标准吊称

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迫尚
5 years ago
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1 ICS 点击此处添加中国标准文献分类号 WS 中华人民共和国卫生行业标准 XX/T XXXXX XXXX 下呼吸道感染细菌培养操作规范 Standard for Bacterial Culture Procedures of Lower Respiratory Tract Infections 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 ( 报批稿 ) ( 本稿完成日期 :) XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施中华人民共和国国家卫生计生委员会发布

2 目次前言... 4 引言范围术语及定义支气管肺泡灌洗液保护毛刷标本库什曼螺旋纤维夏科雷登结晶弹性纤维纤毛柱状上皮细胞肺泡巨噬细胞分析前标本采集咳痰气管吸出物血培养诱导痰 ( 通常不用于细菌培养 ) 气管镜标本标本运送筛选并拒收下呼吸道细菌培养标本分析中痰及气管吸出物标本处理标本处理要求接种标本培养标本涂片及革兰染色显微镜观察革兰染色结果气管镜标本处理支气管肺泡灌洗液定量培养保护毛刷定量培养接种其他培养基及培养革兰染色标本处理剩余 BAL 标本检测其他病原连续培养并观察慢生长菌分离并鉴定下呼吸道重要致病菌 ( 参见附录 C)

3 4.4.1 链球菌属苛养革兰阴性杆菌 ( 在麦康凯平板上难生长 ) 革兰阴性双球菌革兰阴性杆菌 ( 在麦康凯平板上生长良好 ) 葡萄球菌属肠球菌属革兰阳性杆菌鉴定丝状真菌涂片时可见但培养不生长的细菌质量控制革兰染色抗酸染色培养基试剂分析后报告结果革兰染色报告痰标本报告原则 ( 见表 1) BAL 细胞离心涂片报告报告有临床意义的微生物报告的病原菌培养和涂片相符合时报告的病原菌有临床意义的数量报告有临床意义数量的非优势菌报告有临床意义数量的优势菌对非致病菌的报告报告肠杆菌科革兰阴性菌报告非发酵革兰阴性杆菌只生长肠球菌和凝固酶阴性葡萄球菌报告分离到口咽部正常菌群平板上无细菌生长结果解释附录 A( 规范性附录 ) 下呼吸道感染主要类型及常见病原体附录 B( 规范性附录 ) 支气管镜采集的标本适合诊断的病原体和检验项目附录 C( 规范性附录 ) 常见可疑菌落形态及经典快速鉴定方法参考文献

4 前言本标准按照 GB/T 1.1 给出的规则起草本标准由卫生部临床检验标准专业委员会提出本标准起草单位 : 卫生部临床检验中心陕西省人民医院安徽省立医院卫生部北京医院北京大学人民医院中国医学科学院北京协和医院首都医科大学附属北京友谊医院解放军总医院浙江省温州医科大学附属第二医院本标准主要起草人 : 胡继红任健康马筱玲胡云建王辉徐英春苏建荣罗燕萍李向阳 3

5 引言 1. 口咽部定植菌群变化对肺部感染的重要影响在人类口咽部位定植着大量需氧菌兼性厌氧菌和厌氧菌等微生物, 口腔菌群总数可达 CFU/mL~10 12 CFU/mL 健康人咽部定植细菌最少, 咽部需氧的正常菌群主要由革兰阳性菌组成人体基础条件的变化会改变咽部定植菌群的种类和数量长期接触某些携带侵袭性定植菌人群, 如日托儿童的父母的肺炎链球菌流感嗜血杆菌定植数量会增加 ; 在免疫抑制慢性肺病广谱抗菌药物治疗或住院患者等人群中, 革兰阴性杆菌的优势明显增加因此, 口咽部菌群变化对肺部感染有着重要影响 2. 肺部感染的常见机制肺部感染的最常见机制是肺泡内吸入了口咽部定植菌, 吸入性肺炎患者咽部菌群种类趋向于侵袭性细菌或耐药细菌, 如肺炎链球菌或革兰阴性杆菌健康宿主吸入口腔定植菌后常无临床症状, 细菌通常被粘液柱状纤维清除因此, 吸入能否引起肺部感染取决于吸入菌的致病性及数量, 患者免疫系统和呼吸道功能等诸方面的因素吸入气溶胶引起的肺部感染占第二位, 主要原因是使用了不清洁的呼吸机血液播散性肺炎占第三位, 感染通常造成双肺下叶肺炎由呼吸道感染引发的菌血症占 12%, 因此对肺部感染的高热患者送检血培养, 有利于发现肺部感染的病原菌 3. 痰涂片对下呼吸道感染病原菌诊断的重要作用下呼吸道感染类型及常见病原见附录 A 除引起社区非典型肺炎的病原不能常规培养外, 其他常见肺部感染的病原菌均可常规培养方法分离但培养方法敏感性低, 无法判断分离菌的来源涂片革兰染色方法对于评价痰标本是否合格提高病原菌诊断的特异性起到了重要作用涂片还可发现培养不能生长的细菌因此, 涂片方法提高了培养方法的特异性及敏感性 4. 支气管纤维镜标本定量培养的临床意义支气管肺泡灌洗液和保护毛刷标本适合用做定量细菌培养, 对菌落数大于阈值的细菌报告下呼吸道感染的致病菌, 特异性达 82%~91%, 诊断价值远高于痰标本, 但因其有创的采集方式而不易获取支气管纤维镜采集的标本类型及适合检验项目见附录 B 5. 下呼吸道感染细菌培养的局限性培养结果假阴性的原因大致包括 : 培养方法不支持所有致病菌生长采集标本前患者使用了抗菌药物延误了送检时间口腔正常菌群污染了标本等 ; 定量培养的菌落数接近阈值时结果不易解释 ; 而假阳性报告可因过度解读结果, 把非致病菌当作致病菌报告, 从而误导医生治疗, 也会造成严重后果 4

6 下呼吸道感染细菌培养操作规范 1 范围本规范旨在为医疗机构微生物实验室推荐常规细菌培养方法检测下呼吸道感染病原菌的检验流程, 既痰 ( 细菌 ) 培养项目明确了肺部感染患者下呼吸道标本适合诊断的病原和检验项目 ; 要求细菌培养同时做革兰染色涂片 ; 规范了下呼吸道标本的采集运送痰涂片标本合格判断, 痰 / 气管吸出物定性和气管镜采集标本定量细菌培养程序, 病原菌筛查和判断, 结果报告的临床意义和格式内容等操作流程 2 术语及定义 2.1 支气管肺泡灌洗液 bronchoalceolar lavage;bal 利用纤维支气管镜向支气管肺泡内注入无菌生理盐水灌洗, 抽吸并收集肺泡灌洗液, 通过检查其细胞成份可溶性物质和感染性病原菌, 诊断肺部相关疾病评价疗效和预后 2.2 保护毛刷标本 protected specimen brushings;psb 通过纤维支气管镜在亚段支气管处找到脓性分泌物部位, 推出双层套管中毛刷远端填塞的聚乙二醇, 伸出毛刷, 刷取脓性分泌物, 将毛刷退回双层套管取出后, 剪下毛刷送检因操作过程有双层套管保护, 毛刷采集的标本避免了上呼吸道及口腔定植细菌的污染 2.3 库什曼螺旋纤维 Curschmann s spiral fibers 呈毛虫状蜷曲, 革兰染色可见中轴蓝染, 边缘淡红色因慢性炎症时细支气管分泌的粘液浓缩而成 2.4 夏科雷登结晶 Charcot-Leyden Crystal 可见于支气管, 为菱形或针状六边形无色透明结晶, 其两端尖长, 大小不等, 折光性强, 由嗜酸粒细胞破裂后嗜酸性颗粒相互融合而成, 可用碘染色可在稍放置的痰中找到嗜酸性粒细胞堆在对烟曲菌有变态反应的哮喘患者或肺部感染寄生虫患者的痰液中常见 2.5 弹性纤维 elastic fibers 肺组织有破坏性病变如肺脓肿肺癌等时, 痰中可出现弹性纤维, 证明痰液标本来自下呼吸道 2.6 5

7 纤毛柱状上皮细胞 ciliated columnar epithelium cell 纤毛柱状上皮细胞主要分布在下呼吸道内表面, 在柱状细胞的游离面附有能摆动的纤毛, 是能分泌粘液的杯状细胞, 分泌的粘液能粘着并清除灰尘和细菌等异物, 借助纤毛有节律性的摆动, 将含有灰尘细菌的粘液排除至喉部 2.7 肺泡巨噬细胞 alveolar macrophages 来自血中单核细胞, 脱落的 Ⅱ 型肺泡上皮或肺泡间隔细胞细胞体积大, 胞质丰富, 核圆形卵圆形或肾形, 略偏位, 染色质细致均匀, 偶见核仁, 涂片中有巨噬细胞证明痰液标本来自下呼吸道 3 分析前 3.1 标本采集咳痰 a) 咳痰前, 患者用无菌生理盐水漱口 ; b) 指导患者咳出深部痰, 勿留取唾液和鼻咽腔分泌物气管吸出物当气管插管的患者出现肺炎症状时, 从气管中吸痰留取气管吸出物标本注 : 仅当出现肺炎的临床表现 ( 如发热或浸润 ) 时采集气管吸出物标本, 否则勿培养气管吸出物, 因气管在插管 24h 后即有定植菌, 培养结果可能与疾病不符血培养当下呼吸道感染患者伴有高热症状时, 送检血培养 ( 具体参考血培养标本采集和送检要求 ) 诱导痰 ( 通常不用于细菌培养 ) a) 当咳痰困难时, 先用湿牙刷清洁口腔粘膜舌头和牙龈, 勿用牙膏 ; b) 再用无菌水或生理盐水漱口 ; c) 用超声雾化器, 患者吸入约 20mL~30mL 的 3% NaCl 后, 留取标本气管镜标本采集气管镜标本注意事项 a) 气管镜可采集到感染部位高质量的标本, 包括支气管肺泡灌洗液标本 (BAL) 支气管灌洗液标本 (bronchial washings,bs) 保护毛刷标本(PSB) 及支气管穿刺活检标本, 均由呼吸科医生或经培训医生采集 ; b) 为防止污染, 应采用吸入麻醉剂, 勿从工作腔中吸取灌洗液标本 ; c) 标本采集顺序为 : 支气管灌洗液 (BS) 支气管肺泡灌洗液(BAL), 保护毛刷和活检标本, 避免带血支气管肺泡灌洗液标本 (BAL) 6

8 用不少于 140mL 无菌生理盐水灌洗小支气管和肺泡, 40mL~80mL 回收的灌洗液中包含约 1mL 支气管末梢和肺泡中的分泌物 ; 弃去前段可能污染部分, 收集其余部分后立即送检保护毛刷 (PSB) 保护毛刷因有双层套管保护, 不易污染上呼吸道和口腔定植菌用无菌剪刀剪断毛刷, 置于含 1mL 生理盐水的无菌容器中 ( 仅供需氧培养 ), 快速送检 3.2 标本运送用无菌防漏容器收集标本, 贴好标本信息 ( 条码 ) 后, 在 1h~2h 内 ( 室温 ) 送至微生物实验室注 1: 若送检标本超过 2h, 将导致有临床意义的致病菌数量减少, 非苛养的口咽部定植菌过度生长为防止口咽部正常菌群的过度生长, 可将标本放置 2 ~8 环境, 但培养分离到肺炎链球菌等苛养菌的机会和数量会减少注 2: 若标本延迟送检超过 2h 后未冷藏 ( 超过 2h~24h,2 ~8 ), 应在报告中说明因延误送检标本, 可能对培养结果造成的影响 3.3 筛选并拒收下呼吸道细菌培养标本 a) 拒收 24h 内重复采集的痰细菌培养标本 b) 唾液 c) 鼻冲洗液和分泌物鼻孔拭子 d) 咽部标本 e) 未经保护套管收集的支气管刷培养标本 f) 痰的厌氧菌培养标本注 : 除支气管穿刺吸出物 PSB 活检标本胸水或其他未经污染以外的标本做厌氧菌培养均不合格 g) 诱导痰注 : 诱导痰标本只适用于检测卡氏肺孢子菌和结核分枝杆菌, 对其他病原菌检出效果差 4 分析中 4.1 痰及气管吸出物标本处理标本处理要求 a) 接种标本及涂片操作必须在 Ⅱ 级生物安全柜中进行 ; b) 应在接收后 1h 内尽快处理所有标本, 特别是来自急诊新入院患者和有创方法采集的标本 ( 如 : BAL 和肺活检标本 ), 以保证致病菌的活性, 避免造成重复采集标本 ; c) 使用全自动接种前处理系统的实验室按厂家说明书处理标本, 洗痰液化后自动接种和涂片革兰染色接种标本用无菌拭子挑取脓性或无血部位痰或气管吸出物, 分别接种血平板巧克力平板和麦康凯 / 中国兰平板, 分区划线后立即培养培养将接种的血平板巧克力平板放二氧化碳培养箱 (5%~10%CO2) 麦康凯/ 中国蓝平板放普通培养箱,35 ~37 条件下培养 24h~48h, 血平板巧克力平板最好培养至 72h 7

9 4.1.4 标本涂片及革兰染色接种平板后, 用刚接种平板的拭子重新挑取脓性或无血部位痰或气管吸出物涂抹玻片, 涂片应薄且均匀 ( 透过涂片部位可看清楚下面印刷品的字迹 ) 自然干燥或恒温干燥器上干燥后, 经甲醇固定 ( 化学纯, 在棕色玻璃瓶或塑料容器中贮存 ) 或火焰快速固定 3 次, 革兰染色, 晾干后读片注 1: 革兰染色脱色时间因选用不同的脱色剂而异 1)95% 乙醇脱色时间为 30s;2) 丙酮 - 乙醇 ( 体积比为 3:7, 棕色瓶室温保存, 有效期 1 年 ) 脱色时间 1s~5s, 脱色效果一致性好 ;3) 丙酮 ( 试剂纯 ) 脱色时间最短, 当标本中含大量宿主细胞时脱色效果好注 3: 使用革兰染色仪染色的实验室按照厂家操作说明书进行, 注意条件优化, 使涂片染色结果达到满意效果显微镜观察革兰染色结果痰涂片在低倍物镜下检测 20 个 ~40 个视野, 气管吸出物涂片分别在低倍镜视野 (LPF) 和油镜视野 (OIF) 下观察计算有细胞视野的细胞平均数量, 记录鳞状上皮细胞 (SECs) 和多形核白细胞 (WBCs) 的数量注 1: 低倍镜下细胞计数 :1+( 偶见 ): 少于 1 个 /LPF;2+( 少量 ):1 个 ~9 个 /LPF;3+( 中量 ):10 个 ~25 个 /LPF;4+( 大量 ): 大于 25 个 /LPF. 注 2: 油镜下细菌计数 :1+( 偶见 ): 少于 1 个 / OIF;2+( 少量 ):1 个 ~5 个 / OIF;3+( 中量 ):6 个 ~30 个 /OIF; 4+( 大量 ): 大于 30 个 /OIF. 4.2 气管镜标本处理支气管肺泡灌洗液定量培养混匀标本用力涡旋震荡 BAL 标本 30s~60s 平板计数 (10 2 CFU/mL) 用经校准的加样器 ( 或经验证的 10μ L 接种环 ) 取 10μ l BAL 标本, 分别点种血平板和巧克力平板 ( 已回复至室温 ), 再用灭菌 L 型玻棒涂布平板培养后菌落计数 : 菌落数 = 相同形态菌落数 100CFU/mL 平板计数 (10 3 CFU/mL) 方法 1: 用 1μ L 定量接种环 ( 经验证 ) 取 1 环 BAL 标本, 分别接种血平板和巧克力平板, 用无菌 L 型玻棒涂布平板 ; 培养后菌落计数 : 菌落数 = 相同形态菌落数 10 3 CFU/mL 方法 2: 取 1 只标记 1:100 含 5ml 磷酸缓冲液 (PBS) 试管, 加入 50μ l BAL 原液标本, 涡旋震荡 ; 再从中取 100μ l 分别接种血平板和巧克力平板, 用灭菌 L 型玻棒涂布平板注 1: 磷酸缓冲液配制 :0.067mol/L Na2HPO3 70ml 与 0.067mol/L KH2PO3 30ml 混合 (ph7.2), 高压灭菌后使用注 4: 若用接种环密涂平板, 生长的菌落数量会低于实际数量但用 L 棒涂布平板计数, 定量培养结果更准确平板计数 (10 5 CFU/mL) 取 1 只标记 1:10 4 含 5ml PBS 试管, 加入 50μ L 经 1:100 稀释的标本 ( 见方法 2), 涡旋震荡 ; 从中取 100μ L 分别接种血平板和巧克力平板, 用灭菌 L 型玻棒涂布平板 ; 培养后菌落计数 : 菌落数 = 相同形态菌落数 10 3 CFU/mL 保护毛刷定量培养 8

10 混匀标本将 1mL 带毛刷的标本管用力涡旋震荡 30s~60s 平板计数 (10CFU/mL) 用加样器取 100μ L 标本分别接种血平板和巧克力平板, 用无菌 L 型玻棒涂布平板, 培养后菌落计数 : 菌落数 = 相同形态菌落数 10CFU/mL 平板计数 (10 2 CFU/mL) 用加样器取 10μ L 标本 ( 或用 10μ L 接种环 ) 分别接种血平板和巧克力平板, 用无菌 L 棒涂布平板, 培养后菌落计数 : 菌落数 = 相同形态菌落数 10 2 CFU/mL 平板计数 (10 3 CFU/mL) 方法 1: 用 1μ L 接种环取 1 环 PSB 标本, 分别接种血平板和巧克力平板, 用无菌 L 棒涂布平板 ; 方法 2: 取 1 只标记 1:100 的装有 5mL 磷酸缓冲液试管, 加入 50μ L PSB 原液标本, 涡旋震荡, 从中取 100μ L 分别接种血平板和巧克力平板, 用无菌 L 型玻棒涂布平板 ; 培养后菌落计数 : 菌落数 = 相同形态菌落数 10 3 CFU/mL 接种其他培养基并培养完成血平板和巧克力平板稀释涂碟后, 可取 100μ LBAL 标本或 PSB 标本接种麦康凯或中国蓝培养基培养步骤同 4.1.3; 对有创方式采集的肺组织标本应延长培养至 4 天革兰染色标本处理在完成标本定量培养后, 取适量 BAL 标本进行细胞离心 ; 保护毛刷标本可直接涂片经自然干燥甲醇固定或火焰快速固定 3 次, 革兰染色剩余 BAL 标本可用于其他病原检测对剩余 BAL 标本离心后, 可根据需要进行病毒分枝杆菌军团菌和真菌培养 ; 或做病毒卡氏肺孢子菌抗酸染色和真菌涂片染色 ( 见参考文献 4 的第六篇相关章节 ) 4.3 连续培养并观察慢生长菌观察定性培养 18h~24h 后的平板, 为检出可能生长的丝状真菌慢生长菌苛养的革兰阴性杆菌如博德特菌属 (Bordetella spp.), 平板在检查后继续培养至 48h 后, 再观察培养 48h 的平板, 可能发现培养 24h 未发现的细菌形态 4.4 分离并鉴定下呼吸道重要致病菌 ( 参见附录 C) 链球菌属 β- 溶血链球菌 a) 检查 β - 溶血菌落并鉴定触酶阴性且呈链状或成对排列的球菌 ; b) 用吡咯烷酮芳胺酶 (PYR) 试验鉴定化脓链球菌 ; 或密涂后粘贴杆菌肽纸片 (0.04U/ 片 ),35 过夜培养, 若有抑菌环, 则报告化脓链球菌, 任何数量均应报告 ; 9

11 c) 患儿标本检查是否有窄溶血环, 并鉴别 B 群链球菌 ( 无乳链球菌 ), 若 CAMP 试验 ( 金黄色葡萄球菌 ) 阳性, 则任何数量均应报告 ; d) 鉴定其他有临床意义数量的优势生长 β - 溶血链球菌 ; 注 : 不必报告小菌落的 β - 溶血链球菌或 F 群链球菌, 这类菌均为上呼吸道正常菌群肺炎链球菌鉴别草绿色链球菌和肺炎链球菌, 检查形态与肺炎链球菌相似的 α - 溶血菌落, 做以下试验 : a) 胆汁溶菌试验 : 在菌落上滴 10% 去氧胆酸钠溶液 1 滴, 置 35 15min~30min 后, 若菌落溶解, 报告肺炎链球菌 ; 若菌落不溶解, 则用奥普托辛 (optochin,op) 敏感试验再确认 b) OP 敏感试验 : 将菌落密涂于血平板, 粘贴 OP 纸片 (5μ g/ 片 ), 经 35 5%CO2 环境过夜培养, 若出现抑菌圈 ( 直径大于 14mm 判为敏感 ), 报告肺炎链球菌 ; c) 药敏试验 : 快速挑起相似菌落, 做药敏试验 ; 同时粘贴 OP 纸片确认纯度, 以检查药敏结果是否混有其他草绿色链球菌 ( 污染菌 ) 注 : 存在对胆汁耐受或对奥普托辛耐药的肺炎链球菌株, 将这两个试验联合检测可减少错误报告苛养革兰阴性杆菌 ( 在麦康凯平板上难生长 ) 流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌是只生长在巧克力平板上的球杆菌, 在血平板上不生长, 但在葡萄球菌周围可呈卫星状生长血平板卫星阳性 ( 菌落不溶血 ) MH 平板卫星试验阴性可判断是流感嗜血杆菌, 也可做 ALA (aminolevulinic acid) 试验确认, 并做 β - 内酰胺酶试验博德特菌属有重要临床意义的博德特菌在血平板上生长, 触酶和脲酶均为阳性, 培养 48h 出现肉眼可见菌落其他苛养革兰阴性杆菌除非呈优势生长或数量很多, 通常无需鉴定其他苛养的革兰阴性杆菌, 如艾肯菌属, 因这些均为上呼吸道正常菌群, 很少引起呼吸系统疾病革兰阴性双球菌 a) 检测有意义数量的用接种环可推移的菌落, 按表 1 确认是卡他莫拉菌,90% 以上卡他莫拉菌株的 β - 内酰胺酶试验为阳性 b) 检查巧克力平板上氧化酶阳性的任何菌落, 并在血平板上不生长或生长不良, 按表 1 确认鉴定脑膜炎奈瑟菌, 无需常规做药敏试验革兰阴性杆菌 ( 在麦康凯平板上生长良好 ) a) 若只生长了一种细菌并达到了有临床意义的数量, 而无其他致病菌, 通过初步试验筛查, 此菌若为肠杆菌科细菌特别是肺炎克雷伯菌, 需做鉴定和药敏试验 ; b) 对于住院患者, 不管是否有其他病原菌, 检查有意义数量的铜绿假单胞菌鲍曼不动杆菌洋葱伯克霍德菌和嗜麦芽窄食单胞菌, 因这些菌是典型的多重耐药菌, 可造成医院内流行 c) 若生长一种以上其他等量的革兰阴性杆菌, 做初步试验, 并报告 ( 如 : 吲哚氧化酶在麦康凯平板上的气味和形态菌落色素和克氏双糖试验的结果 ) 葡萄球菌属 10

12 a) 若革兰染色显示占优势的成堆球菌与白细胞相关, 而无其他有意义数量的致病菌, 只对有临床意义数量的金黄色葡萄球菌进行鉴定 b) 若是住院患者, 依照感染控制原则, 即使少量菌也应用头孢西丁检测苯唑西林是否耐药 c) 仅当凝固酶阴性葡萄球菌在平板上呈 90% 以上生长纯度时, 才需鉴定到种水平和 / 或做药敏试验, 其他葡萄球菌均为呼吸道正常菌群肠球菌属 a) 生长肠球菌则无需报告, 除非生长数量达 90% 以上纯培养, 用初步生化试验鉴定确认 d) 很多革兰阳性球菌是呼吸道正常菌群,PYR 阳性甚至胆汁七叶苷和亮氨酸肽酶 (leucine aminopeptidase,lap) 阳性革兰阳性杆菌 a) 排除任何数量来自免疫抑制患者的奴卡菌属和马红球菌 ( 粘液样菌落脲酶阳性 ); b) 如有大芽孢革兰阳性菌, 排除炭疽芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌 ; c) 有限地鉴定棒状杆菌, 当出现下列任何情况的大量优势菌生长时, 再使用鉴定革兰阳性杆菌的商品试剂盒 : 1) 当菌株快速脲酶试验阳性时 ( 假白喉棒状杆菌假结核棒状杆菌脲酶阳性 ) 2) 标本来自 ICU 的插管患者 d) 通常, 其他革兰阳性杆菌不引起肺炎, 故不必鉴定鉴定丝状真菌 a) 对分离到的丝状真菌做鉴定 ( 除外实验室或环境污染的霉菌, 如青霉菌 )( 见参考文献 4 之第六篇第五节 ); 注 : 从培养超过 48h 的平皿上分离双相真菌 ( 如荚膜胞浆菌和球孢子菌 ), 或酵母样菌落形态 ; b) 检查陈旧培养物以排除新生隐球菌, 无需进一步鉴定其他酵母样真菌 ; 注 : 念珠菌通常不会引起肺炎, 除非是肿瘤患者 ( 如 : 白血病 ) 肺移植患者或新生儿酵母菌属于口腔正常定植菌群, 即使从下呼吸道标本中分离到念珠菌, 不管是什么种, 都与疾病无关, 除非有组织病理学证据涂片时可见但培养不生长的细菌如果涂片时可见细菌, 但培养后未见细菌生长, 可能因使用了抗菌药物引起的 ; 但也不能排除可能存在军团菌百日咳博德特菌和分枝杆菌实验室应及时与临床联系, 扩大标本送检的培养范围 4.5 质量控制革兰染色 a) 应对新购置或新批号的商品化革兰染色试剂做室内质控, 常规质控频率为每周 1 次 ; b) 革兰染色阳性质控菌株 : 金黄色葡萄球菌 ATCC25923, 深紫色球菌为合格 ; c) 革兰染色阴性质控菌株 : 大肠埃希菌 ATCC25922, 红色杆菌为合格抗酸染色 a) 应对新购置或新批号商品化抗酸染色试剂做室内质控, 常规质控频率为每周 1 次 ; b) 抗酸染色阳性质控菌株 : 结核分枝杆菌 ATCC25177( 弱毒株 ), 红色分枝状杆菌为合格 ; 注 : 或用快生长分枝杆菌作为阳性质控菌株 11

13 c) 抗酸染色阴性质控菌株 : 大肠埃希菌 ATCC25922, 蓝色杆菌为合格培养基血平板购买或自制的 5% 羊血平板每批次做室内质控的菌株 : a) 化脓链球菌 ATCC19615,β - 溶血, 生长良好为合格 ; b) 肺炎链球菌 ATCC49619,α - 溶血 ( 草绿色溶血 ), 菌落中间凹陷的典型菌落特征为合格巧克力平板购买或自制的巧克力平板, 每批次做室内质控的菌株 : 流感嗜血杆菌 ATCC49247, 生长饱满典型的湿润半透明菌落为合格试剂每批号每周需做质控的试剂 a) 奥普托欣 (OP) 纸片 (5 mg/ 片 ): 质控菌株为肺炎链球菌 ATCC49619, 抑菌圈 >14mm 为合格 b) 杆菌肽纸片 (0.04 U/ 片 ): 质控菌株为化脓链球菌 ATCC19615, 形成抑菌圈为合格 c) PYR 试验 : 质控菌株为化脓链球菌 ATCC19615, 桃红色为合格每批号每次试验需做质控的试剂 a) 3% 过氧化氢 ( 触酶试验 ): 阳性对照菌株为金黄色葡萄球菌 ATCC25923, 产剧烈气泡 ; 阴性对照菌株为粪肠球菌 ATCC29212, 不产气泡或缓慢产生少量气泡 b) 兔血浆或乳胶凝集试剂 ( 凝集因子试验玻片法凝固酶试验 ): 阳性对照菌株为金黄色葡萄球菌 ATCC25923, 呈不规则块状凝集, 阴性对照菌株为表皮葡萄球菌 ATCC12228, 不凝集 c) 兔血浆或乳胶凝集试剂 ( 凝固酶试验试管法凝固酶试验 ): 质控菌株同 b), 经 4h 孵育, 阳性对照菌呈凝胶胨状 ; 阴性对照菌呈液状注 : 常规做凝固酶试验时应使用 EDTA 抗凝兔血浆, 当玻片法试验为阴性结果时, 应再做试管法确认, 因有 10%~15% 的金黄色葡萄球菌株的玻片法凝固酶试验呈阴性 d) 1% 盐酸四甲基对苯二胺 ( 氧化酶试验 ): 阳性对照菌株为铜绿假单胞菌 ATCC27853,10 秒钟内产蓝紫色 ; 阴性对照菌株为大肠埃希菌 ATCC25922, 不变色 e) 头孢硝噻吩 (nitrocefin)(β - 内酰胺酶试验 ): 阳性对照菌株为金黄色葡萄球菌 ATCC29213, 产粉红色 ; 阴性对照菌株为金黄色葡萄球菌 ATCC25923, 不变颜色 5 分析后报告结果 5.1 革兰染色报告痰标本报告原则 ( 见表 1) a) 白细胞和优势菌 ( 不粘附在鳞状上皮细胞上 ) 有助于预测肺部致病菌, 应该报告 ; b) 每个油镜视野可见大于 10 个或小于 10 个单一形态细菌并与白细胞相关 ( 在白细胞周围, 特别是位于白细胞内的细菌 ), 有助于预测肺部致病菌, 应该报告 ; 涂片中少于 1 个菌 /20 个油镜视野的少量细菌不必报告 ; c) 虽然由两种致病菌同时引起的感染不常见, 但当两种形态的细菌均与白细胞相关时也应报告 ; 12

14 d) 即使涂片未见细菌时仍有助于评价患者状况, 可能隐藏着某些特殊菌, 如军团菌内源性真菌结核分枝杆菌或其他可引起非典型肺炎的致病菌 ; e) 质量合格的标本中, 涂片有正常菌群及多种细菌 ( 通常白细胞内有空泡或液泡 ), 提示有吸入性肺炎, 应该报告表 1 痰 / 气管吸出物标本涂片革兰染色结果解释痰大于 10 个 SECs/LPF 指征解释标本包含唾液和上呼吸道分泌物, 报告大于 10 个鳞状上皮细胞 / 低倍视野, 提示标本被唾液污染, 不继续培养支气管吸出物成人患者 : 大于 10 个 SECs/LPF 或未见细菌 ; 患儿 : 未见细菌少于 10 个 SECs/LPF, 大量多形核白细胞 ( 大于 25 个 WBCs/LPF), 存在肺泡巨噬细胞和柱状上皮细胞大于 25 个 WBCs/LPF, 小于 25 个 SECs/LPF; 或 WBCs:SECs 大于 10:1, 单一形态的细菌量达到 3+~4+ 大量多形核白细胞胞内细菌弹性蛋白或胶原纤维库什曼螺旋纤维坏死的白细胞淀粉样小体 (corpora amylacea) 粉色絮状物夏科雷登结晶大量多形核白细胞, 白细胞内或外主要见 : 革兰阳性球菌成对或成短链排列革兰阳性球菌成堆排列革兰阴性双球菌革兰阴性小球杆菌革兰阴性椭圆杆菌大量多形核白细胞, 大量革兰阴性小杆菌球杆菌, 革兰阳性链球菌及其他不同形态的细菌出芽的酵母样孢子和假菌丝其他异常结构, 如真菌分枝的革兰阳性丝状杆菌或异形状细菌 ( 可能是抗菌药物治疗的结果 ) 不继续培养, 报告标本污染或未见细菌, 需重送标本未见细菌, 但 WBCs 数量达到 4+, 并可见纤维细胞时, 建议重新涂片做吖啶橙染色, 用荧光显微镜观察确认弹性纤维上是否有细菌 ; 假单胞菌属和嗜血杆菌属细菌因与弹性纤维不易区分, 涂片时可能漏检 ; 还可见军团菌, 此类感染中多形核白细胞不常见提示合格的深部痰标本, 可培养可接受标本并培养提示感染 ; 对于免疫抑制患者或粒细胞缺乏患者即使未见白细胞, 但无鳞状上皮细胞, 仍提示可疑感染, 可培养提示感染提示感染见于长期迁延的呼吸道疾病, 如慢性阻塞性肺病 (COPD) 提示呼吸道疾病治疗产生的雾化高渗盐水提示过敏性肺曲霉菌病可疑肺炎链球菌性肺炎可疑金黄色葡萄球菌性肺炎可疑卡他莫拉菌局限性肺炎可疑流感嗜血杆菌性肺炎可疑克雷伯菌或其他肠杆菌科细菌引起的肺炎需在报告中特别提示 : 吸入性肺炎, 因培养结果会显示只生长正常菌群通常提示鹅口疮或上呼吸道酵母菌感染, 并非肺炎, 仅当其为主要所见菌时报告请高年资实验人员确认, 可能需补充实验如 : 抗酸染色等 BAL 细胞离心涂片报告若是细胞离心机制作的 BAL 标本涂片革兰染色, 检测敏感度为 10 5 个细胞 /ml 或 10 4 个细胞 /ml, 若每个油镜视野可见 1 个或多个细菌, 报告革兰染色形态及白细胞结果, 提示此细菌与活动性肺炎相关 13

15 5.2 报告有临床意义的微生物应报告的病原菌 a) 化脓链球菌 b) B 群 β - 溶血链球菌 ( 儿童 ) c) 博德特菌属, 特别是支气管博德特菌 d) 奴卡菌属 e) 新生隐球菌 f) 弗朗西斯土拉菌 ( 高致病菌 ) g) 鼠疫耶尔森菌 ( 高致病菌 ) h) 炭疽芽孢杆菌 ( 高致病菌 ) i) 丝状真菌 ( 排除腐生菌污染 ) 培养和涂片相符合时报告的病原菌处理培养物应参考涂片的结果, 应根据革兰染色所见炎症细胞和细菌的形态与培养物进行对照, 当培养与涂片结果不相符时应重新读片当培养生长的细菌在涂片中亦和炎症细胞相关时, 报告以下两种病原菌 : a) 肺炎链球菌, 并报告药敏结果 b) 流感嗜血杆菌, 常规报告 β - 内酰胺酶有临床意义的数量 a) 定性培养生长的病原菌数量达到以下情况时, 判断为有临床意义 : 1) 在平板第 2 区划线仍大量生长, 或培养物生长量超过 1/4 平板 ; 2) 培养中少量生长且革兰染色涂片可见此形态细菌与炎症细胞相关联的病原菌 ; 3) 在平板划线第 1 区生长且纯度超过 90% 以上时, 同时革兰染色涂片可见此形态细菌与炎症细胞相关的病原菌 b) 定量培养有临床意义的数量 : 1) BAL: 菌落计数大于或等于 10 4 CFU/mL 2) PSB: 菌落计数大于或等于 10 3 CFU/mL 注 : 取最高稀释度平板, 分别对不同菌落形态的细菌计数, 乘上稀释倍数即为菌落数报告有临床意义数量的非优势菌当培养达到所示有临床意义的数量时, 即使非优势菌也应报告的病原菌 : a) 卡他莫拉菌脑膜炎奈瑟菌, 常规报告 β - 内酰胺酶 ; b) 只对住院患者报告的病原菌有 : 1) 铜绿假单胞菌, 并报告药敏结果 2) 嗜麦芽窄食单胞菌, 并报告药敏结果 3) 不动杆菌属, 特别是鲍曼不动杆菌, 并报告药敏结果 4) 洋葱伯克霍德菌, 并报告药敏结果报告有临床意义数量的优势菌生长菌达有临床意义数量的优势菌, 特别当涂片提示分离菌与多形核白细胞相关时报告的病原菌 : a) 金黄色葡萄球菌, 并报告药敏结果 14

16 b) B 群 β - 溶血链球菌 ( 成人 ) C 群或 G 群 β - 溶血链球菌 c) 单一形态革兰阴性杆菌 ( 特别是肺炎克雷伯菌 ), 并报告药敏结果 d) 苛养的革兰阴性杆菌, 通常报告 β - 内酰胺酶 e) 脲酶阳性的棒状杆菌或来自 ICU 的患者 f) 分离自免疫抑制患者的马红球菌 5.3 对非致病菌的报告报告肠杆菌科细菌在麦康凯平板上生长 1 种以上的革兰阴性杆菌, 经氧化酶阴性乳糖产酸等试验初步鉴定为肠杆菌科细菌, 报告 : 经鉴定生长肠杆菌科细菌报告非发酵细菌在麦康凯平板上生长 1 种以上的革兰阴性杆菌, 经氧化酶阳性克氏双糖铁上不发酵葡萄糖等试验初步鉴定, 报告 : 经鉴定生长非发酵细菌只生长肠球菌和凝固酶阴性葡萄球菌若只生长肠球菌属和 / 或凝固酶阴性葡萄球菌 ( 有或无酵母样真菌 ), 报告革兰阳性球菌混合生长 ; 若培养物纯度达 90% 以上, 则做初步鉴定到属水平并分别列出报告分离到口咽部正常菌群若未分离到致病菌, 对分离的 : 草绿色链球菌和 / 或非致病奈瑟菌类白喉菌凝固酶阴性葡萄球菌罗斯菌属 (Rothia spp.) F 群链球菌厌氧菌嗜血杆菌属 ( 非流感嗜血杆菌 ) 艾肯菌属放线杆菌属嗜二氧化碳菌莫拉菌属肠球菌属酵母样真菌, 和未达到有意义数量的金黄色葡萄球菌 ( 如果医院感染控制要求可做药敏试验 ) 革兰阴性杆菌及脑膜炎奈瑟菌, 均报告 : 分离到口咽部正常菌群 ( 可列出相应菌属 ) 5.4 平板上无细菌生长如任何平板上无细菌生长, 报告无细菌生长出现此种情况可能是使用抗菌药物抑制了正常菌群等原因 5.5 结果解释 a) 尽管培养到的肺炎链球菌或流感嗜血杆菌可能是定植菌, 因而导致报告了假阳性结果, 但通常仍在临床报告中提示分离菌是可疑致病菌 b) 培养生长的革兰阴性杆菌或金黄色葡萄球菌是优势菌, 且涂片也提示这些形态的细菌与感染相关时才报告 c) 培养阴性时也不能排除患者的下呼吸道感染, 因培养的阳性率低, 经常分离不到致病菌 d) 多数医生认为对通气相关肺炎和院内感染肺炎患者做气管吸出物或痰培养对临床诊断有帮助 e) 通常治疗社区获得性肺炎使用青霉素类抗菌药物, 如阿莫西林或阿莫西林 / 棒酸一种氟喹诺酮类一种大环内酯类抗菌药物, 或联合抗菌药物治疗 15

17 A A XX/T XXXXX XXXX 附录 A ( 规范性附录 ) 下呼吸道感染的主要类型及常见病原体类型 / 免疫状态最常见病原体少见病原体 1 社区获得性典型肺炎 2 社区获得性非典型肺炎吸入性肺炎医院获得性肺炎肺炎链球菌, 流感嗜血杆菌, 肺炎克雷伯菌肺炎支原体, 呼吸道病毒, 流感病毒, 肺炎衣原体, 军团菌属厌氧菌, 金黄色葡萄球菌, 需氧革兰阴性杆菌革兰阴性杆菌 ( 肠杆菌属 / 克雷伯菌属 / 不动杆菌属 / 假单胞菌属 ), 金黄色葡萄球菌, 厌氧菌, 社区获得性肺炎的典型菌金黄色葡萄球菌, 卡他莫拉菌, 脑膜炎奈瑟菌沙眼衣原体, 结核分枝杆菌, 真菌等军团菌, 肺炎链球菌血液播散性肺炎金黄色葡萄球菌, 链球菌需氧革兰阴性杆菌免疫抑制宿主条件致病菌感染性肺炎 3 环境暴露引起的肺炎急性气管炎社区获得性肺炎典型菌, 奴卡菌属, 念珠菌属, 条件致病真菌, 曲霉菌结核分枝杆菌军团菌属双相真菌曲霉属肺炎支原体肺炎衣原体病毒, 百日咳博德特菌, 肺炎支原体和肺炎衣原体鼻疽假单胞菌, 假鼻疽假单胞菌, 鼠疫耶尔森菌, 贝纳柯克斯体图拉热弗朗西斯菌注 1: 肺炎链球菌和流感嗜血杆菌是引起儿童和老年人肺炎的最常见致病菌 ; 卡他莫拉菌脑膜炎球菌多发于基础病患者或病毒感染后的继发感染 ; 金黄色葡萄球菌肺炎可引发肺脓肿 ; 肺炎克雷伯菌大叶性肺炎常合并脓肿或肺粘连, 死亡率较高注 2: 通常可用分子生物学方法快速诊断, 也可在感染后期用血清学方法检测肺炎支原体肺炎衣原体和军团菌属抗体确诊由生物恐怖病原菌, 如鼠疫耶尔森菌引起的感染, 血清学检测可作为辅助诊断方法结核分枝杆菌可用罗氏培养基或快速结核杆菌液体培养仪培养, 或分子诊断方法检测注 3: 暴露在特殊气溶胶环境 : 与飞沫有关的结核分枝杆菌与尘暴和鸟排泄物有关的双相真菌等 16

18 B B XX/T XXXXX XXXX 附录 B ( 规范性附录 ) 支气管镜采集的标本适合诊断的病原和检验项目标本类型适合诊断的病原菌推荐试验支气管灌洗液 (BS) 1 只用于诊断由严格致病菌引起的肺炎, 如结核分枝杆菌军团菌属内源性真菌 1. 用选择性培养基分离培养分枝杆菌真菌 2. 并做真菌涂片和抗酸染色 3. 直接荧光抗体法 (DFA) 检测军团菌和肺孢子菌保护毛刷标本 (PSB) 只用于诊断细菌性肺炎 1. 定量细菌培养 2. 革兰染色支气管肺泡灌洗液 (BAL) 2 适用于检测条件致病菌引起的肺部感染的所有试验 1. 定量细菌培养 2. 分枝杆菌培养和抗酸染色染色 3. 真菌培养和染色 4. 直接荧光抗体法检测病毒 5. 直接荧光抗体法检测肺孢子菌注 1:BAL 适用于诊断 : 机械通气相关肺炎免疫低下患者肺炎慢性阻塞性肺病 (COPD),ICU 病房重症患者经抗菌药物治疗未获改善者艾滋病患者痰检阴性疑似肺结核或支气管结核者等注 2:BS 来自主气道, 从外观上无法与 BAL 区别, 含有上呼吸道污染菌 17

19 附录 C ( 规范性附录 ) 常见可疑菌落形态及经典快速鉴定方法细菌可疑鉴定附加试验最终鉴定特殊要求化脓链球菌 1.G+ 链球菌, 成对 PYR 阳性用血清学方法确认 (A 群 ) 2. 触酶阴性 3. 溶血 4. 菌落直径 >0.5mm, 边缘明显无乳链球菌 1.G+ 链球菌, 成对 CAMP 阳性若用侵入性方法采集的标本或菌落不 (B 群 ) 2. 触酶阴性或马尿酸水解阳性溶血, 需确认马尿酸水解试验 PYR( 阴 3. 透明菌落小溶血环性 ) CAMP 或血清学结果草绿色链球菌群 1.G+ 链球菌 PYR 阴性 2. 触酶阴性 3.α- 溶血 4. 胆汁溶菌阴性或菌落发白肺炎链球菌 1.G+ 矛头状双球菌胆汁溶菌阳性若胆盐不溶菌但菌落典型, 需确认 OP 2. 触酶阴性或荚膜肿胀阳性敏感 3.α- 溶血流感嗜血杆菌 1.G- 球杆菌卟啉 ALA 阴性非致病性溶血嗜血杆菌在马血兔血和 2. 巧克力平板 24h 生长良好但血平羊血上呈 β - 溶血,ALA 阴性, 因自身板上不生长, 但血平板上葡萄球菌溶血可在血平板上独立生长弗朗西斯周围呈卫星生长吐拉菌 ( 高致病菌 ) 在巧克力板上 48h 生长更小的菌落, 血平板上不生长侵蚀艾肯菌 1.G- 杆菌有漂白粉味道 2. 氧化酶阳性鸟氨酸阳性 3. 触酶阴性 4.MAC 平板上不生长 5. 不溶血卡他莫拉菌 1.G- 双球菌丁酸盐试验阳性将革兰染色形态双球菌与其他莫拉 2. 氧化酶阳性菌的球杆菌区别 3. 在血平板上推菌落可移动脑膜炎奈瑟菌 1.G- 双球菌糖发酵仅葡萄糖和麦应在 Ⅱ 级生物安全柜中处理可疑脑膜 2. 氧化酶阳性芽糖阳性或用奈瑟菌炎奈瑟菌培养物 3. 血平板上生长属试剂盒鉴定铜绿假单胞菌 1. 氧化酶阳性若无水果气味, 蓝绿若无水果气味或蓝绿色色素, 有绿色 2. 吲哚阴性色色素可判断荧光色素,42 生长 3. 生姜气味荧光假单胞菌腐 1. 氧化酶阳性有荧光, 但无气味或明胶或卵磷脂试验鉴别败假单胞菌 2. 吲哚阴性 42 生长 18

20 常见可疑菌落形态及经典快速鉴定方法 ( 续表 ) 细菌可疑鉴定附加试验最终鉴定特殊要求金黄色葡萄球菌 1. 触酶阳性 2.G+ 球菌, 成堆需试管法凝固酶试验确认 3. 试管法 / 玻片法或乳胶凝集试验阳性凝固酶阴性葡萄球菌 1. 触酶阳性 2.G+ 球菌, 成堆 3. 试管法 / 玻片法或乳胶凝集试验阴性菌落不黏对于玻片法凝固酶试验阴性菌株, 需再做试管法凝固酶试验确认 ; 达 90% 以上生长纯度时才继续鉴定到种水平和 / 或做药敏试验肠球菌属 1.G+ 链球菌, 成对 PYR 阳性若菌落溶血胆汁七叶苷阳性是肠球菌 2. 触酶阴性 3. 不溶血溶血菌落可能是 A 群链球菌, 若溶血肠球菌是胆汁七叶灵阳性芽孢杆菌属 ( 及相关有芽孢菌 1.G+ 大杆菌 2. 触酶阳性动力 ( 无动力则检测炭疽芽孢杆菌 ) 蜡样芽孢杆菌群 ( 非炭疽芽孢杆菌 ) 为 β - 溶血及青霉素耐药, 菌落直径 >1μ m 属 ) 3. 有芽孢棒状杆菌属 1.G+ 杆菌, 不大 2. 触酶阳性无分枝, 或部分菌体抗酸染色阳性试剂盒 API CORYNE 棒状杆菌有助于鉴定到种水平 3. 不溶血 4. 无色素 5. 无动力奴卡菌属 1. G+ 细长, 分枝, 串珠状, 丝状菌 ; 2. 或染色不规则杆菌 ; 3. 培养物涂片多形分枝球状改良抗酸染色法, 部分菌体抗酸染色阳性 19

21 参考文献 1 Susan E.Sharp, Ann Robinson and Michael Saubolle, ect Cumulative Techniques and Procedures in Clinical Microbiology 7B, Lower Respiratory Tract Infections.ASM Press, Washington, D.C. 2 Murray P.R., Baron, E.J., Pfaller, M., Tenover, F., and Yolken, R Manual of Clinical Microbiology, 9th ed. ASM Press, Washington, DC. 3 James V., Karen C.C., James H, J., Guido F., Marie L.L., David W.W Manual of Clinical Microbiology, 10th ed. ASM Press, Washington, DC. 4 叶应妩, 等全国临床检验操作规程 ( 第 3 版 ) Nagendra, S., P.Bourbeau, S.Brecher, M.Dunne, M.LaRocco, and G.Doern.2001.Sampling variability in the microbiological evaluation of expectorated sputa and endotracheal aspirates. J. Clin. Microbiol.39: Roson,B.,J.Carratala,R.verdaguer,J.Dorca,F.Manresa,and F.Gudiol.2000.Prospective study of sputum Gram stain in the initial approach to community-acquired pneumonia requiring hospitalization.clin.infec.dis.31: Gleckman,R.,J.DeVita,D.Hibert,C.Pelletier,and R.Martin.1988.Sputum gram stain assessment in community-acquired bacteremic pneumonia.j.clin.microbiol.26:

<4D F736F F F696E74202D20CFC2BAF4CEFCB5C0B8D0C8BECFB8BEFAC5E0D1F8B2D9D7F7B9E6B7B6205FBBA8C1B3B8E55FBDE2B6C BCC3C4CF2E >

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