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货绊危
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1 高分辨率溶解曲线检测 9 种食源性致病菌方法的建立胡双芳, 余以刚, 李蓉, 庄平, 夏杏洲, 肖性龙, 杨慧宁 (1. 华南理工大学轻工与食品学院, 广东广州 )( 2. 中山出入境检验检疫局, 广东中山 ) (3. 广东海洋大学食品科技学院, 广东湛江 ) 摘要 : 当今食源性疾病已成为一个全球关注的食品卫生问题, 常见的细菌性食物中毒的病原菌有 : 致病性大肠杆菌 ( 特别是出血性大肠杆菌 O157:H7) 沙门氏菌志贺氏菌致病性弧菌 ( 包括霍乱弧菌和副溶血弧菌 ) 金黄色葡萄球菌单增李斯特菌空肠弯曲菌以及阪崎克罗诺杆菌等单独检测一种致病菌已无法满足现今社会对同时高效检测多种致病菌的要求, 为建立一种同时对上述 9 种食品中常见致病菌的检测方法, 本研究分别以上述 9 种菌的特异性基因为靶基因, 创新性地结合一对通用引物, 建立能同时检测多种食源性致病菌的多重 HRM-real time PCR 检测体系结果表明该多重 HRM-real time PCR 检测体系通过两管 PCR 反应可对上述 9 种食品中常见致病菌进行有效的检测与区分, 且具有良好的特异性和灵敏度关键词 : 高分辨率溶解曲线 ; 致病菌 ; 检测 ; 多重 PCR 文章篇号 : (2016) DOI: /j.mfst Simultaneous Detection of Nine Foodborne Pathogenic Bacteria Using High-resolution Melting Analysis HU Shuang-fang 1, YU Yi-gang 1, LI Rong 2, ZHUANG Ping 1, XIA Xing-zhou 3, XIAO Xing-long 1, YANG Hui-ning 1 (1.College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou , China) (2.Zhongshan Entry-Exit inspection and Quarantine Bureau, Zhongshan, , China) (3.College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang , China) Abstract: Foodborne diseases have become a global food safety concern. Common bacterial pathogens involved in food poisoning include pathogenic Escherichia coli (especially enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7), Salmonella, Shigella, pathogenic Vibrio (including Vibrio cholerae and Vibrio parahaemolyticus), Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, and Cronobacter sakazakii. Species-specific detection for one type of pathogen cannot meet the requirements of modern society for multiple-pathogen detection. In order to establish a method that can simultaneously detect the above-mentioned nine pathogenic bacteria in food, a multiple high-resolution melting (HRM) real-time polymerase chain reaction (PCR) assay for the simultaneous detection of multiple foodborne pathogens was established, using the specific genes of the nine aforementioned bacteria as target genes and a novel pair of universal primers. The results showed that this multiple HRM -real time PCR detection system could effectively detect and distinguish these nine common pathogenic bacteria in food via a two-tube PCR reaction, with good specificity and sensitivity. Key words: high resolution melting; pathogen; detection; multiplex polymerase chain reaction 食源性致病菌是指在食品加工和流通过程中引入的病原菌, 这些病原菌在食品中存活生长代谢引起食品的变质和破坏, 同时有些病原菌分泌有毒物质, 直接或间接导致人患病常见细菌性食物中毒的病原收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ); 广东省省部产学研合作重大专项 (2013A ); 广东省科技计划项目 (2013B 和 2014A ) 作者简介 : 胡双芳 (1990-), 女, 博士在读, 研究方向 : 致病菌快速检测通讯作者 : 肖性龙 (1977-), 男, 博士, 副研究员, 研究方向 : 食品安全与检测菌有 : 致病性大肠杆菌 ( 特别是出血性大肠杆菌 O157:H7) 沙门氏菌志贺氏菌致病性弧菌 ( 包括霍乱弧菌和副溶血弧菌 ) 金黄色葡萄球菌单增李斯特菌和空肠弯曲菌等由于食源性致病菌引起的食品安全事件时有发生, 给食品工业以及人民生命安全造成了巨大的威胁, 我国对上述致病菌规定均不得检出近年来, 由于阪崎克罗诺杆菌引起的婴幼儿奶粉中毒事件亦时有发生 [1], 给食品行业和消费者生命安全带来巨大威胁因此, 发展新的快速检测与鉴定食源性致病菌的方法是及时有效地控制和预防致病菌传播的前提 271

2 272 目前食源性致病菌的检测方法主要包括传统培养法与生理生化检验, 以及包括酶联免疫法分子生物学方法等快速检测技术传统的检测方法无法对难培养或不可培养的致病菌进行检测, 而且耗时费力, 获得结果通常需要几天的时间, 不能实现有效的监测预防作用且单独检测一种致病菌已无法满足现今社会对致病菌检测的高效率的要求多重 PCR 是在同一 PCR 反应管中同时完成多种致病菌的高效 PCR 扩增, 从而实现多种致病菌 DNA 的同步快速检测的技术 [2] 由于多重 PCR 可降低致病菌检测过程中样本工作台物资试剂人工等占用的空间, 多重 PCR 技术在降低检测成本方面显得非常经济 [3] 高分辨率溶解曲线 (High Resolution Melting,HRM) 是一种基于单核苷酸溶解温度不同而形成不同形态溶解曲线的基因分析新技术, 通常与实时荧光 PCR 相结合, 可以实时监测温度上升时双链 DNA 的解链过程 HRM 技术以其高特异性高通量高灵敏性低成本快速等优势, 在临床诊断及基因分析上得到迅速的发展, 已成为生命科学研究中的热点技术 [4], 利用 HRM 能针对每一种细菌的固定 DNA 序列产生精确的 T m 值, 可将 HRM 分析技术应用于致病菌的多重检测中本文利用高分辨率熔解曲线分析技术针对 9 种常见致病菌 ( 沙门氏菌空肠弯曲菌单增李斯特氏菌大肠杆菌 O157:H7 志贺氏菌金黄色葡萄球菌副溶血弧菌霍乱弧菌阪崎克罗诺杆菌 ) 进行检测分别以上述 9 种菌的特定基因为靶基因, 创新性地结合一对通用引物, 建立多重 HRM-real time PCR 检测体系, 应用于 9 种目标菌的检测中 1 材料与方法 1.1 材料菌株与样品本文使用菌种列表详见表 1, 共 9 种目标菌的 61 株菌, 为沙门氏菌 (n=10) 空肠弯曲菌 (n=5) 单增李斯特氏菌 (n=12) 大肠杆菌 O157:H7(n=2) 志贺氏菌 (n=4) 金黄色葡萄球菌 (n=14) 副溶血弧菌 (n=3) 霍乱弧菌 (n=8) 阪崎克罗诺杆菌 (n=3), 以及种非目标菌株细菌 12 株真菌 9 株, 共 21 株, 所试菌株均为中山进出口检验检疫局提供表 1 菌种列表 Table 1 Reference strains used in this study 中文名拉丁名菌株编号沙门氏菌 (n=10) 沙门氏菌 Salmonella Enteritidis CMCC(B)47731 沙门氏菌 Salmonella Enteritidis ATCC 沙门氏菌 Salmonella Typhimurium ATCC 沙门氏菌 Salmonella Typhimurium CMCC 沙门氏菌 Salmonella choleraesuis ATCC 沙门氏菌 Salmonella paratyphi SZCIQ spe109 沙门氏菌 Salmonella paratyphi GZCDC wb21 沙门氏菌 Salmonella paratyphi GZCDC wb21s 沙门氏菌 Salmonella pullorum GZCDC se18 沙门氏菌 Salmonella pullorum GZCDC se32 单增李斯特菌 (n=12) 单增李斯特菌 L. monocytogenes ATCC 单增李斯特菌 L. monocytogenes CMCC 单增李斯特菌 L. monocytogenes GZCDC Lm341 单增李斯特菌 L. monocytogenes GZCDC Lm342 单增李斯特菌 L. monocytogenes GZCDC Lm343 单增李斯特菌 L. monocytogenes GZCDC Lm344 单增李斯特菌 L. monocytogenes SZCIQ rm23 单增李斯特菌 L. monocytogenes SZCIQ rm24 单增李斯特菌 L. monocytogenes 157 GZCDC Lm349 单增李斯特菌 L. monocytogenes sv5 (serotype 1/2a) CMCC 单增李斯特菌 L. monocytogenes 157 ADCPC Lsy-14 单增李斯特菌 L. monocytogenes 157 ADCPC Lsy-15 金黄色葡萄球菌 (n=14) 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus CMCC 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus CMCC 金黄色葡萄球菌 ( 耐甲氧西林 ) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus GZCDC 130R 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus ATCC 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus CMCC 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus CMCC 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus CGMCC 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus CGMCC 1.89 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus CGMCC 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus GZCDC sa108 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus GZCDC sa111 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus ATCC 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus SZCIQ HE13R 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus SZCIQ HE6R 空肠弯曲菌 (n=5) 空肠弯曲菌 Campylobacter jejuni ATCC 空肠弯曲菌 Campylobacter jejuni ATCC 转下页

3 接上页空肠弯曲菌 Campylobacter jejuni ATCC 空肠弯曲菌 Campylobacter jejuni SZCIQ Cam-65j 空肠弯曲菌 Campylobacter jejuni SZCIQ Cam-62 肠出血型大肠杆菌 (n=2) 大肠杆菌 E. coli O157:H7 SZCIQ 大肠杆菌 E. coli O157:H7 ADCPC 931 志贺氏菌 (n=4) 志贺氏菌 Shigella flexneri GZCDC sf719 志贺氏菌 Shigella dysenteriae SZCIQ 4376 志贺氏菌 Shigella boydii GZCDC d24-6j 志贺氏菌 Shigella sonnei GZCDC ig42 霍乱弧菌 (n=8) 霍乱弧菌 Vibrio cholerae O1 ATCC 霍乱弧菌 Vibrio cholerae O139 SZCIQ 5144 霍乱弧菌 Vibrio cholerae GZCDC 3626 霍乱弧菌 Vibrio cholerae GZCDC 3925 霍乱弧菌 Vibrio cholerae GZCDC 4886 霍乱弧菌 Vibrio cholerae GZCDC 5724 霍乱弧菌 Vibrio cholerae GZCDC 9166 霍乱弧菌 Vibrio cholerae GZCDC 9168 副溶血弧菌 (n=3) 副溶血弧菌 Vibrio parahaemolyticus GZCDC VP3 副溶血弧菌 Vibrio parahaemolyticus ATCC 副溶血弧菌 Vibrio parahaemolyticus LM5312 阪崎克罗诺杆菌 (n=3) 阪崎克罗诺杆菌 Cronobacter Sakazakii SZCDC ES2 阪崎克罗诺杆菌 Cronobacter Sakazakii ATCC 阪崎克罗诺杆菌 Cronobacter Sakazakii ATCC BAA-894 其他细菌 (n=12) 结肠炎耶尔森菌 Yersinia enterocolitica SHCDC ye23 军团菌 Legionella pneumophila ADCPC 239 创伤弧菌 Vibrio vulnificus ATCC 粪肠球菌 Enterococcus faecalis ADCPC 013 假单胞菌 Pseudomonas cocovenenans ADCPC wha-45 假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa SZCDC pa52 变形杆菌 Proteus vulgaris SHCDC pall-k 大肠杆菌 Escherichia coli SZCIQ eco5 大肠杆菌 Escherichia coli SZCIQ jm109 猪链球菌 2 型 Streptococcus suis serotype 2 SZCIQ 553 蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus CMCC 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis GZCDC WE2-aj 真菌 (n=9) 酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae HG SC1 毕赤酵母 Pichia farinosa HGpf 1 假丝酵母 Candida utilis HG CU 2 红酵母 Rhodotorula pallida HGRP1 米曲霉 Aspergillus oryzae HG AO1 华根霉 Rhizopus chinensis Sato HG rc 2 卷枝毛霉 Mucor circinelloides HG mc 2 米黑根毛霉 Rhizomucor miehei HG RM1 白地霉 Geotrichum candidum HG gc 主要试剂 Premix Ex Taq( 宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ), 细菌 DNA 提取试剂盒玻璃珠法柱式真菌 DNA 提取试剂盒 ( 北京天恩泽基因科技有限公司 ), 缓冲蛋白胨水 (BPW) LB 培养基碱性氯化钠蛋白胨水布氏肉汤培养基 DEPC 水主要仪器 LightCycler 480( 上海罗氏诊断产品有限公司 ) Thermo 微量超速离心机 ( 上海托莫斯科学仪器有限公司 ) FA2004B 电子天平 ( 上海精密仪器科学有限公司 ) YXQ-LS-18S1 高压灭菌锅 ( 上海博讯实业有限公司 ) SPX-250B 生化培养箱 ( 上海博讯实业有限公司 ) QL-866 旋涡振荡仪 ( 江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司 ) 1.2 方法引物设计检索文献, 确定靶基因, 从 GeneBank 下载所有靶基因的序列, 针对每种致病菌用生物软件进进序列比对, 截取最一致的序列进行引物设计, 将设计好的引物在 GeneBank 上进行 Blast 比对, 验证引物的保守性其中, 引物分别设计在沙门氏菌基因组中 fimy 基 [5] 因 [6] 基因 [7] 基因相对保守且高度特异的序列, 单增李斯特菌 hly 相对保守且高度特异的序列, 空肠弯曲菌 orfc 相对保守且高度特异的序列, 大肠杆菌 O157: [8] H7 的 rfbe 基因相对保守且高度特异的序列, 志贺氏 [9] 菌的 ipah 基因相对保守且高度特异的序列, 金黄色 [10] 葡萄球菌的 sa442 基因相对保守且高度特异的序 [11] 列, 副溶血弧菌的 toxr 基因相对保守且高度特异的 [12] 序列, 霍乱弧菌的 hlya 基因相对保守且高度特异的 [13] 序列, 阪崎克罗诺杆菌的 cgca 基因相对保守且高度特异的序列在上述特异性引物 5 端加上通用引物序列, 其中上游引物为 Bacunpf:5' TAGCACACGCA GAGTACGTAGCT 3', 下游引物为 Bacunpr:5' CGAGA CAGCAGTCAATACCGTC 3', 从而得到包含通用引物序列与特异性引物序列的长引物, 引物对序列见表 2 273

4 所有引物由上海辉瑞生物科技有限公司合成, 随后进一步实验筛选出最佳引物组合, 以确定为本方法中所 274 目标菌副溶血弧菌单增李斯特菌肠弯曲菌霍乱弧菌基因 toxr hly orfc hlya 含通用引物序列的长引物 (5-3 ) VPPF5'TAGCACACG GCGACCTTTCTCTG AAATATTAATTGT3' VPPR5'CGAGACAGC AGTCAATACCGTCC ATTCGCGTGGCAAA CATC3' LMPF5'TAGCACACG TTCATCCATGGCAC CACCA 3' LMPF5'CGAGACAGC AGTCAATACCGTCA CACGCGGATGAAAT CGATAAGTATA3' CJUPF5'TAGCACACG CACACCTGAAGTAT GAAGTGGTCTAAGT 3' CJUPR5'CGAGACAG CAGTCAATACCGTC TTGGTATGGCTATAG GAACTCTTATAGCT 3' VCPF5'TAGCACACG GCT TTA TTG TTC GAT GCG TTAAAC3' VCPR5'CGAGACAGC AGTCAATACCGTC GAT GCCAAA ATT GTGCGTATCA 3' 表 2 引物序列及扩增片段使用的引物的兼容性和效率 Table 2 Sequences of primers and amplified fragments 特异性引物 VP1231:5'-GCGACCTTTCTC TGAAATATTAATTGT-3' VP1286: 5'-CATTCGCGTGGCAAACA TC-3' LM : 5 -TTCATCCATGGCACCAC CA-3 Lm :5 ACACGCGGAT GAAATCGATAAGTATA-3 CJU :5 CACACCTG AAGTATGAAGTGGTCTAA GT 3 CJU :5 TTGGTATG GCTATAGGAACTCTTATAG CT 3 VCPF1053: 5'-GCTTTATTGTTCGATGCG TTA AAC-3 VCPR1189:5'-GATGCCAAAA TTGTGCGTATC A-3' 扩增片段长度 /GC% 理论 Tm 值 / 实际 Tm 值 124bp % bp % bp % bp % 扩增片段 CGAGACAGCAGTCAATA CCGTCCATTCGCGTGGCA AACATCAAACTGTTCGCA CAAGGCTCGACGGCTGA ATCGACAATTAATATTTCA GAGAAAGGTCGCAGCTA CGTACTCTGCGTGTGCTA GTAGCTTTCATCCATGGC ACCACCAGCATCTCCGCC TGCAAGTCCTAAGACGCC AATCGAAAAGAAACACG CGGATGAAATCGATAAGT ATAGACGGTATTGACTGC TGTCTCG GTAGCTCACACCTGAAGT ATGAAGTGGTCTAAGTCT TGAAAAAGTGGCATATTC TCCTGCTAAATAATTTAAA TTAGGATATGCCATTTGA AAAGCTATAAGAGTTCCT ATAGCCATACCAAGACGG TATTGACTGCTGTCTCG CGAGACAGCAGTCAATA CCGTCGATGCCAAAATTG TGCGTATCAGCCTAGATG ATGACAGCACGGGAGCC GGCATTCATCTGAATGAT CAACTCGGTTATCGTCAG TTTGGAGCCAGTTATACG ACGTTAGATGCCTATTTCC GTGAGTGGTCAACCGATG CGATTGCCCAAGATTATC GCTTCGTGTTTAACGCAT CGAACAATAAAGCAGCTA CGTACTCTGCGTGTGCTA 转下页

5 接上页 SaPF5'TAGCACACGC AGAGTACGTAGCTG Salf714:5'-GCGGCGTTGGAG 112bp CGGCGTTGGAGAGT AGTGATA-3' GTAGCTGCGGCGTTGGA GATA3' GAGTGATAACGGCAGGC 沙门 fimy SaPR5'CGAGACAGC GCAGTCTTTGGCATTTCTT 氏菌 AGTCAATACCGTCA AAACGGCGGTGTCTTTCC Salr796:5'-AGGGAAAGACA GGGAAAGACACCG 54.46% CTGACGGTATTGACTGCT CCGCCGTTTAAGAAATG -3' CCGTTTAAGAAATG GTCTCG 3' 金黄色葡萄球菌 Sa442 STAPF5'TAGCACACG TTCTTCACGACTAA ATAAACGCTCA3' STAPR5'CGAGACAG CAGTCAATACCGTC GGTACTACTAAAGA TTATCAAGACGGCT 3' Sa442pf:5'-TTCTTCACGACT AAATAAACGCTCA -3' Sa442pr:5'-GGTACTACTAAA GATTATCAAGACGGCT-3' 192bp % GTAGCTTTCTTCACGACT AAATAAACGCTCATTCGC GATTTTATAAATGAATGTT GATAACAATGTTGTATTAT CTACTGAAATCTCATTAC GTTGCATCGGAAACATTG TGTTCTGTATGTAAAAGC CGTCTTGATAATCTTTAGT AGTACCGACGGTATTGAC TGCTGTCTCG 志贺氏菌 ipah SgPF5'TAGCACACGC AGAGTACGTAGCTC GCAATACCTCCGGA TTCC3' SgPR5'CGAGACAGC AGTCAATACCGTCT CCGCAGAGGCACTG AGTT3' Sgpf944:5 -CGCAATACCTC CGGA TTCC-3 Sgpr1008:5 -TCCGCAGAGG CACTGAGTT-3 110bp % GTAGCTCGCAATACCTCC GGATTCCGTGAACAGGTC GCTGCATGGCTGGAAAA ACTCAGTGCCTCTGCGGA GACGGTATTGACTGCTGT CTCG CSPF5'TAGCACACG TTGATCAGGTCGTC CSPB803:5 TTGATCAGGTC GTCAGAATCTACGGGT3 134bp GTAGCTTTGATCAGGTCG TCAGAATCTACGGGTTTG 阪崎肠杆菌 cgca AGAATCTACGGGT3' CSPR5'CGAGACAGC CGCGCTCGACGCGTTACC CGATTGTCGTGGTGGCCG AGTCAATACCGTCG CAGATTGTCTTTGTC CSPR890:5 GCAGATTGTCT TTGTCATACCCG % GGTATGACAAAGACAATC TGCGCGACGGTATTGACT ATACCCG3' GCTGTCTCG O157PF5'TAGCACAC GCAGAGTACGTAGC TTCCTCAGCTATAGG O157PF104:5'-TCCTCAGCTA TAGGGTGCTTTTG-3' 128bp GTAGCTTCCTCAGCTATA GGGTGCTTTTGATATTTTT 大肠 O157:H7 rfbe GTGCTTTTG3' O157PR5'CGAGACAG O157PR186:5'-ATCGAAACA CCGAGTACATTGGCATCG TGTGGACAGGGTAAAAA CAGTCAATACCGTC ATCGAAACAAGGCC AGGCCAGTTTTTTAC-3' 46.88% ACTGGCCTTGTTTCGATG ACGGTATTGACTGCTGTC AGTTTTTTAC3' TCG 275

6 1.2.2 DNA 模板的提取沙门氏菌单增李斯特氏菌大肠杆菌 O157: H7 志贺氏菌金黄色葡萄球菌以及阪崎肠杆菌等采用液体 LB 培养基在 37 下培养 24 h, 霍乱弧菌和副溶血弧菌采用 3% 的碱性氯化钠蛋白胨水在 37 下培养 24 h, 空肠弯曲菌采用布氏肉汤培养基 42 下培养 24 h, 真菌采用 YPD 液体培养基在 30 下培养 72 h, 然后分别取 1 ml 菌液依照 DNA 提取试剂盒说明书提取 DNA, 提取 DNA 后均作为反应模板贮存于 -20 备用单重 HRM-real time PCR 反应体系的建立根据 takara Premix Ex Taq 试剂盒说明书要求, 每 20 μl 的 PCR 反应体系包含 10 μlpremix Ex Taq (2 ), 0.5 μl 上游引物 (10 M),0.5 μl 下游引物 (10 M), 1.25 μl Evagreen 染料 (20 ),2 μl Template( 反应组以基因组 DNA 为模板, 对照组的模板为无菌去离子水 ) 276 引物对组分其他组分 A 组 B 组 C 组单重 HRM-real time PCR 反应程序均为 :95 预变性 1 min; 以 95 变性 5 s,60 退火 40 s 扩增 40 个循环 PCR 产物进行高分辨率溶解曲线分析, 溶解程序为 :95 2 min,60 2 min;60 1 s, 然后升温至 95 ( 溶解速率为 0.2 /s), 最后 50 冷却程序设置 :reporter dye: SYBR; quencher:none; passive reference dye:rox 多重 HRM-real time PCR 反应体系的建立在单重 HRM-real time PCR 反应体系建立的基础上, 根据不同目标基因扩增片段 Tm 值不同以及引物对之间的相互影响将引物对分为 A B C 三组以单重 HRM-real time PCR 反应体系为框架, 在同一反应管中, 加入对应的多种目标菌的特异性引物对及通用引物对, 如表 3 所示其中多重 HRM-real time PCR 反应程序与单重 HRM-real time PCR 反应一致, 如所述表 3 多重 HRM-real time PCR 反应体系 Table 3 Multiplex HRM real-time PCR reaction system 含量空肠弯曲菌志贺氏菌副溶血弧菌金黄色葡萄球菌单增李斯特菌引物对各 0.1 μl 阪崎克罗诺杆菌沙门氏菌 O157:H7 霍乱弧菌引物对各 0.1 μl 空肠弯曲菌志贺氏菌副溶血弧菌金黄色葡萄球菌单增李斯特菌阪崎克罗诺杆菌多重 HRM-real time PCR 反应特异性在多重 HRM-real time PCR 反应体系建立的基础上, 以目标菌和非目标菌株的基因组 DNA 为模板进行多重 HRM-real time PCR 反应, 检验所建立体系的特异性其中对表 1 所示沙门氏菌 (n=10) 空肠弯曲菌 (n=5) 单增李斯特氏菌 (n=12) 大肠杆菌 O157: H7(n=2) 志贺氏菌 (n=4) 金黄色葡萄球菌 (n=14) 副溶血弧菌 (n=3) 霍乱弧菌 (n=8) 阪崎克罗诺杆菌 (n=3), 以及种非目标菌株细菌 12 株真菌 9 株, 共 21 株, 进行了特异性检验多重 HRM-real time PCR 反应灵敏度将上述 9 种食源性致病菌按的方法进行培养, 然后按梯度稀释, 取涂板计数, 涂板的菌液量为 100 μl/ 平板并将五个梯度菌液然后分别取 1 ml 菌液依照 DNA 提取试剂盒说明书提取 DNA, 提取 DNA 后均作为反应模板贮存于 -20 备用用中建立的多重沙门氏菌 O157:H7 霍乱弧菌引物对各 0.1 μl 10 μl Premix Ex Taq (2 ),0.2 μl BSA(20 mg/ml), 通用引物对 0.6 μl(10 M), 1.25 μl Evagreen 染料 (20 ), 2 μl Template, 以 DPEC 补充至 20 μl HRM-real time PCR 反应条件与反应体系进行实验, 每个梯度重复 3 次, 检测多重 HRM-real time PCR 的灵敏度 2 结果与讨论 2.1 引物的设计理想情况下, 反应体系中使用一对引物即可检测多种致病菌但是目前使用 HRM 进行致病菌检测与分型的研究主要集中在利用共同保守基因序列设计引物对在研究初始阶段曾尝试从 9 种致病菌的 16S rrna 基因中寻找保守序列进行引物设计, 但由于 9 种致病菌跨种属过大, 难以进行设计因此本文以 9 种致病菌的特异性基因片段设计 9 种对应的特异性引物, 依据目的 PCR 扩增产物理论 Tm 值有无明显差异, 挑选出用于多重 HRM-real time PCR 反应的引物对将上述 9 种对应的特异性引物结合通用型引物, 相互结合形成一套新型有效的引物组合, 能同时对 9 种致

7 病菌进行快速有效的检测与鉴定, 其原理如图 1 所示在溶解曲线中, 目标扩增 DNA 片段的长度和 GC 含量都对 Tm 值有影响表 2 中 9 个目标菌扩增产物理论 Tm 值跨度在至范围内, 对 9 个目标菌扩增产物的 GC 含量片段长度等参数进行了比较由上表可以清楚的看出,Tm 值与 GC 在目标扩增 DNA 片段中的百分比成正相关在 9 种致病菌的扩增片段中, 志贺氏菌 ( 理论 Tm 值 83.09,G+C% 为 55.45%) 和阪崎克罗诺杆菌 ( 理论 Tm 值 83.31,G+C% 为 55.22%) 的 GC 含量均超过 55%, 其理论 Tm 值均超过了 83; 空肠弯曲菌 ( 理论 Tm 值 78.09,G+C% 为 39.75%) 和金黄色葡萄球菌 ( 理论 Tm 值 77.67,G+C% 为 37.50%) 的 GC 含量均低于 40%, 其理论 Tm 值均低于 79; 沙门氏菌 ( 理论 Tm 值 82.77,G+C% 为 54.46%) 单增李斯特菌 ( 理论 Tm 值 81.43,G+C% 为 49.62%) 副溶血弧菌 ( 理论 Tm 值 81.04,G+C% 为 49.19%) 和 O157( 理论 Tm 值 80.21,G+C% 为 46.88%) 的 Tm 值则随着扩增片段 GC 含量的增加而递增, 这说明 GC 含量是影响 Tm 值的关键, 而非 bp 数量但当扩增片段长度明显增加时, 也能显著影响扩增片段理论 Tm 值, 如霍乱弧菌扩增片段为 233bp, 尽管其 GC 含量只占 48.07%, 也能显著升高 Tm 值至实际 Tm 值为 81.64, 理论 Tm 值为 78.09; 阪崎克罗诺杆菌 cgca 基因的实际 Tm 值为 83.33, 理论 Tm 值为 83.81; 单增李斯特菌 hly 基因的实际 Tm 值为 82.23, 理论 Tm 值为 81.43;O157:H7 的 rfbe 基因的实际 Tm 值为 84.08, 理论 Tm 值为 80.21; 副溶血弧菌 toxr 基因的实际 Tm 值为 85.41, 理论 Tm 值为 81.04; 沙门氏菌 fimy 基因的实际 Tm 值为 86.44, 理论 Tm 值为 82.77; 霍乱弧菌 hlya 基因的实际 Tm 值为 86.60, 理论 Tm 值为 82.45; 志贺氏菌 ipah 基因的实际 Tm 值为 86.70, 理论 Tm 值为实际值与理论 Tm 值相比均存在一定的差距, 但实际 Tm 值与预期大小相符图 2 单重 HRM-real time PCR 的溶解曲线图 Fig.2 Melt curve of HRM real-time PCR 2.3 多重 HRM-real time PCR 反应建立图 1 PCR 反应示意图 Fig.1 Schematic diagram of PCR 2.2 单重 HRM-real time PCR 反应建立单重 PCR 反应体系分别扩增出了 9 种致病菌对应的 9 条特异性高分辨率溶解曲线和熔点峰, 具有典型的 S 形扩增曲线,CT 值在之间如图 2 所示, 所对应的金黄色葡萄球菌 sa442 基因的实际 Tm 值为 81.50, 理论 Tm 值为 77.67; 空肠弯曲菌 orfc 基因的通过单重 HRM-real time PCR 反应可知,9 种目标致病菌在退火温度为 60 时均能够获得良好的扩增结果, 故选 60 作为多重反应程序的退火温度但若直接将单重体系中的模板及引物对浓度简单的混合在一起进行多重 HRM-real time PCR 反应, 则扩增效果不是很理想, 溶解曲线峰不明显, 因此需要对多重反应体系组分进行分组实验并初步优化且预实验发现, 在多重 HRM-real time PCR 反应体系中加入 BSA, 可提高反应的灵敏度, 扩增结果要明显好于不加 BSA 常规的基因分型技术需要进行荧光探针的标记, HRM 技术可以在没有荧光探针标记的情况下, 根据高分辨率溶解曲线的形状进行基因分型, 结果准确可靠通过单重 HRM-real time PCR 反应可知,9 种目标致病菌的 Tm 值有一定的相似性, 在进行多重 HRM-real time PCR 时可能存在相互影响难以区分经过预实验, 将 9 种致病菌分为 3 组如表 3 所示, 其中 C 组结果显示 9 种目标菌的引物对同在一个反应管中进行多重 PCR 反应时存在相互干扰, 无法区分不同目标菌 ( 未附图 ) 因此要实现 9 种目标菌的同时检测, 277

8 至少需分两个反应管完成, 其中 A 组多重 PCR 反应结果如图 3 所示,B 组多重 PCR 反应结果如图 4 所示如图 3 所示, 所对应的金黄色葡萄球菌 sa442 基因的实际 Tm 值为 81.81±0.024; 空肠弯曲菌 orfc 基因的实际 Tm 值为 81.31±0.035; 单增李斯特菌 hly 基因的实际 Tm 值为 81.60±0.041; 副溶血弧菌 toxr 基因的实际 Tm 值为 85.55±0.071; 志贺氏菌 ipah 基因的实际 Tm 值为 86.88±0.082 由于高分辨率溶解曲线的特异性与高分辨率, 对于不同的 Tm 值相差超过 1 以上的片段, 其差距一般大于 SD 的三倍以上, 可以清晰的进行区分但由于金黄色葡萄球菌空肠弯曲菌以及单增李斯特菌扩增片段的 Tm 值较为接近, 需要 [14] 进行计算根据 Slinger 等的研究, 当以三倍 SD 为 cutoff 值时金黄色葡萄球菌 sa442 基因的 Tm 值范围为 ~81.882; 空肠弯曲菌 orfc 基因的 Tm 值范围为 ~81.415; 单增李斯特菌 hly 基因的 Tm 值范围为 ~81.723, 三者 Tm 值明显并不重叠, 这表明本方法建立的多重 HRM-real time PCR 能对上述三种菌株进行有效区分图 3 多重 HRM-real time PCR 的溶解曲线图 (A 组 ) Fig.3 Melt curve of multiplex HRM real-time PCR (group A) Tm 值为 86.58±0.041 其中沙门氏菌与霍乱弧菌的 Tm [14] 值较为接近, 根据 Slinger 等的研究, 当以三倍 SD 为 cutoff 值时沙门氏菌 fimy 基因的 Tm 值范围为 ~86.395, 霍乱弧菌 hlya 基因的 Tm 值范围为 ~ 两者 Tm 值明显并不重叠, 这表明本方法建立的多重 HRM-real time PCR 能对上述三种菌株进行有效区分 2.4 多重 HRM-real time PCR 反应特异性多重 PCR 反应体系特异性检验结果表明, 所有目标菌均出现阳性扩增, 而其他非目标菌株, 均未出现扩增表明多重 PCR 反应体系具有良好的特异性其中 A 组能有效扩增所试的所有空肠弯曲菌志贺氏菌副溶血弧菌金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌 ;B 组有效扩增所试的所有阪崎克罗诺杆菌沙门氏菌 O157:H7 和霍乱弧菌 ;A 组与 B 组均不能扩增其他非目标菌株 2.5 多重 HRM-real time PCR 反应灵敏度多重 HRM-real time PCR 反应结果表明, 随着稀释梯度的不断增加, 即菌浓度的不断减少, 其 Ct 值对应增大, 直至稀释至 10 2 CFU/mL 时达到检出限, 其平均 Ct 值为 33.14~34.88 之间, 标准差为 0.12~0.22 之间结合平板计数结果显示, 空肠弯曲菌志贺氏菌副溶血弧菌金黄色葡萄球菌单增李斯特菌阪崎克罗诺杆菌沙门氏菌 O157:H7 和霍乱弧菌的检测灵敏度分别为和 CFU/mL 结果表明上述多重 HRM-real time PCR 体系对上述 9 种食源性致病菌的检测均具有良好的灵敏度 3 结论图 4 多重 HRM-real time PCR 的溶解曲线图 (B 组 ) Fig.4 Melt curve of multiplex HRM real-time PCR (group B) 如图 4 所示, 所对应的阪崎克罗诺杆菌 cgca 基因的实际 Tm 值为 82.70±0.068;O157:H7 的 rfbe 基因的实际 Tm 值为 84.08±0.091; 沙门氏菌 fimy 基因的实际 Tm 值为 86.29±0.035; 霍乱弧菌 hlya 基因的实际 3.1 综上所述, 本研究所构建的实时荧光定量 PCR 探针法具有操作简单快速特异性强等优点, 为食品中多种致病菌污染的快速检测提供了新的手段, 有望发展为快速同时检测食品中多种致病菌污染的有效手段目前运用单重或多重 PCR 方法, 对一种或多种食源性致病菌进行检测的研究很多 [4-13], 但由于多重 PCR 反应中容易发生各套引物非特性结合或者扩增的问题, 因此很难实现超过 3 种目标基因同时检测的目标通过多重 PCR 方法, 能实现同时对 9 种食源性致病菌进行检测的方法还未见报道本研究采用大量通用引物结合少量特异性引物的方法, 避免了不同特异性引物之间发生的非特性结合或者扩增的问题, 从而实现了该多重 HRM-real time PCR 检测体系通过两 278

9 管 PCR 反应可对上述 9 种食品中常见致病菌进行有效 HRM-real time PCR 反应体系见表 5 的检测与区分, 并具有良好的特异性和灵敏度多重表 4 多重 HRM-real time PCR 反应灵敏度 Table 4 Sensitivity of multiplex HRM real-time PCR 菌种名原始浓度 /(CFU/mL) Ct 值灵敏度 /(CFU/mL) 空肠弯曲菌 ± ± ± ± ± ± 志贺氏菌 ± ± ± ± ± ± 副溶血弧菌 ± ± ± ± ± ± 金黄色葡萄球菌 ± ± ± ± ± ± ± 单增李斯特菌 ± ± ± ± ± ± 阪崎克罗诺杆菌 ± ± ± ± ± ± ± 沙门氏菌 ± ± ± ± ± ± O157:H ± ± ± ± ± ± ± 霍乱弧菌 ± ± ± ± ± 注 :-, 表示未检测到荧光信号表 5 多重 HRM-real time PCR 反应体系 Table 5 Multiplex HRM real-time PCR reaction system 组分含量 A 组引物对空肠弯曲菌志贺氏菌副溶血弧菌金黄色葡萄球菌单增李斯特菌引物对各 0.1 μl B 组引物对阪崎克罗诺杆菌沙门氏菌 O157:H7 霍乱弧菌引物对各 0.1 μl 其他组分 10 μl Premix Ex Taq (2X),0.2 μl BSA(20 mg/ml), 通用引物对 0.6 μl(10 M), 1.25 μl Evagreen(20X) 染料,2 μl Template, 以 DPEC 补充至 20 μl 种食源性致病菌多重 HRM-real time PCR 检测体系和检测程序 : 95 预变性 1 min; 以 95 变性 5 s,60 退火 40 扩增 40 个循环 PCR 产物进行高分辨率溶解曲线分析, 溶解程序为 :95 2 min,60 2 min;60 1 s, 然后升温至 95 ( 溶解速率为 0.2 /s), 最后 50 冷却程序设置 :reporter dye:sybr;quencher:none; passive reference dye:rox 参考文献 [1] Pina-Pérez M C, Rodrigo D, Martínez A. Non-Thermal Inactivation of Cronobacter Sakazakii in Infant Formula Milk: A Review [J]. Critical Reviews In Food Science And Nutrition, 2014 (just-accepted) [2] Garrido A, Chapela M J, Román B, et al. A new multiplex real-time PCR developed method for Salmonella spp. and Listeria monocytogenes detection in food and environmental samples [J]. Food Control, 2013, 30(1): [3] Singh J, Batish V K, Grover S. Simultaneous detection of Listeria monocytogenes and Salmonella spp. in dairy products using real time PCR-melt curve analysis [J]. Journal of Food Science and Technology, 2012, 49(2): [4] Maurischat S, Szabo I, Baumann B, et al. Rapid real-time PCR methods to distinguish Salmonella Enteritidis wildtype field isolates from vaccine strains Salmovac SE/Gallivac SE and AviPro Salomonella VAC E [J]. Journal of Microbiological Methods, 2015, 112: [5] Wang K C, Hsu Y H, Huang Y N, et al. FimY of Salmonella enterica serovar Typhimurium functions as a DNA-binding protein and binds the fimz promoter [J]. Microbiological Research, 2014, 169(7): [6] Tamburro M, Sammarco M L, Ammendolia M G, et al. Evaluation of transcription levels of inla, inlb, hly, bsh and prfa genes in Listeria monocytogenes strains using quantitative reverse-transcription PCR and ability of invasion into human CaCo-2 cells [J]. FEMS Microbiology Letters, 2015, 362(6): 1-7 [7] Miljković-Selimović B, Babić T, Kocić B, et al. Identification of campylobacter species isolates with phenotypic methods and polymerase chain reaction [J]. Srpski Arhiv Za Celokupno Lekarstvo, 2014, 142(11-12): [8] Yang X, Cheng H W, Chen L, et al. A duplex SYBR Green I real-time quantitative PCR assay for detecting Escherichia 279

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Microsoft Word _朱静鸿-二校 30 7 1 Vol. 7 No. 1 2016 1 Journal of Food Safety and Quality Jan., 2016 2013~2014 朱静鸿 *, 龚云伟, 李月婷, 武艳立 (, 130033) 摘要 : 目的方法 2013 结果 2013~2014 11 433, 74, 17.09%, 42 21 9 2 2013 2014 (x 2 =0.09, P>0.05)

中图分类号：；文献标识码： ；文章篇号: (2004)01-000#-0#

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