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泱袁
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1 第 8 卷第 9 期食品安全质量检测学报 Vol. 8 No 年 9 月 Journal of Food Safety and Quality Sep., 2017 核酸法在食源性致病菌检测中的研究进展孙 * 晶 ( 辽宁省分析科学研究院, 沈阳 ) 摘要 : 食源性疾病是指通过摄食而进入人体的致病因素使人患上感染性或中毒性的疾病, 主要是由食源性致病菌引起的, 包括细菌病毒和真菌分析食物中存在的食源性致病菌对于食品安全和降低食源性疾病的发生至关重要传统的以培养为基础的检测食源性致病菌的方法灵敏度低检测周期长本文介绍的基于核酸的检测方法克服了传统方法在检测和鉴定方面的限制, 具有特异性强灵敏度高操作简单检测周期短等特点核酸法主要包括普通 PCR 法多重 PCR 法实时荧光 PCR 法核酸依赖性扩增环介导等温扩增和基因芯片技术等本文主要概述了核酸法在国内外食源性致病菌检测中的应用情况, 总结了其优势和不足, 同时对核酸法的发展趋势进行了展望关键词 : 食源性致病菌 ; 检测方法 ; 核酸法 Research progress of nucleic acid-based methods for detecting foodborne pathogens SUN Jing * (Liaoning Province Academy of Analytic Sciences, Shenyang , China) ABSTRACT: Foodborne diseases are caused by agents which enter the body through the ingestion of food. Most of them are infectious or toxic and are caused by foodborne pathogens which include bacteria, fungi and viruses. It is important to analyze foodborne pathogens in food in order to ensure food safety and minimize foodborne diseases. The conventional methods for detecting the foodborne pathogens are based on culture which are time-consuming and low sensitivity. This paper discussed the nucleic acid-based methods which were greatly sensitive, specific, time-saving and easy to operate, including PCR, multiple PCR, real-time quantitative PCR, nuclear acid sequence-based amplification, loop-mediated isothermal amplification and gene chips. It also summarized the applications of nucleic acid-based methods in foodborne pathogens testing, emphasized on the advantages and limitations, and prospected for the trend of future development of nucleic acid-based methods. KEY WORDS: foodborne pathogens; detection method; nucleic acid-based methods 1 引言食源性疾病是世界性的公共健康问题, 其大规模爆发在许多国家都经常发生 [1-4] 全球化的食品供应意味着食源性疾病可以在不同的国家快速传播蔓延, 严重危害人类健康 [5-8] 目前世界上大概有 250 种食源性疾病 [9] 高发病基金项目 : 辽宁省自然科学基金 ( ) Fund: Supported by Liaoning Province Natural Science Foundation ( ) * 通讯作者 : 孙晶, 博士, 副研究员, 主要研究方向为食品质量安全及致病菌检测 jingjing @163.com *Corresponding author: SUN Jing, Ph.D, Associate Professor, Liaoning Province Academy of Analytic Sciences, No.103, Wanliutang Road, Shenhe District, Shenyang , China. jingjing @163.com

2 3410 食品安全质量检测学报第 8 卷率以及特定人群如婴幼儿老人免疫力低下者中的高致死率是其主要特点 [10] 食源性疾病基本上都是由摄入被细菌病毒寄生虫或有毒的化学物质生物毒素污染的水和食物等引起的 [11,12] 引起食源性疾病的致病菌叫做食源性致病菌, 主要包括细菌真菌和病毒 [10] 我国生物性食物中毒事件中, 弯曲杆菌沙门氏菌副溶血性弧菌单增李斯特菌大肠杆菌 O157:H7 金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌是主要的食源性致病菌, 与多数食源性疾病的爆发有关 [13-17] 在致病菌的检测方法中, 传统的平板培养法是广泛使用的方法其优点是操作简单成本低缺点是检测灵敏度低, 工作量大, 检测周期长, 每次只能检出 1 种致病菌 [18] 对于活的非可培养状态细菌, 传统的培养法会引起假阴性结果的产生, 造成漏检, 增加食源性疾病的传播几率目前, 已有 34 个属的 68 种细菌被证实可进入这一状态并保持毒力或致病性 [19,20] 核酸法是食源性致病菌检测中普遍采用的一类方法, 通过设计引物或探针, 检测目标致病菌的特异 DNA 或 RNA 序列其特点是快速准确灵敏, 能够实现样品的痕量检测, 在食品检验及食品突发事故应急处理中发挥重要作用本文主要对核酸法在食源性致病菌检测中的研究进展进行概述 2 核酸法种类核酸法主要包括普通聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR), 多重 PCR(multiplex PCR, mpcr), 实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR, qpcr), 核酸依赖性扩增 (nuclear acid sequence-based amplification, NASBA), 环介导等温扩增 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 和基因芯片等 [18,21] 2.1 普通 PCR 法普通 PCR 是用一对寡核苷酸片段作为引物, 在 DNA 聚合酶的作用下, 按照半保留复制机制, 通过变性退火延伸的多次循环, 扩增目的片段我国出入境检验检疫行业标准 SN/T [22] 规定了食品中多种致病菌的快速检测 PCR 法, 主要有沙门氏菌志贺氏菌金黄色葡萄球菌小肠结肠炎耶尔森菌单增李斯特菌空肠弯曲杆菌肠出血性大肠埃希氏杆菌 O157:H7 副溶血性弧菌霍乱弧菌和创伤弧菌普通 PCR 法的优点是耗时短, 操作步骤简单不足是易受 PCR 抑制剂影响, 造成扩增效果不理想 ; 只能鉴定单一致病菌 ; 不能区分活细胞和死细胞, 丧失活性的死细胞可作为 PCR 反应的模板, 可能出现假阳性 [18,21] 2.2 mpcr 法 mpcr 可同时扩增出多个核酸片段, 它是在同一反应体系中加 2 对以上特异性引物, 可同时检测多种致病菌进行微生物种属鉴定及分型与普通 PCR 不同的是, mpcr 涉及多对引物和不同模板, 所以在实验初期要对反应体系进行优化 [21] 研究发现分别以 inva stx 和 hyla 作为靶基因进行 mpcr, 可同时快速检测食品中沙门氏菌单增李斯特菌和大肠杆菌 O157:H7 [23] [24] Ranjbar 等采用 mpcr 实现了同时对志贺氏菌属的 [25] 福氏鲍氏和宋内氏志贺菌的鉴定冯可等建立可同时检测鲜切哈密瓜中单增李斯特菌鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌 O157:H7 的 mpcr 法, 为快速检测鲜切哈密瓜中致病菌提供参考依据此外, mpcr 还可同时对低脂牛奶中单增李斯特菌大肠杆菌 O157:H7 蜡样芽胞杆菌沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行检测 [26] 我国出入境检验检疫行业标准 SN/T [27] 规定, 出口食品及水体中产毒副溶血性弧菌的检测采用 mpcr 法 mpcr 法的优点是可同时检测多个致病菌不足是易受 PCR 抑制剂影响 ; 不能区分活细胞和死细胞 ; 对引物设计要求较高 [18,21] 2.3 qpcr 法 qpcr, 即实时监测 PCR 扩增产物并进行解析的方法, 是在反应体系中加入荧光物质, 并通过实时检测系统对反应进程中的荧光信号强度进行监测, 并对实验数据进行分析处理的方法, 主要包括荧光嵌合法和荧光探针法 2 类 [28] 初始细菌 DNA 模板的浓度可低至 10-5 ~10-6 数量级 [29] [30] Zhang 等设计特异性引物和探针, 利用 qpcr 法检测空肠弯曲杆菌, 以细菌培养中纯化的 DNA 为模板, 检测限为 4.3 CFU/mL 我国出入境检验检疫行业标准 SN/T [31] 规定了出口食品中 12 种致病菌检测 qpcr 法随着 PCR 技术的不断发展, 在 qpcr 技术的基础上又衍生 [32] 出了多重荧光 PCR 技术 Barletta 等采用多重荧光 PCR 法同时检测沙门氏菌 inva 志贺氏菌 ipah 和空肠弯曲杆菌 16S rrna 基因, 检测限为 10 3 [33] CFU/g Park 等以 hyla tlh vvha 为靶基因设计特异性引物和探针, 利用多重荧光 PCR 法同时检测霍乱弧菌副溶血性弧菌和创伤弧菌, 此法还应用到检测环境样本中的弧菌属 qpcr 法的优点是灵敏度高 ; 特异性好 ; 可实时检测扩增产物不足是易受 PCR 抑制剂影响 ; 荧光素种类及检测光源的局限性, 相对限制了 qpcr 的复合检测 ; 耗材贵, [18,21] 成本较高 ; 不能区分活细胞和死细胞 2.4 NASBA 法 NASBA 是一种能在等温条件下进行序列特异性核酸体外扩增的技术该技术是由 2 个特异性引物 (P1: 3 端与靶序列互补, 5 端具有被 RNA 聚合酶识别的启动子序列 ; P2: 5 端序列与靶 RNA 序列相同 ) 介导的, AMV 反转录酶 T7 RNA 聚合酶 RNase H 催化的以单链 RNA 为模板的恒

3 第 9 期孙晶, 核酸法在食源性致病菌检测中的研究进展 3411 温扩增技术, 2 h 内可将模板 RNA 扩增约 10 9 倍, 整个过程在水浴条件下完成 [34] [35] 雷质文等采用沙门氏菌 inva 基因为目的片段设计特异性引物, 建成可快速检测沙门氏菌的 NASBA 法, 灵敏度为 [36] CFU/mL, 高于普通 PCR 法倪鑫等以 tlh 基因为靶基因设计特异性引物和探针, 建立快速扩增副溶血性弧菌的 NASBA 方法, 最小检出量为 CFU/mL, 高于普通 PCR 法, 且特异性好, 与其他种属的 [37] 菌无任何交叉反应钟响等建立了针对志贺氏菌的 NASBA 法, 根据志贺氏菌侵袭性质粒抗原 ipah 基因设计引物, 扩增得单一目的条带, 灵敏度高, 检出限为 8.2 pg/μl, 且检测周期短, 适用于国境口岸现场快速检测 NASBA 简单便捷, 保真性高, 灵敏度好, 成本低, 已成功应用于病毒细菌霉菌寄生虫和细胞因子等的检测 [38] NASBA 的优点是成本低 ; 不需要热循环仪 ; 可检测活细胞不足是扩增产物是单链 RNA, 后续操作复杂 [18,21] 2.5 LAMP 法 LAMP 是近些年发展起来的一种快速高效核酸等温扩增技术, 其原理是设计 4 条特异性引物, 在 Bst DNA 聚合酶的作用下, 使模板两端引物的结合处循环出现环状单链结构, 以实现恒温条件下 (60~65 ) 的连续快速扩增, 通过电泳分析荧光定量检测副产物焦磷酸镁浊度检测荧光目测比色等判断扩增结果该技术已广泛应用于病原微生物转基因以及食源性致病菌检测 [39] [40] 胡元庆等以 tlh 为靶基因设计 4 条特异性引物, 建立了检测副溶血性弧菌的 LAMP 方法, 检测限为 1 [41] CFU/mL 曹科峰等利用铜绿假单胞菌 gbca 基因, 设计 3 对引物快速检测铜绿假单胞菌, 灵敏度好, 未出现非特异性扩增我国已发布的进出口行业检测标准 SN/T [42] 中, 共有 15 种致病菌的检测运用了 LAMP 法 LAMP 法的优点是成本低, 不需要热循环仪不足是引物设计复杂 ; 不适用于未知物的检测 ; 不能进行长链 DNA 扩增 [18,21] 2.6 基因芯片法基因芯片技术是利用核酸分子碱基之间互补配对的原理, 微生物样品 DNA 经 PCR 扩增并荧光标记后, 与芯片上的寡核苷酸杂交, 通过检测杂交信号的强弱确定样品中微生物的存在与丰度 [43] [43] 程晓燕利用基因芯片技术同时检测金黄色葡萄球菌沙门氏菌副溶血性弧菌志贺氏菌单增李斯特菌蜡样芽胞杆菌和溶藻弧菌, 灵敏度比常规 PCR 法高 10 [44] 倍罗宇鹏利用基因芯片技术同时检测志贺氏菌沙门氏菌肺炎克雷伯菌布鲁氏菌奇异变形菌金黄色葡萄球菌和空肠弯曲杆菌, 细菌纯培养物灵敏度为 CFU/mL, 检测分离菌株符合率为 100%, 为高通量筛查检测病原菌提供思路我国出入境检验检疫行业标准 SN/T [45] 规定了 11 种食源性致病菌的基因芯片鉴定方法基因芯片的优点是准确快速高通量, 可检测特异性血清型, 自动化程度高不足是成本较高, 不能区分活细胞和死细胞, 需要寡核苷酸探针, 需要标记靶基因 [18,21] 3 结论微生物性食源性疾病是全球食品安全问题之首食品作为载体可传播多种食源性疾病, 增加某些食源性疾病大规模爆发的危险我国国标中食源性致病菌的检测多沿用传统方法, 检测周期长, 难以应对和控制大规模食源性疾病的爆发核酸法是目前广泛使用的有效检测食源性致病菌方法之一, 其特点是特异性好灵敏度高操作简单但是在技术上也存在着一定的不足, 如易污染 ; 易出现假阳性或假阴性 ; 食品基质影响致病菌 DNA 的分离和提取, 造成漏检等针对不同类食品中的食源性致病菌, 将核酸法与免疫学遗传学生物信息学计算机技术自动化等相结合以实现样品的快速高通量检测是未来检测技术的发展方向目前, 基于多学科领域的全自动微生物分析系统被广泛使用, 实现了对食源性致病菌快速精准的检测, 不足是价格昂贵, 检测成本高因此, 对检验工作者来说, 需要根据具体的实际情况选择合适的微生物鉴定方法, 同时为了更加迅速准确的确定病原微生物, 可以多种方法联合使用与此同时, 需要科研人员以核酸法为基础, 在检测仪器研发方面不断的进行技术创新, 在不影响特异性和灵敏度的前提下使食源性致病菌的检测达到简易经济的水平参考文献 [1] Quade P, Nsoesie EO. A platform for crowdsourced foodborne illness surveillance: description of users and reports [J]. JMIR Pub Health Surveill, 2017, 3(3): e42. [2] Billington C, Hudson JA, D Sa E. Prevention of bacterial foodborne disease using nanobiotechnology [J]. Nanotechnol Sci Appl, 2014, 7(7): [3] Bancerz-Kisiel A, Szweda W. Yersiniosis-A zoonotic foodborne disease of relevance to public health [J]. Ann Agric Environ Med, 2015, 22(3): [4] Nguyen VD, Bennett SD, Mungai E, et al. Increase in multistate foodborne disease outbreaks-united States, [J]. Foodborne Pathog Dis, 2015, 12(11): [5] Tauxe RV, Doyle MP, Kuchenmüller T, et al. Evolving public health approaches to the global challenge of foodborne infections [J]. Int J Food Microbiol, 2010, 139(S1): S16 S28. [6] Kirk MD, Pires SM, Black RE, et al. World Health Organization estimates of the global and regional disease burden of 22 Foodborne bacterial,

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Microsoft Word _朱静鸿-二校 30 7 1 Vol. 7 No. 1 2016 1 Journal of Food Safety and Quality Jan., 2016 2013~2014 朱静鸿 *, 龚云伟, 李月婷, 武艳立 (, 130033) 摘要 : 目的方法 2013 结果 2013~2014 11 433, 74, 17.09%, 42 21 9 2 2013 2014 (x 2 =0.09, P>0.05)