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录历喻
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1 4, Vol.3, No. 食品科学安全检测实时荧光环介导等温扩增技术检测牛乳中的蜡样芽孢杆菌贾雅菁, 付博宇, 王羽, 马晓燕, 张先舟, 苑宁, 张伟, * (. 河北农业大学食品科技学院, 河北保定 ;. 河北农业大学理工学院, 河北沧州 ) 摘要 : 建立牛乳中蜡样芽孢杆菌便捷可靠的检测方法, 根据已公布的蜡样芽孢杆菌 hbla 基因序列设计内外引物, 并向反应体系中加入荧光染料 SYBRGreen Ⅰ, 利用实时荧光监测仪, 建立实时荧光环介导等温扩增技术 (real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification,realamp) 检测蜡样芽孢杆菌的方法, 扩增产物经电泳和酶切鉴定通过株致病菌验证 RealAmp 特异性, 并比较了 RealAmp 与普通环介导等温扩增技术的敏感性, 对人工污染的检出限进行了测定结果表明对株致病菌进行特异性实验,4 株蜡样芽胞杆菌呈阳性结果, 株非蜡样芽胞杆菌均呈阴性结果 RealAmp 检测纯菌的灵敏度为. CFU/mL, 比普通环介导等温扩增技术的灵敏度高倍, 人工污染牛乳 RealAmp 的检出限为. CFU/mL 并且在 min 左右即可判定结果该方法快速准确灵敏度高操作便捷可实时监控检测蜡样芽孢杆菌, 有望成为快速检测蜡样芽孢杆菌的有效方法关键词 : 实时荧光环介导等温扩增检测技术 ; 蜡样芽胞杆菌 ; 检测 ; 牛乳 Detection of Bacillus cereus in Milk by Real-Time Fluorescence Loop-Mediated Isothermal Amplification Method JIA Yajing, FU Boyu, WANG Yu, MA Xiaoyan, ZHANG Xianzhou, YUAN Ning, ZHANG Wei, * (. College of Food Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding, China;. College of Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Cangzhou, China) Abstract: This study aimed to establish a real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification assay to detect Bacillus cereus. Based on the published Bacillus cereus hbla gene sequence, primers were designed, and the intercalating dye SYBR-Green I was added to the reaction system, which allowed the reaction products to be measured by ESE-Quant Tube Scanner. The products were identified by restriction digestion followed by electrophoresis. The performance of the assay was evaluated with respect to specificity and sensitivity in comparison with the ordinary LAMP, and the limit of detection (LOD) for artificially contaminated milk was tested. Among strains tested, four Bacillus cereus strains were identified, the other strains were negative. The sensitivity for Bacillus cereus was. CFU/mL in pure cultures, which was times more sensitive than the ordinary LAMP. The LOD for artificially contaminated milk was. CFU/mL. The result could be obtained in minutes. This method has high specificity and sensitivity and is less time-consuming, requiring only simple equipment and allowing real-time monitoring. It is expected to be applied as an effective method for rapid detection of B. cereus. Key words: real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification (RealAmp); Bacillus cereus; detection; milk DOI:./spkx-3-33 中图分类号 :TS.4 文献标志码 :A 文章编号 :-3()-4- 引文格式 : 贾雅菁, 付博宇, 王羽, 等. 实时荧光环介导等温扩增技术检测牛乳中的蜡样芽孢杆菌 [J]. 食品科学,, 3(): 4-9. DOI:./spkx JIA Yajing, FU Boyu, WANG Yu, et al. Detection of Bacillus cereus in milk by real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification method[j]. Food Science,, 3(): 4-9. (in Chinese with English abstract) DOI:./ spkx 收稿日期 :--9 基金项目 : 河北省自然科学基金项目 (C) 作者简介 : 贾雅菁 (99 ), 女, 硕士研究生, 研究方向为食品安全 439@qq.com * 通信作者 : 张伟 (93 ), 男, 教授, 学士, 研究方向为食品病原菌检测技术 zhangwei3@3.com

2 安全检测食品科学, Vol.3, No. 蜡样芽孢杆菌 (Bacillus cereus) 是革兰氏阳性兼性厌氧菌, 产芽孢, 生存范围广, 一些菌株具有致病性 [-] 食品受其污染的几率很高, 特别是蛋白质和碳水化合物含量丰富的食品, 人们一旦摄入被致病性蜡样芽孢杆菌污染的食品容易引发食物中毒 [3] 在我国由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒在细菌性中毒中排前 4 位 [4] [] Notomi 等研发的环介导等温扩增技术 (loopmediated isothermal amplification,lamp) 针对靶基因的个区域设计 4 种特异引物, 利用具有链置换活性的 DNA 聚合酶, 在恒温条件下几十分钟内完成靶基因的高效扩增, 该法在微生物检测领域有广泛的应用前景 [-] LAMP 反应产物的检测可以通过肉眼观察法观察是否有白色焦磷酸镁沉淀, 该法直观操作便捷, 但是结果的准确性受观察者自身影响比较大, 当产物的浓度低时, 肉眼观察易产生误差 [9] ; 也可采用电泳法观察是否有梯形条带产生, 但是该方法不仅需要繁琐的电泳步骤, 而且吸取产物时需要打开反应管, 从而增加了检测过程中被污染的几率 ; 由于缺乏适当的基础设施和昂贵的价格, 利用先进的设备, 如实时浊度检测仪检测 LAMP 产物是在许多检测机构中是不可行的 [] [] Lucchi 等成功用 RealAmp 技术建立疟原虫基因的 [] 检测方法 Yamazaki 等运用 RealAmp 技术成功检测了副溶血弧菌本研究尝试利用 LAMP 反应原理与反应产物与荧光染料结合发出荧光的特点 [3], 在反应体系中加入荧光染料 SYBRGreen Ⅰ, 随着反应产物的增加与其结合的荧光染料也越来越多, 荧光信号强度也随之增加, 通过实时荧光监测仪对荧光强度的搜集, 实现实时定性检测, 建立实时荧光环介导等温扩增技术 (realtime fluorescence loop-mediated isothermal amplification, RealAmp) 检测蜡样芽孢杆菌的方法材料与方法. 材料.. 菌种本实验所用的株菌种见表所示其中 9 株来自中国医学细菌保藏管理中心, 株来自中国工业微生物菌种保藏管理中心,3 株蜡样芽孢杆菌和 3 株 ATCC 菌株实验室分离保存表实验用菌种 Table Bacterial strains used in this experiment 序号菌株名称拉丁文编号蜡样芽孢杆菌菌 Bacillus cereus CMCC33 蜡样芽孢杆菌菌 Bacillus cereus 实验室保存 3 蜡样芽孢杆菌菌 Bacillus cereus 实验室保存 4 蜡样芽孢杆菌菌 Bacillus cereus 实验室保存甲型副伤寒沙门氏菌 Salmonella schottmuelleri CMCC 乙型副伤寒沙门氏菌 Salmonella paratyphi b CICC49 鼠伤寒沙门氏菌 Salmonella typhimurium CMCC 肠炎沙门氏菌 Salmonella enteritis CMCC4 9 宋内氏志贺氏菌 Shigella sonnei CMCC334 痢疾志贺氏菌 Shigella dysenteriae CMCC3 鲍氏志贺氏菌 Shigella boydii CMCC 单核增生性李斯特氏菌 Listeria monocytogenes CMCC4 3 绵羊李斯特氏菌 Listeria ivanovii CICC3 4 小肠结肠炎耶尔森氏菌 Yeysinia enterocolitica CICC9 肺炎克雷伯氏菌 Klebsiella pneumoniae CICC9 阪崎肠杆菌 Enterobacter sakazakii ATCC4 变形杆菌 Proteusbacillus vulgaris CMCC49 出血性大肠埃希氏菌 Escherichia coli O:H CICC3 9 产气荚膜梭菌 Clostridium perfringens ATCC34 副溶血性弧菌 Vibrio parahaemolyticus ATCC 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus CICC.. 试剂 MgSO 4 dntps 北京全式金公司 ;Van9I 内切酶及 DNAMarker( bp) 大连宝生物公司 ; TheromoPol Reaction Buffer DNA 聚合酶 (Bst DNA polymerase large fragment) New England Biolab 公司 ; LAMP 引物北京华大基因研究中心合成 ;SYBRGreenⅠ 荧光染料北京天恩泽公司..3 仪器与设备实时荧光监测仪德国 ESE Gmbh 公司 ;DYY- C 型电泳仪北京市六一仪器厂 ;UVIpro 凝胶成像系统英国 UVItec 公司 ;Whatman T Gradient PCR 扩增仪德国 Biometra 公司 ;QYC- 全温培养摇床上海新苗医疗器械制造有限公司 ;TGL-G 离心机上海安亭科学仪器厂 ;DHAB 型电热恒温培养箱天津市泰斯特仪器有限公司 ; 数显超级恒温水浴锅金坛市杰瑞尔电器有限公司. 方法.. 引物设计引物是 RealAmp 反应体系中不可缺少的一种反应物质, 而引物设计的好坏又与 RealAmp 反应的特异性和扩增效率有着直接的关系 [4-] 在 GenBank 上选取蜡样芽孢杆菌溶血素 hbla 基因序列, 在线设计 ( primerexplorer.jp/elamp4../index.html) 引物包括外引物 (F3 和 B3) 和内引物 (FIP 和 BIP) 引物信息见表

3 , Vol.3, No. 食品科学安全检测表 Table RealAmp 引物 RealAmp primers 引物名称位置 3 位置序列 ( 3 ) F3 GGGTTTAATGTAATGAAGGGTG B3 94 TTAATAGCATCATCAAGCGC FIP BIP AGGCTCTAACTTACCTAAGTTGTCT- GGTCTACCAATAATTGGCGG TTAGCAGAATTACGTCAGACCGT- TACTATAAGCAACTCCAACTACAC F 3 GGTCTACCAATAATTGGCGG Fc AGGCTCTAACTTACCTAAGTTGTCT B 3 4 TACTATAAGCAACTCCAACTACAC Bc TTAGCAGAATTACGTCAGACCGT.. 细菌 DNA 模板的制备采用热裂解法将保存的蜡样芽孢杆菌菌种接种于营养肉汤, 置于 3 r/min 的摇床培养 h 取菌液. ml r/min 离心 min 弃上清液用 μl 灭菌水洗涤沉淀次, 之后加 μl 灭菌水充分悬浮菌体, 放入沸水浴中 min 后取出离心 r/min, min 取上清液即为所提 DNA, 保存温度 -..3 RealAmp 反应体系 µmol/l 的 F3 与 B3 各. μl, µmol/l BIP 与 FIP 各. μl, mmol/l MgSO 4. μl,. mmol/l dntps 3 µl, TheromoPol Reaction Buffer. μl,bstdna 聚合酶 ( U/mL)l. μl,dna 模板 μl, 荧光染料. μl, 无菌双蒸水补足体积到 μl 扩增反应条件: 3 min..4 产物电泳验证取 RealAmp 扩增产物 μl, 与 μl 的 loading buffer 混合均匀, 进行 % 琼脂糖凝胶电泳, 观察梯形条带, 证实是否发生了反应.. 产物的酶切验证 μl RealAmp 扩增产物, μl 内切酶 Van9I, μl K Buffer 混合, 无菌双蒸水补至 μl, 在 3 水浴锅中酶切 h 用.% 的琼脂糖凝胶进行电泳, 观察并分析结果.. RealAmp 的特异性验证用.. 节所示的菌种热裂解法提取细菌 DNA 后, 按照..3 节中的反应条件进行 RealAmp 反应, 验证该检测方法的特异性.. RealAmp 反应的灵敏度实验取新鲜的无菌营养肉汤接种蜡样芽孢杆菌标准菌株,3 培养过夜并计数, 用灭菌的生理盐水对菌液进行倍系列的梯度稀释, 用热裂解法提取每个稀释度菌液的模板 DNA, 按照..3 节中的反应条件进行 RealAmp 反应.. 普通 LAMP 灵敏度实验 µmol/l 的 F3 与 B3 各. μl, µmol/l BIP 与 FIP 各. μl, mmol/l MgSO 4. μl,. mmol/l dntps 3 µl, TheromoPol Reaction Buffer. μl,bstdna 聚合酶 ( U/mL)l. μl,dna 模板 μl, 灭菌双蒸水补足体积到 μl 扩增反应条件:3 反应 min, 终止反应, min 然后将扩增产物在 % 琼脂糖凝胶上电泳..9 人工污染牛乳在人工污染前, 按照国标法检测证实样品不含蜡样芽孢杆菌取 ml 样品加入 ml 无菌生理盐水中充分振荡摇匀, 然后对混合液污染不同浓度的蜡样芽孢杆菌, 依次为. ~. - CFU /ml 从每个稀释度样品中取 ml 分别加入 l ml 无水乙醇 l ml 氨水和 l ml 石油醚, 混匀, r/min 离心 min 除上清液, 剩余的沉淀分别用 ml mmol/l TE (ph.) 溶解再用热裂解法提取基因组 DNA, 进行 RealAmp 实验结果与分析. RealAmp 检测蜡样芽孢杆菌方法的建立 /mv 4 4 Fig /min. 试验管 ;. 阳性对照 ;3. 阴性对照图蜡样芽孢杆菌 RealAmp 检测结果 Detection of Bacillus cereus by RealAmp 如图所示, 随着反应的进行, 试验管与阳性管荧光强度缓慢增加, 当反应进行至 min 时, 试验管与阳性管的荧光强度开始大幅增加, 荧光曲线斜率增加, 反应至 4 min 时, 荧光信号增加强度逐渐变缓, 直至反应结束, 仪器判定为阳性, 说明发生了扩增反应阴性对照管荧光曲线一直处于相对平滑的状态, 直到反应终止没有曲线斜率的变化, 仪器判定为阴性, 说明没有发生扩增反应. 产物的电泳结果分析如图所示, 泳道都有梯形条带产生说明试验管阳性对照发生了扩增反应,3 泳道没有条带说明没有发生扩增反应检测结果与 RealAmp 检测结果一致

, Vol.3, No. 食品科学安全检测 M 3 㤻 ܝ ᔎᑺ/mV C 4 3 bp bp bp bp bp 3 4 3 4 ᯊ䯈/min A.蜡样芽孢杆菌菌 CMCC 33.蜡样芽孢杆菌菌实验室保存 3.甲型副伤寒沙门氏菌 CMCC 4.乙型副伤寒 M. bp Marker.试验管.阳性对照 3.阴性对照图 Fig..3 沙门氏菌 CICC49.鼠伤寒沙门氏菌 CMCC.

小肠结 RealAmp反应虽然过程比较复杂但是产物是按照肠炎耶尔森氏菌 CICC9.肺炎克雷伯氏菌 CICC9 一定的方式生成的通过酶切反应产物将不同片段大.阴性对照 C.蜡样芽孢杆菌菌实验室保存.阪崎肠杆菌小的反应产物的大小单一化进而可以确定扩增是否准确 [-] 本实验选取Van9I内切酶主要产生 bp和 ATCC4 3.普通变形杆菌 CMCC49 4.

4 M Speciﬁcity of RealAmp 如图4所示 4 株蜡样芽孢杆菌有明显的扩增峰出现其他株细菌检测均未产生扩增峰表明本实验建立的方法特异性强 bp bp. bp 敏度比较 M. bp DNA Marker.酶切后的产物 RealAmp检测方法的特异性 34 3 4 䰤/min.培养浓度分别为.. 4. 3. 㦗 ݹ ᕪᓖ/mV.

4 , Vol.3, No. 食品科学安全检测 M 3 㤻 ܝ ᔎᑺ/mV C 4 3 bp bp bp bp bp ᯊ䯈/min A.蜡样芽孢杆菌菌 CMCC 33.蜡样芽孢杆菌菌实验室保存 3.甲型副伤寒沙门氏菌 CMCC 4.乙型副伤寒 M. bp Marker.试验管.阳性对照 3.阴性对照图 Fig..3 沙门氏菌 CICC49.鼠伤寒沙门氏菌 CMCC.肠产物电泳结果炎沙门氏菌 CMCC4.宋内氏志贺氏菌 CMCC 334 Agarose gel electrophoresis of ampliﬁcation products.阴性对照 B.蜡样芽孢杆菌菌实验室保存.痢疾志贺氏菌 CMCC3 3.鲍氏志贺氏菌 CMCC 4.单核细胞增生李产物的酶切结果分析斯特氏菌CMCC4.绵羊李斯特氏菌 CICC3.小肠结 RealAmp反应虽然过程比较复杂但是产物是按照肠炎耶尔森氏菌 CICC9.肺炎克雷伯氏菌 CICC9 一定的方式生成的通过酶切反应产物将不同片段大.阴性对照 C.蜡样芽孢杆菌菌实验室保存.阪崎肠杆菌小的反应产物的大小单一化进而可以确定扩增是否准确 [-] 本实验选取Van9I内切酶主要产生 bp和 ATCC4 3.普通变形杆菌 CMCC49 4.出血性大肠埃希氏菌 CICC3.产气荚膜梭菌 ATCC34.副溶血性弧菌 ATCC.金黄色葡萄球菌 CICC 阴性对照 bp的dna片段酶切结果如图3所示片段大小与理图4 论值相符 RealAmp反应的特异性检测结果 Fig.4 M Speciﬁcity of RealAmp 如图4所示 4 株蜡样芽孢杆菌有明显的扩增峰出现其他株细菌检测均未产生扩增峰表明本实验建立的方法特异性强 bp bp. bp 敏度比较 M. bp DNA Marker.酶切后的产物 RealAmp检测方法的特异性䰤/min.培养浓度分别为㦗 ݹ ᕪᓖ/mV.4 酶切分析结果 Electrophoresis of fragments produced by restriction enzyme digestion A 㤻 ܝ ᔎᑺ/mV Fig 㦗 ݹ ᕪᓖ/mV bp bp bp bp 图3 RealAmp与普通LAMP检测蜡样芽孢杆菌方法的灵 B CFU/mL.阴性对照图 RealAmp反应的灵敏度检测结果 Fig 䰤/min Sensitivity of RealAmp M bp bp bp ᯊ䯈/min bp bp M. bp DNA Marker.阳性对照.阴性对照 3. 分别为 C F U / m L 图普通LAMP反应的灵敏度检测结果 Fig. Sensitivity of LAMP

5 , Vol.3, No. 食品科学安全检测经平板计数测得原始菌液浓度为. CFU/mL, 倍倍比稀释, 进行 RealAmp 与普通 LAMP 灵敏度检测, 结果见图和图图显示,~ 号管出现明显的扩增峰, 仪器判定为阳性, 即本实验建立的 RealAmp 检测蜡样芽孢杆菌的灵敏度达到. CFU/mL 图显示, 当纯菌培养浓度为. CFU/mL 时, 没有出现梯形条带, 说明本实验普通 LAMP 的灵敏度为. CFU/mL RealAmp 灵敏度是普通 LAMP 的倍. RealAmp 检测人工污染牛乳中的蜡样芽孢杆菌的检出限人工污染的牛乳中蜡样芽孢杆菌的纯培养物浓度为. ~. - CFU/mL, 每个稀释度分别提取 DNA, 进行 RealAmp 扩增, 结果见图,~ 号管出现扩增峰, 仪器判定为阳性, 即本实验建立的 RealAmp 检测人工污染牛乳中蜡样芽孢杆菌的检出限为. CFU/mL /min /mv ~. 培养浓度分别为 CFU/mL;. 阴性对照 Fig. 3 讨论图 RealAmp 检测人工污染牛乳的检出限 Determination of detection limit of RealAmp for artificially polluted milk powder 蜡样芽孢杆菌生长所需条件不苛刻, 生命力强, 是食品安全卫生必检的致病菌之一 [9-], 并且在原料乳中污染较为严重 [] 本研究建立的 RealAmp 是在 LAMP 技术的基础上, 对 hbla 基因的个区域设计引物保证了方法的可靠性 [3], 向体系中添加荧光染料, 通过实时荧光监测仪对荧光信号的捕捉, 成功建立了 RealAmp 检测蜡样芽孢杆菌方法该方法特异性高, 与普通 LAMP 相比灵敏度是其倍人工污染实际样品检出限为. CFU/mL 此外该方法不仅可以直接读取反应结果, 而且在结果给出后可直接终止反应, 节约了时间同时避免了观察沉淀的不确定性和用电泳检测的繁琐易被污染因此本研究探索了一种特异性强灵敏度高便捷的分子检测蜡样芽孢杆菌的新技术, 为蜡样芽孢杆菌的快速检测提供了新的发展方向溶血素基因是我国食源性蜡样芽孢杆菌主要毒力基因之一 [4], 即产生溶血素又产生肠毒素, 本研究选择蜡样芽孢杆菌的溶血素 hbla 基因为扩增的靶基因, 可以对一类致病性蜡样芽孢杆菌进行检测 [-] 在引物设计时应对引物的碱基含量引物大小退火温度二级结构自由能进行筛选, 确保引物的高特异性和扩增效率 RealAmp 实验需要在反应体系中添加荧光染料 SYBRGreenⅠ,SYBRGreenⅠ 的浓度对反应影响很大, 浓度过高会抑制反应的进行, 浓度过低则荧光信号不明显不易被仪器搜集, 因此 SYBRGreenⅠ 的添加浓度需要经过实验摸索后确定由于 RealAmp 反应的灵敏度极高, 操作时一旦污染了微量的 DNA 容易造成假阳性的结果因此, 为了避免假阳性的产生, 在操作时应划分区域进行操作, 实验器材不能混用, 试剂尽量要分装后再使用 RealAmp 为蜡样芽孢杆菌的检测提供了新的方向, 但是怎样有效避免反应中的假阳性结果, 除了规范操作以外, 有待进一步研究 ;RealAmp 目前只能进行定性检测, 如何通过 RealAmp 对样品进行定量, 也是今后需要改进的方向参考文献 : [] MANTYNEN V, LINDSTROM K. A rapid PCR-based DNA test for enterotoxic Bacillus cereus[j]. Applied and Environmental Microbiology, 99, 4(): [] 张志鸿, 王力均, 甘蓓, 等. 基于 QPCR 快速检测米饭中产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的研究 [J]. 中国粮油学报, 4, 9(): -4. DOI:.399/j.issn [3] 赵宁, 吕琦, 姚丽艳, 等. 原料乳中蜡样芽孢杆菌的快速检测 [J]. 中国乳品工业, 9, 3(9): DOI:.399/ j.issn [4] 蒋建明. 一起蜡样芽孢杆菌污染饮水引起食物中毒调查 [J]. 浙江预防医学, 9, (): DOI:.399/ j.issn [] NOTOMI T, OKAYAMA H, MASUBUCHI H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Research,, (): e3. DOI:.93/nar/..e3. [] 李秀桂, 刘巍. 环介导等温核酸扩增技术快速检测食源性致病菌应用进展 [J]. 应用预防医学,, ():-3. DOI:.399/ j.issn.3-x... [] HAN F, GE B. Quantitative detection of Vibrio vulnificus in raw oysters by real-time loop-mediated isothermal amplification[j]. International Journal of Food Microbiology,, 4(/): -. DOI:./j.ijfoodmicro...9. [] WANG F, JIANG L, GE B L. Loop-mediated isothermal amplification assay for detecting shiga toxin-producing Escherichia coli in ground beef and human stools[j]. Journal of Clinical Microbiology,, (): 9-9. DOI:./JCM.-. [9] MAEDA H, KOKEGUCHI S, FUJIMOTO C, et al. Detection of periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis by loopmediated isothermal amplification method[j]. FEMS Immunology Medical Microbiology,, 43(): DOI:./ j.femsim.4... [] MORI Y, KITAO M, TOMITA N, et al. Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA[J]. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 4, 9(): 4-. DOI:./j.jbbm.3...

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Microsoft Word 石伟雄二校出2267 7 6 Vol. 7 No. 6 2016 6 Journal of Food Safety and Quality Jun., 2016 * 石伟雄, 王羽, 杨粤, 张伟 (, 071000) 摘要 : 目的 (real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP) 方法 ( AY702093)16S~23S