现代药物与临床 Drugs & Clinic 第卷第 7 期 5 年 7 月 8 绞肠痧脾脏病乳蛾等症 [] 本课题组前期已对黄花草木犀进行了化学成分研究, 结果显示草木犀中主要含有和黄酮苷类成分 [] 类成分是黄花草木犀发挥疗效的主要药效成分, 该类成分能够减轻由于各种原因造成的毛细血管壁通

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1 8 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第卷第 7 期 5 年 7 月大孔吸附树脂纯化黄花草木犀的工艺研究韩璐, 杨杰, 4,, 王丽莉 5, 周鑫堂, 张铁军. 天津中医药大学, 天津 9. 沧州市中心医院, 河北沧州 6. 天津药物研究院, 天津 9 4. 天津市中药质量控制技术工程实验室, 天津 9, 4, 5* 5. 中药现代制剂与质量控制技术国家地方联合工程实验室 ( 天津 ), 天津 9 摘要 : 目的考察黄花草木犀中和的最佳大孔吸附树脂的纯化工艺方法通过对不同型号大孔树脂的考察优选出纯化黄花草木犀中药效成分的最佳树脂类型, 并对其最大上样量上样体积流量洗脱溶剂体积分数和洗脱溶剂最佳用量进行优化结果经过筛选确定 HPD- 大孔树脂为纯化黄花草木犀药效成分的最优树脂类型, 其最佳纯化条件 : 树脂的上样量为.4 g 生药 /g 树脂, 上样体积流量为. BV/h, 依次用 BV 水洗脱和 7 BV 5% 乙醇洗脱在此条件下质量分数提升了 7.8 倍, 平均收率为 85.8% 结论 HPD- 大孔树脂用于纯化黄花草木犀中稳定性高重复性好关键词 : 黄花草木犀 ; 大孔吸附树脂 ; ;; ; 纯化中图分类号 :R84. 文献标志码 :A 文章编号 : (5) DOI:.75/j.issn Purification of Melilotus officinalis by macroporous resins HAN Lu, YANG Jie, WANG Li-li, 4, 5, ZHOU Xin-tang, 4, 5, ZHANG Tie-jun. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 9, China. Cangzhou Central Hospital, Cangzhou 6, China. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 9, China 4. Tianjin Engineering Laboratory of Quality Control Technology of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 9, China 5. National & Local United Engineering Laboratory of Modern Preparation and Quality Control Technology of Traditional Chinese Medicine (Tianjin), Tianjin 9, China Abstract: Objective To investigate the optimum purification process of the active ingredients rutin,, and coumarin in Melilotus officinalis by macroporous resins. Methods The various types of resins were selected with purification of the active ingredients rutin,, and coumarin in M. officinalis as index. The parameters, such as sample loading maximum volume, sample loading velocity, elution solvent concentration, and elution solvent volume of optimized resin were studied. Results HPD- type macroporous resin was selected as the best type of resin for the purification of active ingredients in M. officinalis. The optimum purification conditions were as following: the sample loading maximum volume was.4 g/g macroporous resin, sample loading velocity was. BV/h, and the sample was eluted by water with BV and 5% ethanol with 7 BV, respectively. Rutin, and coumarin proportion promoted 7.8 times after the purification HPD- by macroporous resin, and the yield was 85.8%. Conclusion HPD- macroporous resin is suitable for the purification of rutin,, and coumarin in M. officinalis with high stability and good repeatability. Key words: Melilotus officinalis (L.) Pall.; macroporous resin; rutin; ; coumarin; purification 黄花草木犀又名辟汗草, 为豆科草木犀属植物黄花草木犀 Melilotus officinalis (L.) Pall. 干燥地上部分, 现收录于生部药品标准藏药标准, 味苦凉, 具有清热解毒消炎消肿功效, 用于治疗白喉收稿日期 :5-- 作者简介 : 韩璐 (99 ), 女, 蒙古族, 辽宁兴城人, 中药学学专业硕士研究生 Tel: @6.com * 通信作者张铁军 Tel: () tiejunzh@yahoo.com.cn

2 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第卷第 7 期 5 年 7 月 8 绞肠痧脾脏病乳蛾等症 [] 本课题组前期已对黄花草木犀进行了化学成分研究, 结果显示草木犀中主要含有和黄酮苷类成分 [] 类成分是黄花草木犀发挥疗效的主要药效成分, 该类成分能够减轻由于各种原因造成的毛细血管壁通透性增加, 阻止血清蛋白丧失, 维持正常的胶体渗透压, 起到抗水肿作用 [-4] ; 黄酮苷类成分 ( ) 同样具有较好的抗炎镇痛和止血作用 [5-7] 目前市售的由黄酮苷类成分开发的制剂如片 ( 止血药 ) 地奥司明片( 痔疮肿胀等症 ) 在临床上用于治疗痔疮静脉疾病等的肿胀疼痛, 疗效确切本实验以黄花草木犀中主要药效成分和黄酮苷为指标, 对黄花草木犀进行纯化工艺研究近些年大孔树脂在天然产物的分离纯化中应用极广, 是提取分离中药有效成分的一种有效方法 [8] 本实验通过优选黄花草木犀中药效成分的树脂纯化工艺技术参数, 为以后大孔树脂在纯化黄花草木犀中药效活性部位的研究中提供参考仪器与材料 UV 6LP HPLC 高效液相色谱仪 ( 天津兰博实验室仪器设备有限公司 ),AB4 N 电子分析天平 (Mettler Toledo), 超声清洗仪 ( 奥特宝恩斯仪器有限公司 ), 旋转蒸发仪 ( 无锡市星海王生化设备有限公司 ), 玻璃色谱柱 ( cm. cm, 天大玻璃仪器厂 ), 金怡 CHA S 气浴恒温振荡器 ( 江苏金坛市医疗器械厂 ),6 摇摆式六两装高速中药粉碎机 ( 瑞安市永历制药机械有限公司 ),PTHW 型电热套 ( 巩义市予华仪器有限责任公司 ) 大孔树脂 NKA-9 AB-8 D-( 天津南开大学化工厂 ),HPD- HPD-4( 沧州宝恩吸附材料科技有限公司 ) 黄花草木犀购自内蒙古, 经天津药物研究院张铁军研究员鉴定为豆科植物黄花草木犀 Melilotus officinalis (L.) Pall. 的干燥地上部分, 对照品 ( 批号 8-77, 由中国食品药品检定研究院提供, 质量分数 >98.%); 对照品 ( 批号 JOT-55, 由四川省维克奇生物科技有限公司提供, 质量分数 >98%); 对照品为自制, 经色谱及光谱分析确认 [9], 质量分数为 98% 以上 ; 水为纯净水, 甲醇乙腈为色谱纯, 其他试剂均为分析纯方法与结果. 黄花草木犀中成分的测定.. 色谱条件与系统适用性色谱柱 Ultimate XB-C 8 色谱柱 (5 mm 4.6 mm,5 μm); 流动相为乙腈 (A).5% 乙酸水 (B), 梯度洗脱,~5 min,% A,5~5 min,4% A,5~6 min, % A,6~9 min,% A,9 min 以后,8% A; 柱温 ; 体积流量. ml/min; 检测波长 54 nm; 进样量 μl.. 对照品溶液的制备分别取对照品适量, 置 5 ml 量瓶中, 加甲醇至刻度, 配制成含质量浓度分别为 mg/ml 的混合对照品溶液, 摇匀, 备用.. 供试品溶液的制备称取黄花草木犀药材粉末 ( 过 4 目筛 ) g, 置具塞锥形瓶中, 精密加入 7% 甲醇 5 ml, 称定质量, 超声处理 min, 放冷至室温, 再称定质量, 并用 7% 甲醇补足减失的质量, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 即得..4 线性关系考察分别精密吸取上述对照品 ml 置 ml 量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 配制成不同质量浓度的混合对照品溶液按以上色谱条件进行测定以质量浓度为横坐标, 峰面积积分值为纵坐标, 进行线性回归, 得回归方程 :Y= X , r=.999 9;:Y= X+6 6.5, r=.999 9; :Y= X , r= 结果表明在.75 ~~.9 mg/ml, 在. ~.78 mg/ml, 在.46 ~4.96 mg/ml 均呈良好的线性关系..5 精密度试验精密吸取混合对照品溶液 μl, 按以上色谱条件连续进样 6 次, 测定各成分的峰面积, 结果和峰面积的 RSD 值分别为.%.6%.%..6 重复性试验取黄花草木犀药材粉末 ( 过 4 目筛 ) 约. g, 平行称定 6 份, 制备供试品溶液, 进样测定色谱峰面积, 计算种化合物的质量分数结果显示和质量分数的 RSD 值分别为.58%.%.6%..7 稳定性试验精密吸取黄花草木犀药材粉末供试品溶液 μl, 室温放置, 在 h 进样分析, 测定色谱峰面积, 计算得和总峰面积和的 RSD 值分别为.66%.44%.5%.8% 结果表明, 供试品溶液在室温密封放置 4 h 的稳定性良好..8 加样回收试验称取黄花草木犀药材粉末

3 8 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第卷第 7 期 5 年 7 月 ( 过 4 目筛 ).5 g, 分别加入适量的混合对照品溶液, 制备供试品溶液, 按以上色谱条件测定, 计算回收率, 结果和回收率分别为.9% 98.% 99.4%,RSD 值分别为.6%.5%.6%..9 黄花草木犀药材中指标成分的测定称取黄花草木犀药材粉末 ( 过 4 目筛 ) g, 制备供试品溶液另取混合对照品溶液适量, 进样测定结果显示黄花草木犀中和的质量分数分别为.9%.%.8% 色谱图见图 B A t /min rutin - -coumarin 图对照品 (A) 和黄花草木犀 (B) 的 HPLC 图谱 Fig. HPLC chromatograms of reference substance (A) and M. officinalis sample (B). 上样溶液的制备称取黄花草木犀药材 g, 粉碎, 过目筛, 用 7% 乙醇按照料液比 5 回流提取次, 每次 h, 滤过, 合并滤液, 浓缩至无醇味, 定容到 5 ml 量瓶中, 备用. 树脂类型的筛选考察.. 大孔树脂的预处理取 D NKA-9 大孔树脂适量, 装入含有相当于树脂体积.4~.5 倍丙酮的吸附柱中, 使其液面高于树脂层. cm, 浸泡 4 h 用 BV 丙酮以 BV/h 通过树脂层, 洗至流出液加水不显白色浑浊, 同等体积流量水洗, 再将 BV 5% 盐酸溶液以 4 BV/h 通过树脂层, 并浸泡 4 h, 同等体积流量水洗至中性, 再将 BV % 氢氧化钠溶液以 4 BV/h 通过树脂层, 并浸泡 4 h, 同等体积流量水洗至中性, 备用取 HPD- HPD-4 AB-8 大孔树脂用 95% 乙醇浸泡 4 h, 待充分溶胀后, 蒸馏水洗至中性, 备用.. 静态吸附解吸试验精密称取预处理好的 5 种树脂各 g, 滤纸吸取表面水分, 置于 ml 具塞锥形瓶中, 加入相当于 4 g 生药量的黄花草木犀提取液, 于气浴恒温振荡器中振摇 4 h, 静置, 取上清液, 过.45 μm 微孔滤膜, 测定指标成分的质量浓度, 计算静态吸附量和吸附率将吸附完全的大孔树脂滤过后用去离子水洗涤次, 吸去树脂表面水分, 分别加入 5 ml 7% 乙醇, 置于气浴恒温振荡器中振摇 4 h, 静置, 取上清液, 过.45 μm 微孔滤膜, 测定解吸液中指标成分的质量浓度, 计算静态解吸量和解吸率, 结果见表可见 HPD- 大孔树脂对黄花草木犀中指标成分的吸附率和解吸率均相对较高, 因此选用 HPD- 大孔树脂作为纯化黄花草木犀药效成分的最佳树脂类型吸附量 =(C -C )V /W 吸附率 =(C -C )/ C % 解吸量 =C V /W 解吸率 =[C /(C -C )] % C 为原药液的指标成分的质量浓度,C 为静态吸附后指标成分的质量浓度,C 为解吸液中指标成分的质量浓度, V 为吸附液体积,V 为解吸液体积,W 为湿树脂质量表 5 种大孔树脂静态吸附和解吸性能比较 Table Adsorption-desorption capacity of five types of macroporous resins 树脂类型化合物吸附量 / 吸附解吸量 / 解吸 (mg g ) 率 /% (mg g ) 率 /% D HPD HPD AB NKA

4 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第卷第 7 期 5 年 7 月 8.4 HPD- 大孔树脂的纯化工艺考察.4. 最大上样量的考察精密称取 g 预处理好的 HPD- 树脂 ( 滤纸吸去其表面水分 ), 湿法装柱, 取黄花草木犀提取液, 以 BV/h 上样吸附, 按树脂床体积收集流出液, 过.45 μm 微孔滤膜, 测定其中种化合物的质量浓度, 绘制泄漏曲线, 结果见图可见初始阶段流出液的质量浓度很小, 当上样量增加到 8 BV 时, 种成分均开始出现泄漏, 并且随着时间的增加, 和迅速泄漏, 分别于 BV 和 4 BV 泄漏完全, 这可能是由于芦丁和均属于黄酮苷类物质, 性质相似, 而香豆素不同和, 且在吸附的过程吸附量相对较大, 故泄漏缓慢, 并于 6 BV 泄漏完全为保证药效成分损失最小, 应选择树脂的上样量为.4 g 生药 /g 树脂泄漏率 /% 泄露率 =(C -C )/C % C 为动态吸附后指标成分的质量浓度上样体积 /BV 图 HPD- 树脂吸附草木犀中种成分的泄漏曲线 Fig. Leakage curves of three components in M. officinalis adsorbed by HPD- resin.4. 上样体积流量的考察精密称取 5 份预处理好的 HPD- 树脂 ( 滤纸吸去其表面水分 ) g, 湿法装柱, 将相当于 4.8 g 生药量的草木犀提取液以 BV/h 不同的体积流量上样, 吸附后的溶液过.45 μm 微孔滤膜, 测定其中种化合物的质量浓度, 计算吸附率和平均吸附率, 结果见表可见种指标成分的平均吸附率分别为 8.% 8.% 8.59% 79.9% 76.4% 体积流量在 ~ BV/h 时, 平均吸附率缓慢上升, 当体积流量在 ~.5 BV/h 时, 平均吸附率呈下降趋势, 其原因可能是体积流量较大时, 提取液与树脂接触的时间较短, 不利于和从液相扩散到树脂内部, 使得吸附率下降综合分析选择上样体积流量为 BV/h 表上样液体积流量对吸附率的影响 Table Effect of sample volume flow on adsorption rate 体积流吸附率 /% 平均吸量 /BV 附率 /% 洗脱溶剂体积分数对吸附效果的考察精密称取 HPD- 大孔树脂 g, 湿法装柱, 将相当于 4.8 g 生药量的草木犀提取液以 BV/h 上样吸附, 待吸附平衡后, 先用 BV 去离子水洗去杂质, 然后以 4 BV 的 % % 5% 7% 乙醇溶液以 BV/h 梯度洗脱, ml 为一个收集体积, 收集洗脱液, 过.45 μm 微孔滤膜, 测定其中种化合物的质量浓度, 绘制每个洗脱浓度中最大解吸量的动态解吸曲线, 结果见图可见种化合物均在 % 乙醇时开始洗脱, 和在 % 乙醇部分洗脱完全, 则主要在 5% 7% 乙醇部分进行洗脱为保证药效成分最大的洗脱量和工业化的生产成本, 选择 5% 乙醇洗脱溶剂最为合理解吸量 /mg 乙醇体积分数 /% 图不同乙醇体积分数对解吸量的影响 Fig. Effect of different ethanol concentration on desorption.4.4 HPD- 树脂动态解吸试验将上样吸附平衡的 HPD- 树脂先以 BV 去离子水洗去杂质, 然后用 5% 乙醇溶液以 BV/h 进行洗脱,4 ml 为一个流分体积, 收集洗脱液, 洗脱液过.45 μm 微孔滤膜测定其中种化合物的质量浓度, 绘制动态解吸曲线, 结果见图 4 可见 5% 乙醇的洗脱曲线峰型集中, 无明显拖尾现象, 第管时, 解吸液中和的解吸量达到最大值, 第 7 管时, 解吸液中的指标成分基本洗脱完全因此, 选取 7 BV(8 ml) 为最佳洗脱液用量

5 84 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第卷第 7 期 5 年 7 月解吸质量浓度 /(μg ml ) 图 4 HPD- 树脂的动态吸附曲线 Fig. 4 Dynamic adsorption curves on HPD- resin.5 验证试验洗脱液体积 /BV 按已优选的最佳工艺条件 :HPD- 树脂的上样量.4 g 生药 /g 树脂, 上样体积流量 BV/h, 依次用 BV 水和 7 BV 5% 乙醇洗脱, 进行次平行试验, 收集洗脱液, 浓缩至干, 称定质量, 计算种化合物的质量分数和收率 ( 收率 = 洗脱液中指标成分的总质量 / 上样液中各指标成分的总质量 ) 结果种指标成分在提取液中的质量分数为 4.54%, 经 HPD- 大孔吸附树脂纯化后指标成分的质量分数为 5.75%; 收率为 85.8% 可见采用大孔吸附树脂法分离纯化黄花草木犀中的药效成分的方法可操作行强收率较高, 可以达到较好的分离纯化效果等优点, 可为纯化黄花草木犀的工业化生产提供数据参考讨论树脂的纯净与否是实验的关键, 未经过处理的树脂中存在着大量的水溶性及脂溶性杂质, 这些杂质势必会影响指标成分的纯化过程另外树脂中的气泡也会影响纯化中的柱效, 故使用前需要对树脂进行酸碱醇和水的处理, 并在处理的过程中将树脂充分溶胀, 避免气泡干预 [-] 树脂极性大小和空间结构是影响其吸附性能的重要因素, 不同类型的大孔树脂的吸附性能不同有机物是通过树脂的孔隙扩散到树脂内部而被吸附, 因此树脂的孔隙粒径和比表面积等均对会影响到树脂的吸附性能 HPD- 大孔树脂为非极性物质, 粒径为.~. mm, 比表面积为 8~87 m /g, 平均孔径为 5.~5.5 nm, 洗脱性能良好 [] 针对本研究所需要纯化的指标成分和而言,HPD- 树脂和属于非极性物质, 和属于弱极性物质, 且实验结果表明,HPD- 树脂对种指标成分的平均吸附率和解吸率相对较高, 故确定 HPD- 大孔树脂作为黄花草木犀中药效成分的最佳纯化树脂本实验通过对大孔树脂的纯化工艺考察, 确定了其最佳纯化工艺 : 树脂上样量.4 g 生药 /g 树脂, 上样体积流量. BV/h, BV 水洗脱除杂后 7 BV 5% 乙醇洗脱实验中需要对黄花草木犀中两种不同类型的成分进行纯化, 二者在性质方面多有差异, 故需对实验结果进行综合分析与评价, 以确保对其药效成分进行最大程度优化在此条件下质量分数提升了 7.8 倍, 平均收率为 85.8% 由此可以确定, 采用大孔吸附树脂法分离纯化黄花草木犀中的药效成分的方法简单可行富集效果良好参考文献 [] 中华人民共和国卫生部药品标准藏药 [S] [] 杨杰, 王丽莉, 周鑫堂, 等. 黄花草木犀化学成分研究 [J]. 中草药, 4, 45(5): [] 孔令雷, 胡金凤, 陈乃宏. 类化合物药理和毒理作用的研究进展 [J]. 中国药理学通报,,8(): [4] 杨杰, 王丽莉, 张铁军. 草木犀属植物化学成分及药理作用研究进展 [J]. 中草药, 4, 45(): [5] 林静. 的临床药理特点 [J]. 中国临床药理学杂志, 9, 5(): [6] 李玉山. 的资源药理及主要剂型研究进展 [J]. 氨基酸和生物资源,, 5(): -6. [7] 汤春妮. 黄花草木樨总黄酮的提取及鉴别 [J]. 安徽化工, 4, 4(): 7-8. [8] 石凤英, 赵军, 孙玉华. 大孔吸附树脂纯化两色金鸡菊总黄酮的工艺研究 [J]. 现代药物与临床, 4, 9(): [9] Kicel A, Wolbiś M. Study on the phenolic constituents of the flowers and leaves of Trifolium repens L. [J]. Nat Prod Res,, 6(): [] 王国军, 唐辉, 张淑兰, 等. 大孔树脂纯化核桃隔膜总黄酮的工艺研究 [J]. 中草药,, 44(9): [] 陶遵威, 张岩, 王文彤. 大孔吸附树脂对苦豆子多糖纯化工艺研究 [J]. 现代药物与临床,, 8(4): [] 王平, 吴金山, 郭丹, 等. 大孔树脂纯化菊米总黄酮的工艺研究 [J]. 药物评价研究,, 6(6): [] 丁立稳, 汤建萍, 杨书武, 等.HPD- 大孔树脂吸附纯化荔枝核黄酮特性研究 [J]. 江西师范大学学报,, 7():

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.