210 传染病信息 2018 年 6 月 30 日第 31 卷第 3 期 Infect Dis Info, Vol. 31, No. 3, June 30, 2018 试剂的方法包括 PCR 熔解曲线等温扩增以及第二代测序技术 ( 又称高通量测序或下一代测序技术 ) 等 [11-12] 目前,FD

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校严殷
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1 传染病信息 2018 年 6 月 30 日第 31 卷第 3 期 Infect Dis Info, Vol. 31, No. 3, June 30, 细菌感染多重核酸检测试剂参考品的建立刘东来, 周海卫, 石大伟, 沈舒, 田亚宾, 张春涛 [ 摘要 ] 目的建立细菌感染多重核酸检测试剂参考品并制定其质量标准, 为相关产品的质量评价提供依据方法选择 34 种可导致中枢神经系统血液呼吸道肠道以及生殖道感染的致病性细菌或真菌, 培养富集后应用全自动细菌鉴定及药物敏感分析系统 VITEK2 进行鉴定鉴定正确的菌株, 应用梯度稀释法测定浓度后进行分组混合成高浓度样本应用全基因组第二代测序技术验证混合样本的组成情况和特异性选择基于不同原理的多重核酸检测试剂进行协作标定, 根据标定结果确定参考品的质量标准, 并对参考品的稳定性进行考察结果本参考品由 28 种细菌和 6 种真菌混合成 7 支混合参考品, 编号为 M1 ~ M7, 其中细菌的终浓度约为 ~ CFU/ml, 真菌的终浓度约为 ~ CFU/ml 经全基因组第二代测序技术验证, 参考品的组成正确且无交叉污染情况分别应用基于 PCR- 熔解曲线等温扩增以及靶向扩增第二代测序技术的多重核酸检测试剂对参考品进行检测, 结果显示本参考品经过适当稀释后能够对试剂的准确性特异性重复性以及最低检出限等性能指标进行评价, 且参考品各混合菌株间无交叉反应稳定性研究结果表明反复冻融 3 次不影响本参考品的稳定性结论本研究建立了细菌感染多重核酸检测试剂参考品并制定其质量标准, 能够应用于相关参考品的质量评价 [ 关键词 ] 细菌感染 ; 多重核酸检测试剂 ; 参考品 [ 中国图书资料分类号 ] R57 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2018) DOI: /j.issn Establishment of reference material of multiplex nucleic acid assay for bacterial infection LIU Dong-lai, ZHOU Hai-wei, SHI Da-wei, SHEN Shu, TIAN Ya-bin, ZHANG Chun-tao * Division II of In Vitro Diagnostics for Infectious Diseases, Institute for In Vitro Diagnostics Control, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing , China *Corresponding author, zhangct2@126.com [Abstract] Objective To establish reference material of multiplex nucleic acid assays for identification of bacterial infection and formulate relevant quality standards, thus providing evidence for quality assessment of related products. Methods Thirty-four pathogenic bacteria and fungi associated with central nervous system, blood, respiratory, intestinal and reproductive tract infections were selected for further culture and enrichment, and were identified by using fully automated microbial identification system and drug sensitive analyzer VITEK2. The gradient dilution method was used to determine the concentration of identified correct strains, then all strains at a high concentration were grouped and mixed as reference material candidates. The composition and specificity of mixed candidates were verified by using the whole genome sequencing. Collaboration study was conducted using multiplex nucleic acid assays based on different detection principles to determine the quality standards of reference material. Finally, the stability of the reference material was evaluated. Results Total 34 pathogenic bacteria and fungi, including 28 bacteria and 6 fungi, were mixed as 7 reference materials coded M1 M7 (final concentration of bacteria was CFU/ml and final concentration of fungi was CFU/ml). The whole genome second-generation sequencing technology was applied to verify that the reference product was composed correctly and there was no cross-contamination. Reference product was tested with multiplex nucleic acid assays based on PCR-melting curves, isothermal amplification and targeted-amplification second-generation sequencing technologies. The results showed that detecting the suitably diluted reference material could be used to evaluate the multiplex nucleic acid assays, such as accuracy, specificity, reproducibility and limit of detection, and there was no cross-containment among mixed strains. The stability study showed that 3 times freeze-thawing cycles did not impact the stability of reference material. Conclusions The reference material and its quality standards have been established and it can be used for quality evaluation of multiplex nucleic acid assays for identification of bacterial infection. [Key words] bacterial infection; multiplex nucleic acid assay; reference material 细菌感染可以引发多种疾病, 临床上须要及时诊断传统细菌鉴定基于培养法, 是将患者体液标本置于适宜的培养基上培养增殖, 然后鉴定培养物但是, 培养法对临床样本消耗量大且检测周期长, 难以分辨多种细菌混合感染, 以及很多致病性细菌难以分离培养等, 导致传统的鉴定方法有时不 [ 基金项目 ] 中国食品药品检定研究院中青年发展研究基金 (2016C1) [ 作者单位 ] 北京, 中国食品药品检定研究院体外诊断试剂检定所传染病诊断试剂二室 ( 刘东来周海卫石大伟沈舒田亚宾张春涛 ) [ 通信作者 ] 张春涛, zhangct2@126.com 能满足临床诊断需求 [1-2] 分子诊断技术检测速度快, 灵敏度特异性和可重复性好, 在突发性感染的评估, 感染早期的发现监测以及细菌耐药性分析等领域占据重要地位 [3-5] 随着分子诊断技术的快速发展以及临床需求的不断增加, 多重核酸检测技术应运而生该技术是指在一个核酸检测体系中加入多对扩增引物, 同时对多个病原体进行靶向扩增通过与其他检测技术联用, 多重核酸检测技术能够同时对一份样本检测多种病原体并快速报告结果, 该项技术正越来越多地应用于临床诊断并受到广泛关注 [6-10] 常见的多重核酸检测

2 210 传染病信息 2018 年 6 月 30 日第 31 卷第 3 期 Infect Dis Info, Vol. 31, No. 3, June 30, 2018 试剂的方法包括 PCR 熔解曲线等温扩增以及第二代测序技术 ( 又称高通量测序或下一代测序技术 ) 等 [11-12] 目前,FDA 已经批准 12 个单次可检测 20 余种细菌感染的多重核酸检测试剂, 检测范围覆盖中枢神经系统血液呼吸道肠道以及生殖道感染相关细菌 [13] 我国的相关行业尚处于起步阶段, 国家食品药品监督管理总局仅批准 1 个基于等温扩增技术的细菌多重核酸检测试剂参考品是相关试剂质量评价的基础以及审评审批的重要依据 [14-17] 为适应细菌多重核酸检测试剂的性能特点, 须要建立创新性的质量评价方法本研究建立了细菌感染多重核酸检测试剂参考品并制定其质量标准 1 材料与方法 1.1 材料候选参考品来源候选参考品包括 28 株细菌, 分别是屎肠球菌 ATCC 肺炎链球菌 ATCC BAA-255 粘质沙雷氏菌 ATCC 大肠杆菌 ATCC 表皮葡萄球菌 ATCC 鲍曼不动杆菌 ATCC 9955 肺炎克雷伯菌 BAA-1705 缓症链球菌 ATCC 粪肠球菌 ATCC 产酸克雷伯菌 ATCC 化脓链球菌 ATCC 流感嗜血杆菌 ATCC 金黄色葡萄球菌 ATCC BAA-1747 奇异变形杆菌 ATCC 无乳链球菌 ATCC 单核细胞增多李斯特菌 ATCC 阴沟肠杆菌 ATCC 铜绿假单胞菌 ATCC 脑膜炎奈瑟菌 ATCC 藤黄微球菌 ATCC 马红球菌 ATCC 6939 格氏李斯特菌 ATCC 琼氏不动杆菌 ATCC 副流感嗜血杆菌 ATCC 9796 干燥奈瑟菌 ATCC 9913 荧光假单胞菌 ATCC 嗜水气单胞菌 ATCC 7966 嗜肺军团菌 ATCC 33152;6 株真菌分别是近平滑念珠菌 ATCC 葡萄牙假丝酵母 ATCC 热带假丝酵母 ATCC 克柔念珠菌 ATCC 光滑念珠菌 ATCC 白色念珠菌 ATCC 上述菌株均由本单位保存并提供仪器和试剂细菌培养使用脑心浸液培养基甘露醇琼脂培养基哥伦比亚琼脂培养基哥伦比亚血琼脂培养基巧克力琼脂培养基大豆酪蛋白琼脂培养基军团菌 GVPC 选择琼脂培养基 ; 厌氧产气袋细菌鉴定使用革兰阴性细菌鉴定卡 (VITEK2 GN); 革兰阳性细菌鉴定卡 (VITEK2 GP); 奈瑟氏菌及嗜血杆菌鉴定卡 (VITEK2 NH); 酵母菌鉴定卡 (VITEK2 YST); 革兰阴性细菌药物敏感性 ( 药敏 ) 鉴定卡 (VITE2 AST- GN); 革兰阳性细菌药敏鉴定卡 (VITEK2 AST- GP) 上述培养基及鉴定卡均购自梅里埃诊断产品 ( 上海 ) 有限公司细菌生化鉴定使用的全自动细菌鉴定及药敏分析系统 (VITEK2) 由梅里埃诊断产品 ( 上海 ) 有限公司提供细菌全基因组测序验证应用的第二代测序服务购自华大基因候选参考品协作标定使用的多重核酸检测的商品化或自建试剂包括呼吸道病原菌核酸检测试剂盒致病性细菌核酸检测试剂盒侵袭性真菌核酸检测试剂盒血培养病原体及其耐药基因检测试剂盒血流感染常见病原体检测试剂盒和细菌感染检测试剂盒, 由博奥生物集团有限公司华大基因卡尤迪生物科技 ( 北京 ) 有限公司以及梅里埃诊断产品 ( 上海 ) 有限公司提供 1.2 方法菌株培养及鉴定本单位保存的 34 株细菌和真菌均为冻干粉状态一般地, 菌株先加入 200 μl 肉汤培养基复溶, 混匀后划线接种于合适的固体培养基平板,35 孵育培养 24 ~ 36 h 挑取单个菌落, 置于 35 孵育培养 24 ~ 36 h 传代培养屎肠球菌和粪肠球菌培养使用脑心浸液培养基 ; 金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌培养使用甘露醇琼脂培养基 ; 马红球菌藤黄微球菌荧光假单胞菌嗜水气单胞菌近平滑念珠菌葡萄牙假丝酵母热带假丝酵母克柔念珠菌光滑念珠菌和白色念珠菌培养使用哥伦比亚琼脂培养基 ; 化脓链球菌无乳链球菌肺炎链球菌缓症链球菌和阴沟肠杆菌培养使用哥伦比亚血琼脂培养基 ; 单核细胞增多李斯特菌格氏李斯特菌流感嗜血杆菌副流感嗜血杆菌脑膜炎奈瑟菌和干燥奈瑟菌使用巧克力琼脂培养基 ; 鲍曼不动杆菌琼氏不动杆菌大肠杆菌奇异变形杆菌铜绿假单胞菌肺炎克雷伯菌产酸克雷伯菌和粘质沙雷氏菌培养使用大豆酪蛋白琼脂培养基 ; 嗜肺军团菌使用军团菌 GVPC 选择琼脂培养基须要注意的是 : 化脓链球菌无乳链球菌肺炎链球菌缓症链球菌流感嗜血杆菌副流感嗜血杆菌脑膜炎奈瑟菌干燥奈瑟菌和嗜肺军团菌须要使用厌氧产气袋进行厌氧培养, 其中嗜肺军团菌生长缓慢, 须培养 96 ~ 120 h 菌株的鉴定使用全自动细菌鉴定及药敏分析系统及其配套鉴定卡, 所有操作按照仪器及鉴定卡说明书进行菌株浓度测定应用梯度稀释法对鉴定正确的菌株的菌落形成单位浓度进行测定 [18] 简单的, 菌株重新划线接种于合适的固体培养基平板进行培养使用 3 ml 无菌生理盐水冲洗固体培养基表面的菌落, 并配制一定麦氏浊度单位的菌悬

3 传染病信息 2018 年 6 月 30 日第 31 卷第 3 期 Infect Dis Info, Vol. 31, No. 3, June 30, 液, 细菌按照 0.5 MCF 约为 CFU/ml 估算, 真菌按照 0.5 MCF 约为 CFU/ml 估算将上述菌悬液按 10 倍梯度进行稀释, 取 100 μl 稀释液划线接种于合适的固体培养基平板上培养 24 ~ 36 h 选择菌落数为 30 ~ 300 个的平板进行人工计数并计算原始菌液的浓度所有实验重复 2 次并计算平均值混合样本制备及验证将 34 株已知浓度的菌株进行分组混合, 参考 FDA 颁布的病原体多重核酸检测试剂指导原则 [19-22],WHO 公布的第一代细菌混合参考品 [23], 以及在美国批准上市的相关试剂的临床数据 [24-25], 制定本参考品的混合原则其中主要包括 : 同一混合样本中的菌株数量不超过 5 株, 其浓度应尽量相近且避免全部为革兰阳性细菌革兰阴性细菌或真菌 [19-22] 混样本中的菌株应为较高浓度, 细菌应约为 ~ CFU/ml, 真菌应约为 ~ CFU/ml 实验室操作应避免交叉污染混合样本制备完成后进行测序验证委托华大基因应用第二代测序技术对样本中所有菌株的全基因组进行测序, 以验证混合样本中菌株的组成及交叉污染情况协作标定及质量标准的制定经过培养浓度测定混合及鉴定的混合样本组成细菌性感染多重核酸检测试剂候选参考品协作标定使用 4 家公司的 7 个检测试剂 ( 盲编为 A ~ G), 根据各自产品特点对候选参考品进行适当稀释后, 按照说明书进行检测所有参考品均封盲检测, 检测结果汇总后再行揭盲根据协作标定的有效结果, 最终确定参考品质量标准稳定性试验取一套参考品置于室温条件 ( 约 25 ) 下进行 3 次反复冻融处理, 然后使用一种多重核酸试剂进行检测, 并委托华大基因进行测序检测结果与正常储存 (-20 ) 的参考品进行比较, 以考核参考品的冻融稳定性此外, 还将对参考品长期稳定性进行监测, 计划每年 2 次 2 结果 2.1 参考品组成本研究选择 34 株临床上可导致脑膜炎, 败血症, 呼吸道肠道及生殖道等感染的致病性细菌和真菌全部菌株经过培养全自动细菌鉴定及药敏分析系统鉴定正确后并测定浓度, 最后进行分组混合 34 株高浓度的细菌和真菌被分成 7 组 (M1 ~ M7), 其中 M1 ~ M6 分别包含 5 种病原体,M7 包含 4 种病原体此外, 每个混合样本中均含有革兰阳性细菌革兰阴性细菌或真菌参考品具体组成见表 1 表 1 参考品组成 Table 1 Composition of reference material 组别菌株菌株革兰染色浓度中文名称英文名称法分类 (CFU/ml) M1 屎肠球菌 Enterococcus faecium 肺炎链球菌 Streptococcus pneumoniae 粘质沙雷氏菌 Serratia marcescens 大肠埃希氏菌 Escherichia coli 表皮葡萄球菌 Staphylococcus epidermidis M2 鲍曼不动杆菌 Acinetobacter baumannii 肺炎克雷伯菌 Klebsiella pneumoniae 热带念珠菌 Candida tropicalis / 克柔念珠菌 Candida krusei / 缓症链球菌 Streptococcus mitis M3 干燥奈瑟氏菌 Neisseria sicca 荧光假单胞菌 Pseudomonas fluorescens 嗜水气单胞菌 Aeromonoas hydrophila 葡萄牙念珠菌 Candida lusitaniae / 嗜肺军团菌 Legionella pneumophila M4 流感嗜血杆菌 Haemophilus influenzae 光滑念珠菌 Candida glabrata / 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 奇异变形杆菌 Proteus mirabilis 无乳链球菌 Streptococcus agalactiae M5 单核细胞增多性李斯特菌 Listeria monocytogenes 阴沟肠杆菌 Enterobacter cloacae 铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa 近平滑念珠菌 Candida parapsilosis / 脑膜炎奈瑟菌 Neisseria meningitidis M6 滕黄微球菌 Micrococcus luteus 马红球菌 Rhodococcus equi 格氏李斯特菌 Listeria grayi 琼氏不动杆菌 Acinetobacter junii 副流感嗜血杆菌 Haemophilus parainfluenzae M7 粪肠球菌 Enterococcus faecalis 白色念珠菌 Candida albicans / 产酸克雷伯菌 Klebsiella oxytoca 化脓链球菌 Streptococcus pyogenes 注 : + 表示革兰阳性细菌 ; - 表示革兰阴性细菌 ; / 表示真菌不适用革兰染色法分类 2.2 参考品验证应用第二代测序技术, 分别对混合参考品 M1 ~ M7 中菌株的全基因组进行测序验证, 结果见表 2 结果显示 M1 中 5 种细菌的总序列占比为 99.4%;M2 ~ M5 中 5 种细菌和真菌的总序列占比分别为 :90.1% 99.0% 98.7% 98.7% 99.1%;M6 中 5 种细菌的总序列占比为 97.7%;M7 中 4 种细菌和真菌的总序列占比为 97.7% 分析测序结果,M1 ~ M7 中的细菌和真菌的组成与预期相符, 且参考品特异性经过验证不存在交叉反应 2.3 协作标定及质量标准的制定参加协作标定的 7 个试剂 ( 试剂 A ~ G) 的检测方法包括 PCR- 熔解曲线等温扩增和第二代测序技术试剂 A ~ C

4 212 传染病信息 2018 年 6 月 30 日第 31 卷第 3 期 Infect Dis Info, Vol. 31, No. 3, June 30, 2018 Table 2 表 2 参考品测序验证结果 Results of reference materials sequencing 参考品测序结果序列占比 (%) M1 屎肠球菌 11.3 肺炎链球菌 2.1 粘质沙雷氏菌 61.3 大肠埃希氏菌 23.7 表皮葡萄球菌 1.0 M2 鲍曼不动杆菌 29.5 肺炎克雷伯菌 48.2 热带念珠菌 2.4 克柔念珠菌 1.4 缓症链球菌 8.6 M3 干燥奈瑟氏菌 9.3 荧光假单胞菌 31.7 嗜水气单胞菌 26.6 葡萄牙念珠菌 1.1 嗜肺军团菌 30.3 M4 流感嗜血杆菌 24.6 光滑念珠菌 3.3 金黄色葡萄球菌 10.4 奇异变形杆菌 53.1 无乳链球菌 7.3 M5 单核细胞增多性李斯特菌 20.7 阴沟肠杆菌 18.6 铜绿假单胞菌 46.0 近平滑念珠菌 1.8 脑膜炎奈瑟菌 12.0 M6 滕黄微球菌 17.0 马红球菌 22.0 格氏李斯特菌 24.8 琼氏不动杆菌 14.7 副流感嗜血杆菌 19.2 M7 粪肠球菌 34.7 白色念珠菌 0.5 产酸克雷伯菌 40.8 化脓链球菌 21.7 注 : 序列占比仅作为定性检测的结果判定依据, 并不代表参考品中各菌株基因组的真实比例为基于等温扩增技术的多重核酸检测试剂, 检测范围分别包括 13 种下呼吸道细菌 16 种致病性细菌和 16 种侵袭性真菌 ; 试剂 D 为基于 PCR 和熔解曲线技术的多重核酸检测试剂, 检测为 24 种血流感染相关细菌和真菌 ; 试剂 E ~ G 为基于第二代测序技术 ( 包括华大基因 Illumina 和赛默飞世尔公司的高通量测序平台 ) 的多重核酸检测试剂, 其中试剂 E 的为 25 种血流感染相关细菌和真菌, 试剂 F 和 G 靶向性检测细菌 16S rrna 基因协作标定结果见表 3 试剂 A 检测出 9 种细菌 ; 试剂 B 检测出 15 种细菌 ; 试剂 C 检测出 5 种真菌 ; 试剂 D 和 E 均检测出 24 种细菌和真菌 ; 试剂 F 检测出 10 种细菌 ; 试剂 G 检测出 25 种细菌根据各试剂产品说明书, 试剂 A ~ E 对于检测范围内的细菌和真菌均检出, 且不在检测范围内的细菌和真菌均未检出 ; 试剂 F 和 G 未检出的细菌数分别为 18 种和 3 种参考品 M1 ~ M7 进行 10 倍系列梯度稀释后, 分别使用试剂 B C 和 D 检测, 结果见表 4 检测原倍 10 倍稀释和 100 倍稀释的 M1 ~ M7 时, 试剂 B 和 D 的检测结果均符合预期, 试剂 C 则未能检测到 100 倍稀释的 M5 中的近平滑念珠菌检测 1000 倍和倍稀释后的 M1 ~ M7 时, 试剂 B C 和 D 未检出的菌株数量均较多 ( 数据未展示 ) 此外, 参考品在各稀释梯度均未发生交叉反应表 3 参考品协作标定结果 Table 3 Results of collaboration study 参考品菌株各试剂检测结果 A B C D E F G M1 屎肠球菌肺炎链球菌粘质沙雷氏菌大肠埃希氏菌表皮葡萄球菌 M2 鲍曼不动杆菌肺炎克雷伯菌热带念珠菌克柔念珠菌缓症链球菌 M3 干燥奈瑟氏菌 - + 荧光假单胞菌 - + 嗜水气单胞菌 + - 葡萄牙念珠菌嗜肺军团菌 M4 流感嗜血杆菌光滑念珠菌金黄色葡萄球菌奇异变形杆菌无乳链球菌 M5 单核细胞增多性李斯特菌阴沟肠杆菌铜绿假单胞菌近平滑念珠菌脑膜炎奈瑟菌 M6 滕黄微球菌 - + 马红球菌 + + 格氏李斯特菌 + + 琼氏不动杆菌 - + 副流感嗜血杆菌 + + M7 粪肠球菌白色念珠菌产酸克雷伯菌化脓链球菌注 :A ~ G 分别表示 7 个参与协作标定的试剂 ; + 表示检出该菌株, 且该菌株在试剂的检测范围内 ; - 表示未检出该菌株, 且该菌株在试剂的检测范围内 ; 检测结果的空白表格表示该菌株不在检测范围 2.4 参考品稳定性参考品 M1 ~ M7 置于室温条件 ( 约 25 ) 下反复冻融 3 次处理后, 与 -20 保存且未经冻融处理的参考品均使用试剂 D 进行检测, 参考品 M3 和 M6 进行全基因组测序, 检测结果见表 5 分析结果显示, 反复冻融 3 次处理并未影响参考品的稳定性

5 传染病信息 2018 年 6 月 30 日第 31 卷第 3 期 Infect Dis Info, Vol. 31, No. 3, June 30, Table 4 material 3 讨论表 4 梯度稀释参考品检测结果 Results of detecting gradient dilution of reference 各试剂检测结果参考品菌株 B C D M1 屎肠球菌肺炎链球菌粘质沙雷氏菌大肠埃希氏菌表皮葡萄球菌 M2 鲍曼不动杆菌肺炎克雷伯菌热带念珠菌克柔念珠菌缓症链球菌 M3 干燥奈瑟氏菌荧光假单胞菌嗜水气单胞菌葡萄牙念珠菌嗜肺军团菌 M4 流感嗜血杆菌光滑念珠菌金黄色葡萄球菌奇异变形杆菌无乳链球菌 M5 单核细胞增多性李斯特菌阴沟肠杆菌铜绿假单胞菌近平滑念珠菌脑膜炎奈瑟菌 M6 滕黄微球菌马红球菌格氏李斯特菌琼氏不动杆菌副流感嗜血杆菌 M7 粪肠球菌白色念珠菌产酸克雷伯菌化脓链球菌注 :B C D 分别表示参与协作标定的试剂 ; + 表示检出该菌株, 且该菌株在试剂的检测范围内 ; 检测结果的空白表格表示该菌株不在检测范围多重核酸检测技术在多重病原体诊断领域的应用带来了更好的时效性准确性以及灵敏度 FDA 不仅先后批准了多个多重核酸诊断试剂产品, 更重要的是其颁布的 4 个专项指导原则对此类试剂的发展具有重要指导意义, 推动了行业发展 [13,19-22] 而目前我国仍缺少多重核酸诊断试剂相关的专项法规或指南病原体核酸检测试剂参考品是经过鉴定的具有代表性的一系列临床分离培养样本或模拟样本, 按照特定组成形式建立的, 是相关试剂质量控制和评价的核心以及产品审评过程的重要依据之一 [17] 传统单一病原体核酸检测试剂的参考品组成一般包括数个阳性参考品阴 [8] 表 5 稳定性检测结果 Table 5 Results of stability test 检测结果参考品菌株 D 全基因组测序冻融未冻融冻融未冻融 M1 屎肠球菌 + + 肺炎链球菌 + + 粘质沙雷氏菌 + + 大肠埃希氏菌 + + 表皮葡萄球菌 + + M2 鲍曼不动杆菌 + + 肺炎克雷伯菌 + + 热带念珠菌 + + 克柔念珠菌 + + 缓症链球菌 + + M3 干燥奈瑟氏菌 + + 荧光假单胞菌 + + 嗜水气单胞菌 + + 葡萄牙念珠菌 + + 嗜肺军团菌 + + M4 流感嗜血杆菌 + + 光滑念珠菌 + + 金黄色葡萄球菌 + + 奇异变形杆菌 + + 无乳链球菌 + + M5 单核细胞增多性李斯特菌 + + 阴沟肠杆菌 + + 铜绿假单胞菌 + + 近平滑念珠菌 + + 脑膜炎奈瑟菌 + + M6 滕黄微球菌 + + 马红球菌 + + 格氏李斯特菌 + + 琼氏不动杆菌 + + 副流感嗜血杆菌 + + M7 粪肠球菌 + + 白色念珠菌 + + 产酸克雷伯菌 + + 化脓链球菌 + + 注 : + 表示检出该菌株, 且该菌株在试剂的检测范围内 ; 检测结果的空白表格表示该菌株不在检测范围性参考品重复性参考品以及最低检出限参考品, 用以全面评价试剂的准确性特异性重复性和灵敏度等核心性能 [14-16] 如按上述思路, 以某个试剂的检测能力为 24 种细菌为例, 须要设置 500 余个参考品基于数量庞大的参考品的质量评价体系, 不仅对于企业和监管部门是沉重的负担, 更严重的是由于缺少混合形式的参考品, 该评价体系不能针对多重核酸检测试剂的技术特点进行全面评价因此, 美国监管部门建议使用混合样本评价多重核酸检测试剂的性能 [19-22] 本研究建立的细菌感染多重核酸检测试剂参考品, 由 7 支混合参考品组成, 包括了 34 株经过鉴定和验证且浓度已知的致病性细菌和真菌参考品制备完成后应用不同试剂进行协作标定并根据检测结果确定质量标准 : 阳性符合率 ( 即准确性 )

6 214 传染病信息 2018 年 6 月 30 日第 31 卷第 3 期 Infect Dis Info, Vol. 31, No. 3, June 30, 2018 应为检测经稀释 ( 终浓度应不低于 CFU/ml) 的混合参考品 M1 ~ M7, 在产品检测范围内的病原菌均应检出, 且与已知型别相符, 不在产品检测范围内的病原菌均不应检出 ; 阴性符合率 ( 即特异性 ) 应为检测经稀释 ( 终浓度应不低于 CFU/ml) 的混合参考品 M1 ~ M7, 不在产品检测范围内的病原菌均不应检出 ; 重复性应为检测稀释至低浓度 ( 不高于产品宣称最低检出限的 10 倍 ) 的混合参考品 M1 ~ M7, 分别重复检测 10 次, 在产品检测范围内的病原菌均应检出, 且与已知型别相符, 不在产品检测范围内的病原菌均不应检出 ; 最低检出限应为检测经 10 倍系列稀释的混合参考品 M1 ~ M7, 终浓度为产品宣称的最低检出限浓度及以上时, 在产品检测范围内的病原菌均应检出, 且与已知型别相符, 不在产品检测范围内的病原菌均不应检出本研究对参考品的冻融稳定性进行了详细考察, 但是仍缺少参考品长期稳定性数据, 在后续研究中应补充完整并持续监测本参考品具有以下优势 : 一是能大幅减少参考品数量 ; 二是能够考察试剂对多个待测菌株的混合样本的分辨率 ; 三是能够考察非待测菌株对待测菌株的干扰 ; 四能够考察样本中高浓度背景核酸对低浓度待测核酸的干扰然而作为第一代参考品, 其所覆盖的病原菌数量有限, 后续换批换代过程中应考虑逐渐增加菌株数量并适当提高其质量标准参考文献 [1] Iwamoto M, Huang JY, Cronquist AB, et al. Bacterial enteric infections detected by culture-independent diagnostic tests- FoodNet, United States, [J]. MMMW Rep, 2015, 64(9):252. [2] Prakash VP, Leblanc L, Alexanderscott NE, et al. Use of a cultureindependent gastrointestinal multiplex PCR panel during a shigellosis outbreak: considerations for clinical laboratories and public health[j]. J Clin Microbiol, 2015, 53(3): [3] Lazcka O, Del Campo FJ Munoz FX. Pathogen detection: a perspective of traditional methods and biosensors[j]. Biosens Bioelectron, 2007, 22(7): [4] Yang S, Rothman RE. PCR-based diagnostics for infectious diseases: uses, limitations, and future applications in acute-care setti[j]. Lancet Infect Dis, 2004, 4(6): [5] Scheler O, Glynn B, Kurg A. Nucleic acid detection technologies and marker molecules in bacterial diagnostics[j]. Expert Rev Mol Diagn, 2014, 14(4): [6] Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, et al. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification[j]. Nucleic Acids Res, 1988, 16(23): [7] Li Y, Luo D. Multiplexed molecular detection using encoded microparticles and nanoparticles[j]. Expert Rev Mol Diagn, 2006, 6(4):567. [8] Subramony A, Zachariah P, Krones A, et al. Impact of multiplex polymerase Chain reaction testing for respiratory pathogens on healthcare resource utilization for pediatric inpatients[j]. J Pediatr, 2016, 173: [9] 赵焕英, 薛冰, 方霄, 等. 聚合酶链反应 - 高分辨率熔解曲线技术在下呼吸道细菌鉴定中的应用 [J]. 微生物与感染, 2015,10(5): [10] 刘妙娥, 冯慧艳, 王立军. 多种呼吸道病原微生物快速筛查技术的建立 [J]. 中国医学工程,2015,10: [11] 刘宁伟, 刘威, 黄留玉. 多重核酸检测技术研究进展 [J]. 生物技术通讯, 2016,27(4): [12] 李林海, 陈丽丹, 肖斌, 等. 宏基因组测序在感染性疾病病原体检测中的应用 [J]. 传染病信息,2018,31(1): [13] Food and Drug Administration. Nucleic acid based testsmultiplex panel[eb/ol]. [ ]. fda.gov/medicaldevices/productsandmedicalprocedures/ InVitroDiagnostics/ucm htm. [14] 刘东来, 张岩, 李玉华, 等. 寨卡病毒核酸检测试剂应急参考品的建立 [J]. 中国病毒病杂志, 2017,(5): [15] 周海卫, 沈舒, 石大伟, 等. 第二代甲型 H1N1 流感病毒核酸检测试剂参考品的建立 [J]. 中国病毒病杂志,2016,1: [16] 田亚宾, 周海卫, 刘东来, 等. 水痘带状疱疹病毒 IgG 抗体检测试剂国家参考品的研制 [J]. 中国生物制品学杂志, 2017,30(4): [17] 国家食品药品监督管理总局. 体外诊断试剂注册管理办法 [EB/OL]. [ ]. CL0053/ html. [18] Goldman E, Green LH. Practical handbook of microbiology[m]. 3rd Ed. USA: CRC Press, Taylor and Francis Group, 2015:864. [19] Food and Drug Administration. Class II special controls guidance document respiratory viral panel multiplex nucleic acid assay [EB/OL]. [ ]. medicaldevices/deviceregulationandguidance/guidancedocuments/ ucm pdf. [20] Food and Drug Administration. Highly multiplexed microbiological medical countermeasure in vitro nucleic acid based diagnostic devices[eb/ol]. [ ]. downloads/medicaldevices/deviceregulationandguidance/ GuidanceDocuments/UCM pdf. [21] Food and Drug Administration. Class II special controls guideline: gastrointestinal microorganism multiplex nucleic acid-based assays for detection and identification of microorganisms and toxin genes from human stool specimens[eb/ol]. [ ]. DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/UCM pdf. [22] Food and Drug Administration. Class II special controls guideline: multiplex nucleic acid assay for identification of microorganisms and resistance markers from positive blood cultures[eb/ol]. [ ]. fdagov-meddev-gen/documents/document/ucm pdf. [23] Montag L, Thomas, Stoermer, et al. Report on the international validation study on bacteria standards (transfusion-relevant bacterial strain panel) and proposal for a validation study for enlargement of the transfusion-relevant bacterial strain panel: proceedings of the World Health Organization Biologicals Unit & WHO Expert Committee on Biological Standardization, Geneva, Switzerland, 2010[C]. Geneva: World Health Organization, [24] Salimnia H, Fairfax MR, Lephart PR, et al. Evaluation of the filmarray blood culture identification panel: results of a multicenter controlled trial[j]. J Clin Microbiol, 2016, 54(3): [25] Buss SN, Leber A, Chapin K, et al. Multicenter evaluation of the biofire filmarray gastrointestinal panel for etiologic diagnosis of infectious gastroenteritis [J]. J Clin Microbiol, 2015, 53(3): ( 收稿修回 ) ( 本文编辑胡玫 )

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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210 传染病信息 2018 年 6 月 30 日第 31 卷第 3 期 Infect Dis Info, Vol. 31, No. 3, June 30, 2018 试剂的方法包括 PCR 熔解曲线 等温扩增以及第二代测序技术 ( 又称高通量测序或下一代测序技术 ) 等 [11-12] 目前,FD

210 传染病信息 2018 年 6 月 30 日第 31 卷第 3 期 Infect Dis Info, Vol. 31, No. 3, June 30, 2018 试剂的方法包括 PCR 熔解曲线等温扩增以及第二代测序技术 ( 又称高通量测序或下一代测序技术 ) 等 [11-12] 目前,FD