中国卫生检验杂志 2016 年 11 月第 26 卷第 22 期 ChinJHealthLabTec,Nov.2016,Vol.26,No 因对医生确定抢救方案和对事故进行科学调查具有重要的意义目前, 国内外对抗凝血类灭鼠剂的检测方法有分光光度法 [2] 薄层色谱法 (TLC) [

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东礼艾
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1 3196 三重四级杆液质联用法快速测定全血样中 9 种抗凝血类灭鼠剂论著贾玉珠, 蔡伟鹏, 陈丽惠, 白艳艳, 骆和东, 朱宝平厦门市疾病预防控制中心, 福建厦门摘要 : 目的建立三重四级杆液质联用法, 同时测定鼠药中毒患者血液样品中 9 种常见抗凝血类灭鼠剂 ( 杀鼠醚杀鼠灵敌鼠钠盐氯敌鼠溴敌隆大隆杀它仗鼠得克氯杀鼠灵 ) 方法试样用乙腈提取, 高速冷冻离心, 过 0.2μm 滤膜, 直接经液相色谱柱分离, 在 MRM 模式下以三重四级杆质谱检测器测定血液中 9 种灭鼠剂结果本方法中, 9 种抗凝血类灭鼠剂的空白血样加标回收率为 75.3% ~109.8%, 相对标准偏差为 2.6% ~10.8%, 在 0.05μg/L~ μg/L 的浓度内, 相关系数 >0.998, 检出限为 0.004μg/L~1.200μg/L, 定量限为 0.014μg/L~4.000μg/L 结论该法简单快速灵敏度高定性确证和定量准确, 可同时对血液中溴敌隆大隆氯敌鼠杀鼠灵等 9 种灭鼠剂进行定性确证和定量测定, 满足突发中毒事件快速应急检测的要求关键词 : 三重四级杆液质联用法 ; 中毒 ; 全血 ; 抗凝血类灭鼠剂中图分类号 : 文献标识码 :A 文章编号 : (2016) Quickdeterminationof9anticoagulantrodenticidesinwholebloodbyliquid chromatography-triplequadrupoletandem masspectrometer JIAYu-zhu,CAIWei-peng,CHENLi-hui,BAIYan-yan,LUOHe-dong,ZHUBao-ping XiamenMunicipalCenterforDiseaseControlandPrevention,Xiamen,Fujian361021,China Abstract:Objective Todevelopamethodforthesimultaneousdetectionof9anticoagulantrodenticides(Bromadiolone,Brod ifacoum,chlorophacinone,warfarin,bromadiolone,brodifacoum,flocoumafen,neosorexa,coumachlor)inthebloodsam plesofrodenticidespoisoningpatientsbasedonliquidchromatography-triplequadrupoletandem masspectrometer(lc/ms/ MS).Methods Thesampleswereextractedbyacetonitrileandcentrifugatedathighspeedover0.2μmfiltrationmembrane, separatedbyliquidchromatographycolumn,andthenmeasuredinmrm modebylc/ms/msmethod.results Theaverage recoveriesof9anticoagulantrodenticidesinblankbloodsampleswerewithin75.3% %,andtherelativestandarddevi ations(rsds)werewithin2.6% -10.8%.Thelinearitiesofthemethodwerewithin0.05μg/L μg/L,withthecor relationcoeficients(r)greaterthan0.998.thelimitofdetectionandquantificationwerewithin0.004μg/l-1.200μg/land 0.014μg/L-4.000μg/L,respectively.Conclusion Themethodissimple,rapid,sensitiveandspecific.It savailableto simultaneouslydetect9anticoagulantrodenticideswithaccuratequalitativeandquantitativeresults,meetingthedemandofrapid emergencydetectionofpoisoningincidents. KeyWords:Liquidchromatography-triplequadrupoletandemmasspectrometer;Poisoning;Blood;Anticoagulantrodenti cides 抗凝血灭鼠剂又称慢性杀鼠剂, 由 4- 羟基香豆素或茚二酮母体结构衍生而来, 能抑制体内凝血酶原的合成和使毛细血管壁脆裂, 导致内脏出血不凝流血不止而使鼠在数天后死亡最常用的茚二酮母体结构衍生抗凝血灭鼠剂主要有氯敌鼠敌鼠等 ; 香豆素类抗凝血灭鼠剂则通常被划分为二代, 第一代包括杀鼠醚杀鼠灵氯杀鼠灵等, 其灭鼠作用缓慢, 需几天内多次累积食用方可灭鼠 ; 第二代主要包括溴敌基金项目 : 厦门市科技计划社会发展项目资助 (3502z ) 作者简介 : 贾玉珠 (1964-), 男, 硕士, 主任技师, 主要从事食品理化检验工作隆大隆杀它仗鼠得克等, 为单次食用即可灭鼠的高效灭鼠剂抗凝血灭鼠剂可分布到身体的各个组织, 口服几分钟到 1h 在血浆中达到最高浓度, 临床发病时间 >36h 在狗的血液中, 杀鼠灵的半衰期约为 14h 敌鼠的半衰期约为 4.5d 大隆的半衰期约为 6d [1] 因此, 较长的半衰期使血液成为抗凝血类灭鼠剂中毒检测的首选样本长期以来, 抗凝血类灭鼠剂 ( 鼠药 ) 在生产生活中被人们广泛使用, 由灭鼠剂引起的中毒事件也十分突出, 尤其是由投毒或误食引起的集体鼠药中毒事故抗凝血类灭鼠剂中毒易与一些内科疾病混淆, 因此对鼠药中毒样品快速定性和定量检测, 弄清中毒原

2 中国卫生检验杂志 2016 年 11 月第 26 卷第 22 期 ChinJHealthLabTec,Nov.2016,Vol.26,No 因对医生确定抢救方案和对事故进行科学调查具有重要的意义目前, 国内外对抗凝血类灭鼠剂的检测方法有分光光度法 [2] 薄层色谱法 (TLC) [3] 高效液相色谱法 (HPLC) [4-8] 液质联用法 (HPLC-MS/MS) [9-13] 气质联用法 (GC-MS) 等 [14] 分光光度法和薄层色谱法由于检测灵敏度低定性差, 难于满足检测要求 ; HPLC 法只有保留时间定性, 定性差, 有可能导致假阳性 ;GC-MS 法样品前处理繁琐衍生化复杂, 且抗凝血杀鼠剂的相对分子量较大, 不易气化, 不适合 GC- MS 测定而 HPLC-MS/MS 法结合了色谱分离和质谱结构确认技术的优势, 样品预处理简单, 不需衍生化, 可同时对多个组分定性和定量测定, 具有灵敏度高检出限低定量准确等优点, 因此液质联用法逐渐成为检测抗凝血杀鼠剂的首选方法本研究采用三重四级杆液质联用法, 同时对中毒患者血液中 9 种抗凝血鼠药 ( 杀鼠醚杀鼠灵敌鼠钠盐氯敌鼠溴敌隆大隆杀它仗鼠得克氯杀鼠灵 ) 进行快速定性确证和定量分析中毒样品用乙腈简易提取, 高速冷冻离心, 过滤, 经 C 18 柱分离, 三重四级杆液质联用仪测定该方法灵敏度高检出限低且样品预处理简单, 可快速对抗凝血类鼠药中毒样品进行定性判断和定量检测, 为查明中毒事故原因和临床抢救提供科学技术支持 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂美国 Agilent 公司 6460Triple Quad 液质联用仪 ( 配电喷雾离子源和 MasHunter 数据分析系统 ); 美国 Agilent 公司 1200 高效液相色谱仪 ( 配 DAD 检测器 ; 在线脱气机 ; 自动进样器和二元泵 ) PEAK 公司的 NM32LA 型氮气发生器美国 OA 公司 N-EIAP3 氮吹仪 ;SIGMA 公司的冷冻高速离心机 ; 昆山市超声仪器有限公司的 KQ-500E 型超声波清洗机 ; 上海沪西分析仪器厂有限公司的 WH-2 微型漩涡混合仪 Sartorius 公司的 MSE224S-CE 型万分之一电子天平标准品杀鼠醚 (CAS# , 纯度 99.5% ±0.5%, 批号 :437-88C); 杀鼠灵 (CAS# , 纯度 99.5% ±0.5%, 批号 : A); 敌鼠钠盐 (CAS# , 纯度 98.9%, 批号 : B); 氯敌鼠 (CAS# , 纯度 99.5%, 批号 :437-88B); 溴敌隆 (CAS# , 纯度 99.5%, 批号 : B); 杀它仗 (CAS# , 纯度 99.0%, 批号 : A); 鼠得克 (CAS# , 纯度 99.5%, 批号 :437-25C); 标准品氯杀鼠灵 (CAS# , 纯度 99.9%, 批号 :376-14A); 大隆 (CAS# , 纯度 99.3%, 批号 :376-17C) 纯水为美国 MILLI PORE 公司的 Mili-Q 纯水机制一级水, 满足 GB/ T6682 规定 ; 美国 TEDIA 公司的丙酮 (HPLC 级, 批号 : ); 乙腈 (HPLC 级, 批号 : ) 和甲醇 (HPLC 级, 批号 :711915); 美国 SIGMA 公司的乙酸铵 ( 纯度 98%, 批号 :115K0711) 1.2 方法高效液相色谱仪条件色谱柱为 ZORBAXE clipsexdb-c 18 (4.6mm 50mm,1.8μm),Agilent Technologies; 流动相 A 为 10mmol/L 乙酸铵溶液,B 为乙腈, 梯度洗脱 ( 表 1); 流速为 0.3ml/min; 进样量为 5μl; 柱温为 35, 运行 13min 表 1 梯度洗脱条件时间 (min) 流速 (ml/min) A(%) B(%) 质谱条件离子源为 ESI -, 气流温度 : 325 ; 气流速度 :6L/min; 雾化气 :40psi; 鞘气 (N 2 ) 温度 :350 ; 鞘气 (N 2 ) 流速 :11L/min; 毛细管电压 : 4500V; 喷雾电压 :0 V; 扫描模式 : 多反应监测 (MRM); 其他质谱参数见表 2 表 2 质谱仪的质谱条件母离子子离子驻留时间提取电压碰撞能量化合物 (m/z) (m/z) (ms) (V) (ev) 杀它仗 a 溴敌隆 a 大隆 a 鼠得克 a 氯敌鼠 a 氯杀鼠灵 a 敌鼠钠盐 a 杀鼠灵 a 杀鼠醚 a 注 :a 表示定量离子

3 实验方法标准溶液的配制分别称取 10mg 各标准品, 转移至 10ml 容量瓶中, 并用丙酮溶解, 用乙腈定容至刻度, 配制成 1.0g/L 的标准储备液, 于 4 避光保存根据各组分在质谱仪的响应信号强度, 分别移取适量各标准储备液 10ml 容量瓶中, 用乙腈定容, 配制混合标准使用液, 于 4 避光保存检测时根据需要再以空白血样提取的乙腈逐级稀释至所需浓度样品测定液的制备取中毒患者血样 1.0ml 于 10ml 聚四氟乙烯离心管中, 加入 3ml 乙腈, 密封, 均质器混匀 1min, 振荡器振荡 10min, 再超声提取 10min, 于 4 下用冷冻离心机离心 10min (12000r/min), 取上清液 1ml 过 0.2μm 滤膜于上样瓶中, 备测 2 结果 2.1 样品提取目前国内外通用提取方法有固相萃取和液液萃取, 其中液液萃取方法多用乙酸乙酯乙腈甲醇丙酮 [15] 乙醚提取 [16], 以及这些试剂的混合提取, 如乙腈 - 丙酮 [17] 乙腈 - 乙醚氯仿 - 丙酮等 [18] 本研究试用丙酮甲醇和乙腈提取全血样中 9 种抗凝血类鼠药, 由于乙腈除了提取各组分外, 还可以沉淀血样中的蛋白质, 减少干扰, 过膜后可直接进样, 提取步骤简单快速, 回收率 >75%, 故选用乙腈作为萃取剂 2.2 液相色谱条件的优化为更好的对样品进行分离, 比较了几种 C 18 柱,XDB-C 18 分离效果最好, 最后选择 ZORBAXEclipseXDB-C 18 柱 ; 流动相优化时, 比较了纯水 5mmol/L 乙酸铵溶液 10mmol/L 乙酸铵溶液和甲醇乙腈的各种比例, 确定 10mmol/L 乙酸铵溶液和乙腈为最优, 并通过改变乙腈的比例, 采用梯度洗脱,9 个组分全部流出时间 <8min, 全部运行时间为 13min 2.3 质谱条件的确立在电喷雾负离子检测方式下对杀它仗溴敌隆大隆鼠得克氯敌鼠氯杀鼠灵敌鼠钠盐杀鼠灵和杀鼠醚进行一级质谱分析, 得到分子离子, 即母离子, 并优化提取电压 ; 然后对分子离子进行二级质谱分析 ( 子离子扫描 ) 得到碎片离子信息, 即子离子 ; 优化碎裂电压和碰撞能量二级质谱参数, 使得分子离子强度以及由分子离子产生的特征碎片离子强度达到最大时为最佳, 得到待测组分的二级质谱图, 按照二级质谱图提供的碎片离子信息, 选择待测组分的定性定量离子对, 然后再分别优化离子源各项参数, 使待测组分的响应信号最大 ( 图 1)

4 中国卫生检验杂志 2016 年 11 月第 26 卷第 22 期 ChinJHealthLabTec,Nov.2016,Vol.26,No 注 :A: 杀它仗 ;B: 溴敌隆 ;C: 大隆 ;D: 鼠得克 ;E: 氯敌鼠 ;F: 氯杀鼠灵 ;G: 敌鼠钠盐 ;H: 杀鼠灵 ;I: 杀鼠醚图 1 基质匹配混合标准溶液的 9 种抗凝血类灭鼠剂 MRM 定量离子提取色谱图 2.4 标准曲线及其线性范围配制浓度为 0.05μg/L~ μg/L 的混合标准溶液, 进行检测, 仪器软件自动以定量离子的峰面积与组分的质量浓度作图得到校准曲线检测结果表明, 浓度为 0.05μg/L~500.00μg/L 时,9 种抗凝血类灭鼠剂在各自不同浓度范围内都具有良好的线性, 相关系数 (r) 均 >0.998, 检出限为 0.004μg/L~1.200μg/L, 定量限为 0.014μg/L~ 4.000μg/L( 表 3) 2.5 方法的检出限以空白血样的乙腈提取液逐级稀释混合标准溶液至如下浓度, 杀它仗为 0.05μg/L, 氯敌鼠为 0.25μg/L, 溴敌隆大隆鼠得克氯杀鼠灵杀鼠灵为 0.5μg/L, 敌鼠钠盐和杀鼠醚为 5.0μg/L, 过 0.2μm 滤膜后进样, 以信噪比 3 确定检出限 (LOD), 以信噪比 10 确定定量限 (LOQ)( 表 3) 表 3 9 种抗凝血类灭鼠剂的线性回归方程相关系数及定性限和定量限化合物线性回归方程线性范围 LOD LOQ 相关系数 (μg/l) (μg/l) (μg/l) 杀它仗 y= x ~ 溴敌隆 y=5439.1x ~ 大隆 y=1279.2x ~ 鼠得克 y= x ~ 氯敌鼠 y=5509.5x ~ 氯杀鼠灵 y= x ~ 敌鼠钠盐 y= x ~ 杀鼠灵 y=9389.2x ~ 杀鼠醚 y= x ~ 方法的回收率以非中毒患者的血液作为空白血样, 移取 1.0ml 空白血样 18 份, 分别加入浓度为杀

5 3200 它仗 (5.0μg/L) 氯敌鼠 (25.0μg/L) 溴敌隆大隆鼠得克氯杀鼠灵杀鼠灵 (50.0μg/L) 敌鼠钠盐和杀鼠醚 (500.0μg/L) 的混合标准溶液 0.05ml 0.4ml 和 1.0ml( 每组 6 份 ), 混匀, 按样品提取方法处理并测定 ( 计算回收率时应考虑加入混合标准溶液的体积 ) 测得回收率为 75.3% ~109.8%, RSD 为 2.6% ~10.8%( 表 4) 表 4 血样中添加 9 种抗凝血类灭鼠剂的回收率和精密度 (n=6) 组分加标浓度 (μg/l) 回收率 (%) RSD(%) 杀它仗 ~ ~6.9 溴敌隆 ~ ~7.5 大隆 ~ ~7.0 鼠得克 ~ ~7.5 氯敌鼠 ~ ~9.3 氯杀鼠灵 ~ ~9.7 敌鼠钠盐 ~ ~9.8 杀鼠灵 ~ ~9.0 杀鼠醚 ~ ~ 试剂空白试验为了排除试剂和器皿污染造成的阳性, 每次中毒检测均做试剂空白试验除不称取样品外, 其余步骤按中所述的方法进行 2.8 实样测试本研究利用该研究建立的方法, 对某市疑是抗凝血类鼠药中毒患者的近 100 份血样进行测定, 最高值为大隆 1200μg/L 溴敌隆 1500μg/L, 其中 2011 年年主要检出大隆,2014 年年主要检出溴敌隆 ; 另外, 在疑是投毒的酱油样品中, 利用该法检出大隆 1840μg/L 3 结论本实验用乙腈快速提取中毒血液样品中的鼠药组分, 建立了一种基于高效液相色谱与三重四级杆质谱联用技术, 同时对中毒患者血液中 9 种抗凝血类灭鼠药进行快速定性确证和定量测定的分析方法, 检出限为 0.004μg/L~1.20μg/L, 定量限为 0.014μg/L~ 4.00μg/L 本方法简便快速, 同时灵敏度高定性确证和定量准确, 满足突发鼠药中毒事件应急检测的要求参考文献 [1] ImranM,ShafiH,WatooSA,etal.Analyticalmethodsfordeter minationofanticoagulantrodenticidesinbiologicalsamples[j]. ForensicSciInt,2015,253: [2] 潘振球, 陈球, 莫志深. 紫外分光光度法测定毒饵中杀鼠醚含量 [J]. 农药,1992,31(32): [3] 李青, 方赤光, 常新. 薄层色谱法快速测定毒饵中的溴敌隆 [J]. 中国公共卫生,1993,9(11):523. [4] 王颖, 刘丽萍, 雒丽娜, 等. 高效液相色谱法同时测定全血中 7 种杀鼠剂 [J]. 中国卫生检验杂志,2009,19(9): [5] 金米聪, 陈晓红. 高效液相色谱 - 荧光检测法同时测定全血中 5 种香豆素类灭鼠剂 [J]. 色谱,2007,25(2): [6] 蔡欣欣, 张秀尧. 高效液相色谱法紫外检测器串联荧光检测器同时测定血浆中 10 种抗凝血类杀鼠剂 [J]. 中国卫生检验杂志,2008,18(12): [7] 陈海燕, 陈晓红, 金米聪. 高效液相色谱法测定谷类食物中 3 种茚满二酮类鼠药研究 [J]. 中国卫生检验杂志,2008,18 (12): [8] HaoY,DongXF,LiangSX,etal.Analysisoffouranticoagulants rodenticidesinfoodstufandbodyfluidsbyhigh-performanceliq uidchromatographywithphotodiode-araydetector[j].anal Methods,2014,6(7): [9] SchafJE,MontgomeryMA.AnHPLC-HR-MS-MSmethodfor identificationofanticoagulantrodenticidesinblood[j].janal Toxicol,2013,37(6): [10] 金米聪, 马建明, 李小平, 等. 全血中杀鼠醚的高效液相色谱 - 电喷雾电离质谱联用法测定研究 [J]. 中国卫生检验杂志,2005,15(6): [11] 宓捷波, 张骏, 王云凤, 等. 蔬菜水果中 4 种抗凝血灭鼠剂残留的高效液相色谱 - 串联质谱法测定 [J]. 分析测试学报, 2008,27(11): [12] MarsálekP,ModráH,DoubkováV,etal.Simultaneousdetermi nationoftenanticoagulantrodenticidesintisuesbycolumn-switc hinguhplc-esi-ms/ms[j].analbioanalchem,2015,407 (25): [13] YanH,XiangP,ZhuL,etal.Determinationofbromadioloneand brodifacouminhumanbloodusinglc-esi/ms/msanditsappli cationinfoursuperwarfarinpoisoningcases[j].forensicsciint, 2012,222(1/3): [14] ZhangPP,ShiZG,YuQW,etal.Anewdeviceformagneticstir ringasisteddispersiveliquid liquidmicroextractionofuvfilters inenvironmentalwatersamples[j].talanta,2011,83(5): [15] GalocchioF,BasilicataL,BenetiC,etal.Muti-residuedeter minationofelevenanticoagulantrodenticidesbyhigh-performance liquidchromatographywithdiodearay/flurimetricdetection:inves tigationofsuspectedanimalpoisoningintheperiod in north-easternitaly[j].forensicsciint,2014,244: [16] O BryanSM,ConstableDJ.Quantificationofbrodifacouminplas maandlivertisuebyhplc[j].janaltoxicol,1991,15(3): [17] MeiserH.DetectionofanticoagulantresiduesbyanewHPLCmeth odinspecimensofpoisonedanimalsandapoisoncontrolcasestudy [J].JAnalToxicol,2005,29(6): [18] KuijpersEA,HartighJD,SavelkoulTJ,etal.Amethodforthe simultaneousidentificationandquantitationoffivesuperwarfarinro denticidesinhumanserum[j].janaltoxicol,1995,19(7): 收稿日期 :

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不同基源石斛属植物不同来源商品石斛徐蓓杨莉陈崇崇王峥涛徐珞珊建立黄草类石斛的薄层色谱定性鉴别方法采用薄层色谱法考察不同基源石斛及商品药材中专属性成分联苄类化合物毛兰素石斛酚杓唇石斛素和三羟基甲氧基联苄的薄层色谱行为对石斛药材进行定性鉴别通过种不同基源的石斛及批商品石斛的薄层色谱鉴别证明此方法专属性强操作简单重复性好为石斛的鉴别提供了一种准确有效的新方法本方法可用于黄草类石斛的鉴别为中药石斛的质量标准研究提供科学依据

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