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1 生物工程学报 Chin J Biotech 2008, October 25; 24(10): journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN cjb@im.ac.cn 2008 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved 技术与方法 toxr 基因作为荧光定量 PCR 靶基因设计 TaqMan 探针快速检测副溶血弧菌覃倚莹 1, 吴晖 1, 肖性龙 1,2, 杨晓泉 1, 张经纬 2, 余以刚 1, 李惠芳 1 华南理工大学轻工与食品学院, 广州深圳太太基因工程有限公司, 深圳摘要 : 以 toxr 基因为靶基因, 通过优化反应条件建立了快速检测副溶血弧菌的 TaqMan 实时荧光 PCR 方法特异性试验表明, 该方法能选择性检测副溶血弧菌, 而与金黄色葡萄球菌沙门氏菌单增李斯特杆菌等多种常见的食源性病原菌没有交叉反应 ; 灵敏度试验表明, 该方法最少可检测到 25 个拷贝的 toxr 基因重组质粒, 对纯培养物和模拟食品样品直接检测的灵敏度分别为 21 cfu/ml 和 210 cfu/g; 重复性试验表明, 同一样品于试验内及试验间的变异系数分别为 0.9% 和 1.3%; 所制作的标准曲线在 ~ 拷贝数之间有较好的线性关系, 能对副溶血弧菌进行准确的定量分析结果表明, 本研究所建立的副溶血弧菌实时荧光 PCR 检测方法具有特异性好灵敏度高重复性好的特点, 能进行定量检测, 而且检测时间从核酸抽提到出实验结果仅需要 3 h, 是快速检测副溶血弧菌的有效手段关键词 : 副溶血性弧菌, 实时荧光定量 PCR, toxr 基因, TaqMan 探针, 检测 2 Rapid Detection of by TaqMan-based Real-time PCR Assay Targeting the toxr Gene Yiying Qin 1, Hui Wu 1, Xinglong Xiao 1,2, Xiaoquan Yang 1, Jingwei Zhang 2, Yigang Yu 1, and Huifang Li 2 1 College of Light Industry & Food, South China University of Technology, Guangzhou , China 2 Shenzhen Taitai Genomics Inc, Shenzhen , China Abstract: We designed a pair of specific primers and a TaqMan fluorescent probe targeting the toxr gene of (VP). After optimizing the conditions, the specialty, sensitivity and reproducibility of the detection method were evaluated. Results: (1) the developed real-time PCR assay protocol detected only VP and was not affected by other normal food pathogens such as Staphylococcus aureus, Salmonela, Listeria monocytogenes. (2) the limit of detection was 25 copies of toxr gene in the detected samples, and the sensitivity of pure cultures and simulated food samples was 21cfu/mL and 210 cfu/g. (3) the developed protocol of real-time PCR assay had a high reproducibility, and the sample s variation was 0.9% and 1.3% within the same sample and between tests. (4) the standard curve had a good linearity when the gene quantity was between and copies. The developed detection assay targeting the toxr gene can quantitatively detect VP in only 3 hours, and thus is an efficacious method for the detection of. Received: March 28, 2008; Accepted: May 27, 2008 Supported by: Supported by: Program for New Century Excellent Talents in University (No. NCEF ), Cooperation Project between Guangdong Province and Hongkong (No. 2005A ), Manufacturing Studying & Researching Project of Guangdong Province (Nos. 2007B , 2007B ). Corresponding author: Xinglong Xiao. Tel: ; redtreer@163.com 新世纪优秀人才支持计划 (No. NCEF ), 粤港招标项目 (No. 2005A ), 2007 年省部产学研合作专项资金项目 (Nos. 2007B , 2007B ) 资助

2 1838 ISSN CN /Q Chin J Biotech October 25, 2008 Vol.24 No.10 Keywords:, real-time PCR, toxr gene, TaqMan-based probe, detection 进食被副溶血弧菌污染的食物易导致腹痛腹泻, 甚至休克昏迷而死亡 [1] 目前副溶血弧菌 (, VP) 占细菌性食物中毒的第一位, 在近年来沿海地区的食物中毒病例中, 该菌已成为首要病原 [2], 而且我国是水产品出口大国, 副溶血性弧菌则是我国出口头足类水产品的必检项目, 因此在饮水食品检测和食物中毒源调查传染病源调查等工作中, 经常要检测副溶血弧菌传统的副溶血弧菌检测法包括增菌培养分纯镜检和生化试验等步骤, 耗时长操作繁琐荧光定量 PCR 检测技术具有快速简便直观定量准确等优势, 在病原菌检测中已得到广泛应用 [3,4] 文献已报道的副溶血性弧菌荧光 PCR 检测方法一般是以 [5] gyrase 基因 [6,7] TLH 和 TDH 基因为靶基因设计引物探针, 这些基因的同源性较低, 易造成假阳性现象本研究采用 TaqMan 荧光探针技术, 以 toxr 为靶基因建立快速检测副溶血弧菌的实时荧光 PCR(Real-time PCR, RT-PCR) 方法, 通过特异性试验敏感度试验重复性试验证实该方法特异性好灵敏度高稳定性好检测耗时短, 是快速检测副溶血弧菌的有效方法 1 材料与方法 1.1 材料菌株与样品 7 株副溶血性弧菌 (, VP) 标准菌株由深圳出入境检验检疫局的实验室提供, 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 伤寒杆菌 (Salmonellatyphiurium) 变形杆菌(Proteus vulgaris) 沙门氏菌 (Salmonela) 单增李斯特杆菌(Listeria monocytogenes) 志贺氏菌(Shigella dysenteriae) 阪崎肠杆菌 (Enterobacter sakazakii) 阴沟肠杆菌 (Enterobacter cloacae) 等 16 株阴性对照菌株由深圳太太基因工程有限公司提供临床检测的 135 份食品样本均为深圳检验检疫局 2007 年 11~12 月份送检的鲜活海产品样本主要试剂 PMD18T 载体 T4 DNA 连接酶细菌基因组 DNA 抽提试剂盒凝胶回收试剂盒质粒纯化试剂盒均购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ; Taq 酶为 MBI 公司产品主要仪器 ABI7500 荧光定量 PCR 仪 Biophotometer 分光光度计 (Eppendorf) PTC-100TM 自动热循环 PCR 仪 (MJ Research) Sigma 低温微量超速离心机水浴锅涡旋振荡器等 1.2 方法 toxr 基因特异性分析和引物探针的设计从 GenBank 上获得副溶血弧菌的 toxr 基因的 DNA 序列, 登录号为 AB029908, 采用 DNAStar 软件中的 Seqman 进行同源性分析, 确定在副溶血弧菌菌株内保守其他菌株间特异的片段, 利用生物软件 Primer Express2.0 对该保守片段设计引物和探针通过对 GenBank 数据库中所有生物核苷酸序列进行 BLAST 同源性比较分析, 证实所选设计的引物与探针对 VP 具有高度特异的, 其序列和特征如下 ( 表 1) toxr 标准质粒的构建对副溶血弧菌 toxr 基因进行 PCR 扩增, 将含有目的扩增片段的 PCR 产物回收纯化, 连接到 PMD18-T 载体中制备重组质粒, 转化到感受态大肠埃希菌 DH5α, 经 TaKaRa 质粒小提试剂盒回收纯化后进行测序, 利用分光光度计测定重组质粒的浓度和纯度 Table 1 表 1 引物与探针的序列与特征 Nucleotide sequences of the primers and probe for RT-PCR Name Sequence (5-3 ) Length (bp) T m value Primer vp1231 GCGACCTTTCTCTGAAATATTAATTGT Primer vp1286 CATTCGCGTGGCAAACATC Probe vp1259 FAM-5 -CGCACAAGGCTCGACGGCTGA-3 -TAMRA The primers and probe are synthesized by Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & Services Co., Ltd

3 覃倚莹等 : toxr 基因作为荧光定量 PCR 靶基因设计 TaqMan 探针快速检测副溶血弧菌副溶血弧菌实时荧光 PCR 的建立与优化参照 MBI 公司产品 Taq 酶 (#EP0402) 说明书, 将荧光定量 PCR 上游引物下游引物和探针同时加入反应体系中, 于 ABI 7500 荧光定量 PCR 仪进行荧光定量 PCR 扩增对荧光定量 PCR 反应体系中各组分浓度和反应程序进行优化, 特别是对引物和探针浓度进行筛选, 以获得最低的 Ct 值和较高的荧光强度增加值 ( Rn) 选用 μmol/l 的引物终浓度和 μmol/l 的探针终浓度, 采用矩阵法检测阳性病毒核酸, 筛选引物和探针的最佳浓度定量标准曲线的建立利用构建好的 PMD18-toxR 重组质粒作为副溶血弧菌定量标准品, 对定量标准品进行 10 倍梯度稀释 6 个梯度, 利用优化好的荧光 PCR 反应体系检测各梯度标准品的 Ct 值, 建立质粒拷贝浓度与 Ct 值对应关系的定量标准曲线荧光定量 PCR 的特异性以黄色葡萄球菌伤寒杆菌变形杆菌沙门氏菌单增李斯特杆菌志贺氏菌阪崎肠杆菌阴沟肠杆菌等 16 株食物中常见的细菌作为阴性对照菌株, 并用高纯水作为无模板空白对照 (No template control, NTC) 验证荧光 PCR 法检测副溶血弧菌的特异性荧光定量 PCR 的敏感度对已知拷贝数的含有目的扩增片段的 PMD18- toxr 重组质粒进行 10 倍梯度极限稀释, 对各稀释度进行荧光 PCR 检测, 从而确定该方法对靶基因的最低检出限为评价该方法对细菌纯培养物的检测灵敏度, 将副溶血弧菌标准菌液利用平板计数, 测定原始菌液浓度, 再按 10 1 ~10 6 倍数梯度稀释, 对每个梯度菌液各取 1 ml 分别提取细菌基因组 DNA 后进行荧光 PCR 检测为评价该方法对实际食品样品的检测灵敏度, 选取国标法预检为副溶血弧菌阴性的鱼肉虾肉 10 g 与 90 ml 碱性蛋白胨水制成匀浆, 取 10 ml 鱼虾肉匀浆 7 份, 分别接入 1 ml 上述倍数梯度稀释的副溶血弧菌菌液, 混匀作为模拟食品样品, 各取 1 ml 提取细菌基因组 DNA, 进行荧光 PCR 检测荧光定量 PCR 的重复性通过在同一试验内和不同试验间对同一样品检测的 Ct 值变异系数 ( 标准偏差 / 重复值的平均数 ) 来初步评估该方法的重复性检测方法的初步应用利用本研究建立的 VP RT-PCR 方法, 对 135 份海产品样本进行检测并与国标法作比较 2 结果 2.1 定量标准品的制备纯化后的 toxr 基因重组质粒经测序结果表明重组质粒所含的 toxr 序列与我们选取的 toxr 基因靶序列完全一致经分光光度计测定后, 确定其浓度为 65 ng/μl, OD 260 /OD 280 为 1.823, 证明该重组质粒的纯度很高根据阿弗加德罗常数换算出每 μl 重组质粒的拷贝数为 : copy 用双蒸水将上述已知拷贝数的重组质粒稀释到 copy/μl 作为定量标准品原液保存 2.2 副溶血弧菌 RT-PCR 反应条件的优化引物和探针浓度筛选试验结果表明, 采用 0.6 μmol/l 的引物浓度和 0.2 μmol/l 的探针浓度进行检测, 获得的 Ct 值最小且荧光增加值 ( Rn) 较大, 确定引物和探针的最佳浓度分别为 0.6 μmol/l 和 0.2 μmol/l 对荧光定量 PCR 反应体系中其余各组分浓度进行优化, 最终确定优化后的 VP 荧光 PCR 反应体系配制如下 ( 表 2) 优化后的反应程序为: 95 o C 变性 2 min, 以 95 o C 15 s, 60 o C 1 min( 收集 FAM 荧光信号 ) 扩增 40 个循环, 反应时间为 1.5 h 表 2 Table 2 Component 筛选优化后的荧光定量 PCR 反应体系 Optimized Real-time quantitative PCR reaction system Volume (μl) Final concentration Taq enzyme u 10 PCR buffer(mg 2+ Plus) dntp micture (2.5 mmol/l each) mmol/l Primer vp1231(10 μmol/l) μmol/l Primer vp1286(10 μmol/l) μmol/l Probe vp1259(10 μmol/l) μmol/l Template 5.0 Total volume 25.0

1840 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech October 25, 2008 Vol.24 No.10 2.3 定量标准曲线的建立利用优化好的副溶血弧菌 RT-PCR 反应体系对 6 个 10 倍梯度稀释的定量标准品进行检测, 建立质粒拷贝浓度的对数值与 Ct 值对应关系的定量标准曲线 ( 图 1) 实验结果显示, 所制作的标准曲线在 2.

4 1840 ISSN CN /Q Chin J Biotech October 25, 2008 Vol.24 No 定量标准曲线的建立利用优化好的副溶血弧菌 RT-PCR 反应体系对 6 个 10 倍梯度稀释的定量标准品进行检测, 建立质粒拷贝浓度的对数值与 Ct 值对应关系的定量标准曲线 ( 图 1) 实验结果显示, 所制作的标准曲线在 ~ 拷贝数之间有较好的线性关系, 相关系数为 , 斜率约为 , 截距为 , 得出细菌拷贝数与 Ct 值的线性方程为 : Ct = Log concentration 在对样品进行检测时, 根据其 Ct 值和线性方程就可获得该样品 DNA 拷贝数图 1 定量标准曲线 Fig. 1 Standard dilution series of quantitative 2.4 VP FQ-PCR 的特异性检测利用本研究建立的副溶血弧菌 FQ-PCR 检测方法对 7 株副溶血性弧菌标准菌株和金黄色葡萄球菌伤寒杆菌变形杆菌沙门氏菌单增李斯特杆菌志贺氏菌阪崎肠杆菌阴沟肠杆菌等 16 株阴性对照菌株进行检测, 结果显示只有副溶血性弧菌标准菌株出现典型的扩增曲线, 而其他 16 株菌株和空白对照均为一平直的线, Ct 值无法读取 (Undet.), 判为阴性 ( 表 3) 该检测结果与传统的生化检测方法结果完全一致 2.5 VP RT-PCR 的灵敏度重组质粒检测灵敏度用双蒸水将已知拷贝数的 toxr 基因重组质粒作十倍系列稀释, 取各个稀释度作荧光 PCR 检测确定其最低检出限, 结果表明该检测方法至少能检测到 25 个 DNA 拷贝数 ( 图 2) 细菌纯培养物和模拟食品样品直接检测灵敏度经平板计数, 原始菌液浓度为 cfu/ml, 按 10 1 ~10 7 倍数梯度稀释菌液后取 1 ml 提取细菌基因组 DNA 进行荧光 PCR 检测, 实验结果表明, 该法至少能检测到的细菌纯培养物浓度为 21 cfu/ml, 根据 Ct 的读数和绝对定量线性方程换算, 最低检出限的实际浓度相当于 17 cfu/ml 表 3 副的溶血弧菌荧光 PCR 检测方法特异性实验结果 Table 3 Results of VP RT-PCR specificity Microorganissms Number Ct Value Detection of tradition SZCIQ SZCIQ SZCIQ SZCIQ SZCIQ SZCIQ SZCIQ Campylobacter jejuni ATCC 5621 Undet. Staphylococcus aureus SZCIQ 6538 Undet. E. coli O157:H7 SZCIQ Undet. E. coli JM109 SD 8410 Undet. Salmonella spp. SZCIQ 8385 Undet. Salmonella spp. ATCC9089 Undet. Salmonella spp. ATCC14028 Undet. Listeria monocytogenes SZCIQ7644 Undet. Listeria monocytogenes ATCC19115 Undet. Shigella dysenteriae SZCIQ 4376 Undet. Shigella flexneri SZCIQ 2973 Undet. Enterobacter sakazakii SZCIQ 0013 Undet. Enterobacter cloacae SZCIQ Undet. Klebsiella oxytoca SZCIQ Undet. cholerae O1 SZCIQ 7326 Undet. cholerae O139 SZCIQ 5144 Undet. a results of FQ-PCR; +: positive result; : negative result 将上述倍比稀释的菌液加入鱼虾肉匀浆制作成模拟食品样品, 然后再抽提核酸进行荧光 PCR 检测, 发现其能够检测的最低菌液浓度为 cfu/ml, Ct 读数为 32.87, 根据绝对定量标准曲线换算, 其实际浓度相当于 59 cfu/ml( 表 4)

5 覃倚莹等 : toxr 基因作为荧光定量 PCR 靶基因设计 TaqMan 探针快速检测副溶血弧菌 1841 Fig. 2 图 2 VP 荧光定量 PCR 灵敏度实验 Sensitivity for detection of VP by real-time quantitative PCR Gradient concentration Table 4 表 4 副溶血性弧菌荧光 PCR 检测灵敏度 Sensitivity for detection of VP by real-time quantitative PCR Bacteria Detect of pure culture of bacteria Detect of simulated food sample concentration (cfu/ml) Ct Value Measured concentration (cfu/ml) a Ct value Measured concentration (cfu/g) a Undet Undet. Undet. a: convert to measured concentration according to Ct value and quantitative linear formula Fig. 3 图 3 同一样品重复 30 次的检测结果 Results of 30 repetitious detections by the same samples 2.6 VP RT-PCR 稳定性和重复性实验细菌为评估该检测方法的重复性, 本研究对同一阳性样品在同一次实验和不同实验间获得的 Ct 值进行了统计, 结果显示, 同一次实验内 30 个平行样的扩增曲线在阈值线附近基本上是重合的 ( 图 3), Ct 值读数范围为 20.75~21.18, 标准偏差为 0.126, 变异

6 1842 ISSN CN /Q Chin J Biotech October 25, 2008 Vol.24 No.10 系数为 0.9%; 同一样品在 30 次不同实验内所获的 Ct 值也基本一致, Ct 值读数范围在 20.75~21.97 之间, 标准偏差为 0.245, 变异系数为 1.3% 以上统计表明本研究所建立的副溶血弧菌荧光定量 PCR 检测方法重复性好, 可对副溶血弧菌进行稳定可靠的检测 2.7 副溶血弧菌荧光 RT-PCR 方法的临床检测利用本研究建立的 VP RT-PCR 方法, 对 135 份海产品样本进行检测, 结果显示有 12 份成阳性反应, 与国标法检测结果符合率为 100%, 实验结果表明, 该荧光 PCR 方法具有广泛而良好的适用性 3 讨论本研究根据副溶血性弧菌中的特异性基因 toxr 基因, 选取其中保守片断作为荧光 PCR 扩增的靶基因, 由于 toxr 基因和引物探针的高度特异性的三重保证, 使其对副溶血性弧菌的检测具有高度特异性, 实验结果也证明了基于 toxr 基因的 RT-PCR 检测特异性为 100% 常用的副溶血性弧菌快速检测方法存在着假阳性或交叉污染等问题, 特异性无法达到 100%, 而荧光 PCR 方法不存在上述问题, 所以研究建立的实时荧光 PCR 在特异性上具有较大优势本研究所建立的荧光 PCR 的灵敏度达到 25 个 DNA 拷贝数, 对纯培养物和模拟食品样品直接检测的灵敏度分别为 21 cfu/ml 和 210 cfu/g, 已经接近灵敏度的极限, 与常用的快速检测方法的 10 2 ~10 3 cfu/ml 相比较, 具有很大的优势重复性试验结果表明, 同一样品在组内及组间的 Ct 值变异系数分别为 0.9% 以及 1.3%, 良好的重复性好保证了对样品进行稳定可靠的检测同时由于无需电泳检测不使用溴化乙锭, 保障了试验人员的安全, 而且在检出时间上要比传统检测方法大大缩短, 从细菌基因组提取到荧光 PCR 反应完成只需要 3 h 的时间, 常用的快速检测方法需要 3~6 h, 因此本实验建立的方法检测效率有所提高, 特别适合大规模的样品快速检测 [8,9] 因此, 与常用的快速检测副溶血性弧菌方法相比, 本研究所建立的荧光 PCR 检测方法具有较大的优势, 不仅灵敏度高特异性强操作简单需时短, 而且不受假阳性交叉污染等干扰, 将为副溶血性弧菌进行流行病学调查提供有力的工具, 适用于进出口检验检疫食品安全检测病原体的临床诊断 ( 疾病的临床早期诊断, 病原微生物的含量分析等 ) 基础理论研究(SNP 筛查, 基因分型等 ) 等领域, 应用前景广阔 REFERENCES [1] Dun YH, Xu JS, Wu H, et al. Separation and verification of from imported iced inkfish. Port Health Contr, 2007, 2(3): 顿玉慧, 徐建设, 吴海, 等. 进境冻墨鱼中副溶血性弧菌的分离及鉴定. 口岸卫生控制, 2007, 2(3): [2] Cheng SY, Luo Y, Ye JL, et al. Study on rapid detection of. Dis Surv, 2007, 22(9): 程苏云, 罗芸, 叶菊莲, 等. 副溶血性弧菌快速检测方法研究. 疾病监测, 2007, 22(9): [3] Espy MJ, Uhl JR, Sloan LM, et al. Real-time PCR in clinical microbiology: Applications for routine laboratory testing. CMR, 2006, 19(1): [4] Valasek MA, Repa JJ. The power of real-time PCR. Adv Physiol Educ, 2005, 29: [5] Weng WC, Jiao H, Wang FJ, et al. Rapid detection of in food by fluorescence quantitative PCR. Chin J Public Health, 2005, 21(11): 翁文川, 焦红, 王方金, 等. 食品中副溶血弧菌荧光定量 PCR 方法快速检测. 中国公共卫生, 2005, 21(11): [6] Chen L, Zhang HH, Cao HF. Detection of by the fluorescence quantitative PCR assay targeting TLH and TDH gene. Lab Med, 2007, 22(4): 陈丽, 张红河, 曹海芬. 荧光聚合酶链反应检测副溶血弧菌 TLH 与 TDH. 检疫医学, 2007, 22(4): [7] Wang XY, Feng JW, Wu XL, et al. Study on the detection of using real-time PCR method. Food Res Dev, 2007, 28(6): 王小玉, 冯家望, 吴小伦, 等. 实时荧光 PCR 方法检测副溶血性弧菌的研究. 食品研究与开发, 2007, 28(6): [8] Dou Y, Ning XB, Hu PH. The Application of ELISA in the analysis of aquatic microorganism. Food Res Dev, 2006, 27(8): 窦勇, 宁喜斌, 胡佩红. ELISA 在水产微生物检测中的应用. 食品研究与开发, 2006, 27(8): [9] Li MX, Jiang YL. Pollution situation and quickly examination of vibrio. Port Health Contr, 2007, 12(2): 李铭新, 姜义霖. 副溶血性弧菌污染现状及快速检测. 口岸卫生控制, 2007, 12(2):

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na 河南农业科学,2013,42(2):123-127 JournalofHenanAgriculturalSciences PCR PRRSV CSFV PCV2,, (, 450011) : 根据 TaqMan 复合荧光探针设计原则, 应用 Primer5.0 和 Oligo6.0 软件设计检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 猪瘟病毒 (CSFV) 和猪圆环病毒 2 型 (PCV2) 的特异性引物和探针,