic 基因是 H7 鞭毛特异性抗原基因, 即 LAMP 检测 rfbe 基因和 flic 基因, 同时为阳性, 才判定结果为阳性目的基因被扩增的同时伴随白色焦磷酸镁沉淀产生, 扩增 20 min 的可视结果如图 1 所示目的基因被扩增生成大小不一的 DNA 片段混合物, 其电泳呈现典型的梯形条带, 如图 2 所示图 1 改良 LAMP 反应的可视结果 Fig. 1 The visual results of the improved LAMP reaction Note: 1: Positive result of rfbe; 2: Positive result of flic; 3: Negative control of rfbe; 4: Negative control of flic. 图 2 改良 LAMP 反应的电泳分析 Fig. 2 The electrophoretic analysis of the improved LAMP reaction Note: M: 100 bp DNA ladder marker; 1: Positive result of rfbe; 2: Positive result of flic; 3: Negative control of rfbe; 4: Negative control of flic. 2.2 改良 LAMP 引物的特异性采用改良 LAMP 方法对 6 株不同来源 E. coli O157: H7 及 12 种 30 株食源性肠道细菌进行检测, 除 E. coli O157: H7 菌株扩增 20 min 两管都产生肉眼可见的白色沉淀为阳性外, 其他细菌检测均未产生肉眼可见的白色沉淀, 均为阴性统计结果如表 3 所示, 表明本实验建立的改良 LAMP 检测方法对 E. coli O157: H7 有很好的特异性菌株 Strain Table 3 表 3 改良 LAMP 引物的特异性 The specificity of the improved LAMP primers 数量 LAMP 检测结果 LAMP test results Quantity rfbe flic 结果判定 Results determined E. coli O157: H7 (IQCL10102 CMCC44828 EDL933) E. coli (CGMCC11229 O6: K15 O20: K17 O144: K90 O128: K67 O125: K70 O124: K72) 7 Salmonella (CMCC47005 CMCC50047 CMCC50083 CMCC50104) 4 Enterobacter sakazakii (ATCC29544 ATCC51007 ATCC51024) 3 Shigella (CMCC51061 CMCC51054 CMCC51149) 3 Clostridium perfringens (CICC22949) 1 Bacillus cereus (ATCC7064) 1 Pseudomonas aeruginosa (CMCC10104) 1 Staphylococcus aureus (CGMCC26003) 1 L. monocytogenes (ATCC7644) 1 Citrobacter freundii 1 Bacillus subtilis 1 V. parahaemolyticus 1 注 : +: 阳性结果 ; : 阴性结果. Note: +: Positive result; : Negative result.

5 434 微生物学通报 2011, Vol.38, No LAMP 检测的敏感性改良 LAMP 检测 E. coli O157: H7 纯培养物的灵敏度 : E. coli O157: H7 菌悬液, 采用稀释平板法, 计数测得原菌液活菌数为 CFU /ml, 在稀释到 10 9 倍 ( ) 时 LAMP 扩增 20 min, rfbe 基因仍出现沉淀, 电泳仍有梯形条带而 flic 基因已无沉淀出现, 电泳也无梯形条带 ; 而稀释到倍 ( ) 时 rfbe 基因 flic 基因均未出现沉淀, 电泳也均无梯形条带即检测 E. coli O157: H7 的灵敏度达到 1.4 CFU /ml, 琼脂糖凝胶电泳如图 3 所示图 3 改良 LAMP 检测 E. coli O157: H7 的灵敏度 Fig. 3 The sensitivity of the improved LAMP for detection of E. coli O157: H7 Note: M: 100 bp DNA ladder marker; 3, 5, 7, 9: , 1.4, , CFU/mL of E. coli O157: H7 for detection rfbe, respectively; 4, 6, 8, 10: , 1.4, , CFU/mL of E. coli O157: H7 for detection flic, respectively; 1: Positive result of rfbe; 11: Negative control of rfbe; 2: Positive result of flic; 12: Negative control of flic 人工污染样品的检出限 : E. coli O157: H7 (ATCC43889) 人工污染样品后, 采用稀释平板法, 计数测得人工污染样品的 E. coli O157: H7 活菌数为 CFU /g 在稀释到 10 7 倍 ( ) 时 LAMP 扩增 20 min, rfbe 基因仍出现沉淀, 电泳仍有梯形条带而 flic 基因已无沉淀出现, 电泳也无梯形条带 ; 而稀释到 10 8 倍 ( ) 时, rfbe 基因和 flic 基因均未出现沉淀, 电泳也均无梯形条带即改良 LAMP 检测人工污染肉中 E. coli O157: H7 的检出限是 1.8 CFU/g, 琼脂糖凝胶电泳如图 4 所示图 4 改良 LAMP 检测肉类中 E. coli O157: H7 的检出限 Fig. 4 The detection limit of improved LAMP for detection of E. coli O157: H7 in meat Note: M: 100 bp DNA ladder marker; 3, 5, 7: 1.8, , CFU/g of E. coli O157: H7 in meat for detection rfbe, respectively; 4, 6, 8: 1.8, , CFU/g per reaction, respectively; 1: Positive result of rfbe; 9: Negative control of rfbe; 2: Positive result of flic; 10: Negative control of flic. 2.4 肉类样品检测肉类样品共 137 份, 分别为鸡肉 25 份, 猪肉 31 份, 羊肉 36 份, 牛肉 45 份对实际样品同时进行改良 LAMP 检测和依据 SNT 进行常规检测, 检出一份样品 E. coli O157: H7 假阳性, 结果证明, 两种方法符合率达到 99.3% 3 讨论环介导的等温扩增技术 (Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP) 是一种新的核酸等温扩增技术 [9] 其原理是针对目的片段上的 6 个位点设计 4 条引物, 在 BstDNA 聚合酶的作用下, 将目的片段在等温条件下 (60 C 65 C) 进行扩增, 通过浊度仪或者肉眼直接观察扩增过程中有无白色焦磷酸镁沉淀产生 [10], 来判定有无扩增发生增加环引物的环介导等温扩增方法, 使反应速度可提高 1/2 1/3 [11], 缩短检测时间 E. coli O157: H7 主要靶基因有 stx1 stx2 eaea rfbe hly uida flic 等 [12 14] 对于血清型较复杂的 E. coli O157: H7, 检测单一靶基因容易出现假阳性, 特异性差, 具有一定的局限性由于外环境中存在大量菌体抗原 O157 和鞭毛抗原非 H7 的大肠埃希菌 [15], 而且这些菌株的致病性与 H7 血清型菌株有

6 刘道亮等 : 改良环介导等温扩增技术快速检测肉类中的大肠杆菌 O157: H7 435 很大差别, 因此, 本研究选用 E. coli O157: H7 的 O157 所独有的抗原特异性基因 rfbe 与 H7 鞭毛抗原基因 flic, 分别设计选择出合理的 LAMP 引物序列, 两基因单管检测同时进行, 直接报告 E. coli [16] O157: H7 血清型, 比文献报道的实时 PCR 的灵敏 [17] 性高 1 个数量级, 与日本 Yukiko 等对 E. coli O157: H7 的 Vero 毒素进行 LAMP 检测的报道相一致, 而且加入环引物后扩增时间从 60 min 缩至 20 min 因此, 本研究建立的 E. coli O157: H7 改良 LAMP 快速检测技术, 将为重大食源性疾病的诊断治疗和流行病学调查提供强有力的技术手段, 具有较强的实际应用价值和良好的应用前景参考文献 [1] Griffin PM, Tauxe RV. The epidemiology of infections caused by Escherichia Coli O157: H7, other enterohemorrhagic E. coli, and the associated hemolytec uremic syndrome[j]. Epidemiologic Rev, 1991, 13(1): [2] Paton AW, Paton JC. Detection and characterization of shiga toxigenic Escherichia coli by using multiplex PCR assays for stx1, stx2, eaea, enterohemorrhagic E. coli hlya, rfb O111 and rfb O157 [J]. J Clin Microbiol, 1998, 36(2): [3] Caprioli J, Peng L, Remuzzi G. The hemolytic uremic syndromes[j]. Curt Opin Crit Care, 2005, 11(5): [4] Reilly A. Prevention and control of enteroheamorrhagie Escherichia coli (EHEC) infections: memorandum from a WHO meeting. WHO Consultation on Prevention and Control of Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) Infections[J]. Bull World Health Organ, 1998, 76(3): [5] 中华人民共和国上海出入境检验检疫局. SN/T , 进出口肉及肉制品中肠出血性大肠杆菌 O157: H7 检验方法 [S]. 北京 : 中华人民共和国出入境检验检疫局, [6] Kehl SC. Escherichia coli O157: H7 Diarrhea in the United States: Clinical and Epidemiologic Features[J]. J Clin Microbiol, 2002, 40(8): [7] 杨洋, 张伟, 袁耀武, 等. 用于 PCR 检测的乳品中金黄色葡萄球菌 DNA 提取方法比较研究 [J]. 食品与发酵工业, 2005, 31(9): [8] Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Rev, 2000, 28(12): e63. [9] Eiken Chemical Co., Ltd. The principles of LAMP method[eb/ol]. html [10] Mori Y, Nagamine K, Tomita N, et al. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 289(1): [11] Nagamine K, Hase T, Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular Cell Probes, 2002, 16(3): [12] 朱文冠, 薛素强, 洪洁心, 等. 多重 PCR 方法检测大肠杆菌 O157:H7 的初步研究 [J]. 中国人兽共患病学报, 2006, 22(5): [13] 吴家林, 肖勇, 凌霞, 等. 肠出血性大肠杆菌 O157:H7 多重 PCR 快速检测研究 [J]. 现代预防医学, 2009, 36(1): [14] Fortin NY, Mulchandani A, Chen W. Use of real-time polymerase chain reaction and molecular beacons for the detection of Escherichia coli O157:H7[J]. Anal Biochem, 2001, 289(2): [15] 朱文冠, 杨德胜, 郭霄峰. 大肠杆菌 O157:H7 rfbe 基因和 flic 基因的克隆与序列分析 [J]. 中国动物检疫, 2005, 22(9): [16] 张建华, 陆群英, 程苏云, 等. 实时 PCR 在大肠杆菌 O157: H7 快速检测中的应用 [J]. 中国人兽共患病学报, 2007, 23(8): [17] Hara-Kudo Y, Nemoto J, Ohtsuka K, et al. Sensitive and rapid detection of Vero toxin-producing Escherichia coli using loop-mediated isothermal amplification[j]. Journal of Medical Microbiology, 2007, 56(3):

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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