范理宏, 等. IGF-1R 抑制剂联用可增强人非小细胞肺癌 PC9/G 细胞对吉非替尼的敏感性 223 human non-small cell lung cancer cell line PC9/G to gefitinib. [KEY WORDS] Carcinoma, non-small c

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砚绎聂
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1 222 肿瘤 2011 年 3 月第 31 卷第 3 期 Tumor Vol. 31, March, 2011 DOI: /j.issn Basic Research 基础研究 IGF-1R 抑制剂联用可增强人非小细胞肺癌 PC9/G 细胞对吉非替尼的敏感性 1, 范理宏 2, 祁慧薇 2 1, 王杰军 1. 第二军医大学长征医院肿瘤科, 上海 ;2. 上海交通大学附属第六人民医院肺内科, 上海 [ 摘要 ] 目的 : 观察单用表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor, EGFR) 的酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼 (gefitinib) 或联合胰岛素生长因子 -1 受体 (insulin-like growth factor-1 receptor,igf-1r) 的酪氨酸激酶抑制剂 AG1024 作用于人非小细胞肺癌耐药株 PC9/G 细胞后, 该细胞对吉非替尼耐药性的影响, 并探讨 IGF-1R 与肿瘤细胞耐药的相关机制方法 : 用吉非替尼和 AG1024 单独或联合作用于 PC9/G 细胞后, 采用 MTT 法分别检测各组细胞的增殖情况, 并利用中效原理判断两药联用的效果 ;FCM 法检测各组细胞的凋亡情况 ;Western 印迹法检测各组细胞的磷酸化 EGFR(phosphorylated EGFR, p-egfr) 磷酸化 Akt(phosphorylated Akt,p-Akt) 和磷酸化细胞外信号调节激酶 (phosphorylated extracellular signal-regulated kinase,p-erk) 的表达水平结果 : 吉非替尼和 AG1024 单独作用于 PC9/G 细胞后, 均出现不同程度的细胞增殖抑制作用和细胞凋亡促进作用 ; 而吉非替尼和 AG1024 联合作用, 能更显著地抑制细胞增殖, 且凋亡细胞显著增加 (P <0.05) Western 印迹法检测发现, 联合用药组的 p-egfr p-akt 和 p-erk 蛋白表达量明显减少结论 :IGF-1R 抑制剂 AG1024 和 EGFR 抑制剂吉非替尼联用具有较好的协同作用, 可能通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡, 提高耐药细胞对吉非替尼的敏感性 [ 关键词 ] 癌, 非小细胞肺 ; 受体,IGF1 型 ; 受体, 表皮生长因子 ; 蛋白激酶抑制药 ; 抗药性, 肿瘤 ; 吉非替尼 [ 中图分类号 ] R734.2 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2011) A combination with IGF-1R inhibitior enhances the sensitivity of human non-small cell lung cancer cell line PC9/G to gefitinib FAN Li-hong 1, 2, QI Hui-wei 2, WANG Jie-jun 1 1. Department of Oncology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai , China; 2. Department of Respiratory Medicine, Shanghai Sixth People s Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai , China [ABSTRACT] Objective: To observe the effect of gefitinib alone or in combination with AG1024 (a tyrosine kinase inhibitor of insulin-like growth factor-1 receptor) on drug resistance of human nonsmall cell lung cancer cell line PC9/G with acquired-resistance to gefitinib, and to discuss its possible mechanism. Methods: PC9/G cells were treated with AG1024 or gefitinib alone or in combination, the proliferative activity of PC9/G cells was detected by MTT method, and the efficacy of combination therapy was assessed by median-effects principle. Apoptosis rate of PC9/G cells was examined by flow cytometry. The expression levels of phosphorylated epidermal growth factor receptor (p-egfr), phosphorylated- Akt (p-akt) and the phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (p-erk) in PC9/G cells were detected by Western blotting. Results: PC9/G cells displayed apoptotic features after treatment with AG1024 or gefitinib alone, and the cell proliferation was inhibited to different degrees. The treatment of AG1024 combined with gefitinib had a synergistic effect on the apoptosis and the cell proliferation (P <0.05) of PC9/G cells, as well as the expression levels of p-egfr, p-akt and p-erk proteins were decreased. Conclusion: AG1024 in combination with gefitinib exerts a synergistic effect, which may lead to the proliferation inhibition and the apoptosis enhancement, and eventually increases the sensitivity of [ 基金项目 ] 上海市卫生局科研课题计划项目 ( 编号 :054014) Correspondence to:wang Jie-jun ( 王杰军 ) jiejunwang@csco.org.cn

2 范理宏, 等. IGF-1R 抑制剂联用可增强人非小细胞肺癌 PC9/G 细胞对吉非替尼的敏感性 223 human non-small cell lung cancer cell line PC9/G to gefitinib. [KEY WORDS] Carcinoma, non-small cell lung; Receptor, IGF type 1; Receptor, epidermal growth factor; Protein kinase inhibitors; Drug resistance, neoplasm; Gefitinib [Tumor, 2011,31(3): ] 肺癌是目前世界上发病率和病死率最高的恶性肿瘤, 其中非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer,nsclc) 占肺癌的 75% ~ 85% 大部分 NSCLC 患者就诊时已经属于中晚期, 失去手术机会, 而传统放化疗的治疗效果已不明显, NSCLC 患者 5 年生存率仅为 5% ~ 10% 近年来, 新型靶向治疗药物在临床实践中取得了显著疗效, 其中表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor, EGFR) 的酪氨酸激酶抑制剂是目前成功应用于 NSCLC 治疗的小分子靶向药物, 而且吉非替尼 (gefitinib) 是其代表药物之一但许多患者对 EGFR 的酪氨酸激酶抑制剂可以产生原发性或获得性耐药, 其中一个重要的机制是抑制 EGFR 活性的信号通路下游发生了改变, 例如胰岛素生长因子 -1 受体 (insulin-like growth factor-1 receptor,igf-1r) 途径的持续激活因此, 本研究选取由对吉非替尼敏感的 NSCLC 细胞株 PC9 诱导突变产生的对吉非替尼耐药的细胞株 PC9/G 为研究对象, 观察用 IGF-1R 的酪氨酸激酶抑制剂 AG1024 抑制 IGF-1R 信号通路后, 耐药细胞对吉非替尼的耐药性变化以及下游通路蛋白的表达水平变化 1 材料与方法 1.1 实验材料人 NSCLC 细胞株 PC9 和 PC9/ G 均由上海市肺科医院肿瘤科惠赠 ;RPMI 1640 培养液和胎牛血清购自美国 Gibco 公司 ;MTT 购自美国 Sigma 公司 ;Annexin Ⅴ -FITC 凋亡检测试剂盒购自美国 BD PharMingen 公司 ; 兔抗人磷酸化 EGFR(phosphorylated EGFR,p-EGFR) 多克隆抗体购自美国 Epitomics 公司 ; 磷酸化 Akt [phosphorylated-akt,p-akt(ser273)] 多克隆抗体和 IGF-1R 酪氨酸激酶抑制剂 AG1024 购自美国 Santa Cruz 公司 ; 磷酸化细胞外信号调节激酶 (phosphorylated extracellular signal-regulated kinase,p-erk) 多克隆抗体购自美国 Cell Signaling Technology 公司吉非替尼购自英国 Astra Zeneca 公司, 去除糖衣后溶解于 DMSO, 制成浓度为 μmol/l 的溶液, 分装保存于 - 20 冰箱中备用, 实验时用培养液稀释至目标浓度, 使终溶液中 DMSO 体积分数 < 0.005% 酶联免疫检测仪为芬兰 Thermo Labsystems 公司产品 ; 流式细胞仪为美国 Beckman Coulter 公司产品 ; 其他试剂均为国产分析纯 1.2 细胞培养分别将 PC9 和 PC9/G 细胞常规培养于含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养液中, 置于 37 CO 2 体积分数为 5% 的培养箱中孵育, 每 3 d 传代 1 次选取处于对数生长期的细胞进行后续实验 1.3 MTT 法检测细胞增殖和耐药情况取处于对数生长期的 PC9 和 PC9/G 细胞, 用胰酶消化, 调整细胞密度为个 /ml 以每孔 100 μl 接种于 96 孔板, 细胞贴壁后, 分别加入不同浓度的吉非替尼单药 ( 和 μmol/l) 不同浓度的 AG1024 单药 ( 和 μmol/l) 以及联合加入 AG1024(10.00 μmol/l) 和不同浓度的吉非替尼 ( 和 μmol/l), 进行药物干预, 每个浓度设 5 个复孔同时设空白对照组和仅含有 DMSO 的阴性对照组培养 72 h 后, 每孔加人 MTT (5 mg/ml) 10 μl,37 培养 4 h 后吸弃上清液, 每孔加入 DMSO 150 μl, 振荡 15 min, 用酶联免疫检测仪在波长 492 nm 处测定吸光度 (D ) 值细胞生长抑制率 =( 实验组平均 D 值 - 空白组平均 D 值 )/( 对照组平均 D 值 - 空白组平均 D 值 ) 100% 采用直线回归方法计算药物的半数抑制浓度 (half maximal inhibitory concentration, IC 50 ) 值实验重复 3 次耐药指数 = 耐药细胞株药物 IC 50 / 亲代细胞株药物 IC 50 用耐药逆转倍数 (reversal fold,rf) 评价逆转效果,RF = 不加逆转剂时药物 IC 50 / 加逆转剂时药物 IC 计算吉非替尼和 AG1024 的联合作用效果根 [1] 据中效原理, 采用 Chou-Talalay 联用指数法来判定 2 种药物对 PC9/G 细胞增殖的联合作用按中效方程式计算出不同抑制率时两药的单用和联用浓度, 公式如下 :D = D m [f a /(1 - f a )] 1/m ; 式中 D 为药物浓度,D m 为中效浓度,f a 为细胞增殖抑制率,m 为斜率 2 种药物的联用指数 (combination index,ci) 的计算公式如下 :CI = (D ) 1 /(D x ) 1 + (D ) 2 /(D x ) 2 + a(d ) 1 (D ) 2 /

3 224 范理宏, 等. IGF-1R 抑制剂联用可增强人非小细胞肺癌 PC9/G 细胞对吉非替尼的敏感性 (D x ) 1 (D x ) 2 ; 其中 (D x ) 1 和 (D x ) 2 分别为 2 种药物单用时产生某一效应值 fa 时的浓度,(D ) 1 和 (D ) 2 则是 2 种药物联用时产生相同效应 fa 时各自所需要的浓度当 2 种药物的相互作用为非排斥性时, a = 1; 当 2 种药物的相互作用为排斥性时,a = 0 求出 CI 值, 如果 CI < 1, 认为两药物联用为协同作用 ; 如果 CI = 1, 认为两药联用为相加作用 ; 如果 CI > 1, 则认为两药联用为拮抗作用 1.5 FCM 法检测细胞凋亡取处于对数生长期的 PC9/G 细胞, 分别加入吉非替尼单药 (5.00 μmol/l) AG1024 单药 (10.00 μmol/l) 以及联合加入吉非替尼 (5.00 μmol/l) 和 AG1024(10.00 μmol/l),24 h 后用胰酶消化并收集细胞, 用冷 PBS 洗涤 2 次, 加入结合缓冲液重悬细胞, 制成细胞悬液, 调整细胞密度为个 /ml 吸取 100 μl 细胞悬液, 加入 Annexin Ⅴ -FITC 5 μl 和碘化丙锭 (propidium iodide,pi)5 μl, 混匀后避光并室温下孵育 15 min, 加入结合缓冲液 400 μl, 立即上流式细胞仪分析以未染色细胞调零, 以 Annexin Ⅴ -FITC 单染管和 PI 单染管作为基准对照, 测定每个上样管数据, 测定凋亡细胞百分比实验重复 3 次 1.6 Western 印迹法检测 p-egfr p-akt 和 p-erk 蛋白表达水平取处于对数生长期的 PC9/G 细胞, 分别加入吉非替尼单药 (5.00 μmol/l) AG1024 单药 (10.00 μmol/l) 以及联合加入吉非替尼 (5.00 μmol/l) 和 AG1024(10.00 μmol/l), 24 h 后收集各组细胞, 提取细胞总蛋白然后, 用 Western 印迹法分别检测 p-egfr p-akt 和 p-erk 的表达 : 细胞总蛋白经 8%SDS-PAGE 电泳分离后, 转移至聚偏二氟乙烯 (polyvinylidene difluoride,pvdf) 膜上, 用含 0.5% 脱脂奶粉的 TBST 溶液封闭 1 h, 加入相应的抗体 ( ),4 孵育过夜,TBST 漂洗 3 次后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗 ( ), 室温摇床孵育 1 h,tbst 漂洗 3 次后 DAB 显色, 曝光, 显影实验重复 3 次 1.7 统计学方法应用 SPSS 13.0 统计学软件对结果数据进行统计学处理计量资料用 x ±s 表示, 两组间比较采用 t 检验和方差分析以 P < 0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 AG1024 和吉非替尼单独用药对 PC9/G 细胞的增殖抑制作用 MTT 检测结果显示, AG1024 和吉非替尼分别以不同浓度单独作用于 PC9 和 PC9/G 细胞时, 均产生对细胞增殖的抑制作用, 且呈浓度依赖性 ( 表 1) 吉非替尼作用于 PC9/G 细胞 72 h 的 IC 50 值为 (8.34±1.11) μmol/l, 而 PC9 细胞的 IC 50 值为 (0.08±0.56) μmol/l;pc9/g 细胞的 IC 50 值约为 PC9 细胞 IC 50 值的 100 倍, 耐药指数为 94.77, 表明 PC9/ G 细胞对吉非替尼耐药 AG1024 作用于 PC9/G 细胞 72 h 的 IC 50 值为 (23.56±1.56)μmol/L, 而 PC9 细胞的 IC 50 值为 (14.62±0.88)μmol/L; PC9/G 细胞的 IC 50 值约为 PC9 细胞 IC 50 值的 1.6 倍, 耐药指数为 1.61, 表明 PC9/G 细胞对 AG1024 也有一定的多药耐药性表 1 不同浓度的吉非替尼和 AG1024 单独或联合作用亲代 PC9 和耐药 PC9/G 细胞 72 h 后的细胞生长抑制率 Table 1 Growth inhibitory rates of PC9 and PC9/G cell lines treated with gefitinib or AG1024 at different concentrations, alone or in combination ( x ±s, n = 3) Drug c /(μmol L - 1 ) Gefitinib PC9 Inhibitory rate/% PC9/G ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.12 AG ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±3.00 Gefitinib + AG ± ±2.73 * ± ±2.89 * ± ±1.95 * ± ±2.11 * ± ±3.42 * ± ±0.19 PC9/G cell line is a human non-small cell lung cancer cell line which acquired the resistance to gefitinib after PC9 cells were cultured with gefitinib. * P < 0.05, compared with gefitinib or AG1024 alone treatment group at the same concentrations 2.2 AG1024 和吉非替尼联合作用对 PC9/G 细胞增殖的影响 AG1024 选择小于 IC 50 值的浓度

4 范理宏, 等. IGF-1R 抑制剂联用可增强人非小细胞肺癌 PC9/G 细胞对吉非替尼的敏感性 225 ( 即 10 μmol/l) 进行后续实验, 其联合不同浓度的吉非替尼 ( 和 μmol/l) 作用 PC9/G 细胞后, 呈现出较单药更为显著的细胞增殖抑制作用, 差异有统计学意义 (P < 0.05, 表 1) 与单用吉非替尼处理组相比, 联合 AG1024 处理后, 耐药细胞株 PC9/G 与亲代细胞株 PC9 的 IC 50 值均有下降, 其 IC 50 值分别为 (1.18±0.14)μmol/L 和 (0.04±0.01) μmol/l; 耐药 RF 分别为 7.09 和 2.20, 耐药细胞株明显高于亲代细胞株, 差异有统计学意义 (P < 0.05) 根据中效方程式, 计算出 AG1024 吉非替尼单用以及联合作用时的斜率 m 分别为和 0.272, 中效浓度 D m 分别为和 μmol/l( 其中, 联用时吉非替尼的中效浓度为 μmol/l,ag1024 的中效浓度为 μmol/l), 相关系数 r 分别为和根据药物联用指数计算公式, 计算出不同浓度的吉非替尼和 10 μmol/l AG1024 联用产生不同效应时的 CI 值 ( 表 2), 进而判断两药在效应 ( 即细胞增殖抑制率 fa ) 范围内的相互作用是协同相加还是拮抗结果显示, 不同浓度的吉非替尼和 AG1024(10 μmol/l) 联用后 fa 为 (35.71 ~ 81.87)%, CI 值均 < 1, 因此说明在此范围内两药对 PC9/G 细胞的增殖抑制呈现协同作用表 2 不同浓度的吉非替尼和 10 μmol/l AG1024 联合作用 PC9/G 细胞时的联用指数 Table 2 Combination index (CI) values of gefitinib combined with AG1024 in PC9/G cells Gefitinib + AG1024 c /(μmol L - 1 ) f a /% CI AG1024 吉非替尼单独作用和联合作用对 PC9/G 细胞凋亡的影响 FCM 法检测结果显示, 吉非替尼或 AG1024 分别用低于 IC 50 值的药物浓度 ( 即分别为 5 和 10 μmol/l) 单独作用 PC9/G 细胞 24 h 后, 细胞凋亡率分别为 (4.63±1.18)% 和 (3.57±1.65)%; 按 1 2 的比例用吉非替尼 (5 μmol/l) 和 AG1024(10 μmol/l) 联合作用 24 h 后,PC9/G 细胞的凋亡率分别为 (8.17± 1.01)%( 图 1) 联合用药组的细胞凋亡率高于单独用药组, 差异有统计学意义 (P < 0.05); 且随着两者的浓度增加, 细胞凋亡率亦呈增高趋势由此可见, 对于耐药细胞株 PC9/G, 吉非替尼联合 AG1024 作用可增强吉非替尼抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用 A: Untreatment group as the control; B: AG1024 (10 μmol/l, 24 h) treatment group; C: Gefitinib (5 μmol/l, 24 h) treatment group; D: Gefitinib (5 μmol/l) combined with AG1024 (10 μmol/l, 24 h) treatment group 图 1 吉非替尼和 AG1024 单用及两者联合作用 24 h 对 PC9/G 细胞凋亡的影响 Fig. 1 Apoptosis of PC9/G cells treated with gefitinib or AG1024 alone or in combination detected by flow cytometry 2.4 AG1024 吉非替尼单独作用和联合作用对 PC9/G 细胞中 EGFR 下游 p-akt 和 p-erk 蛋白表达的影响 Western 印迹法检测结果显示, 药物未处理前的 PC9/G 细胞表达 p-egfr p-akt 和 p-erk 蛋白, 而 AG1024 和吉非替尼单独用药组的 PC9/G 细胞中 p-egfr p-akt 和 p-erk 蛋白表达水平均明显下降, 当 AG1024 和吉非替尼联合作用时 PC9/G 细胞中 p-egfr p-akt 和 p-erk 蛋白均不表达 ( 图 2) 以上结果提示 AG1024 吉非替尼单独作用或联合作用后,EGFR 及其下游通路蛋白的表达均受到明显抑制

5 226 范理宏, 等. IGF-1R 抑制剂联用可增强人非小细胞肺癌 PC9/G 细胞对吉非替尼的敏感性 p-egfr: Phosphorylated epidermal growth factor receptor; p-akt: Phosphorylated Akt; p-erk: Phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 图 2 Western 印迹法检测吉非替尼 (5 μmol/l) 和 AG1024 (10 μmol/l) 单用及两者联合作用 24 h 后 PC9/G 细胞中 p-egfr p-akt 和 p-erk 蛋白的表达变化 Fig.2 The expressions of p-egfr,p-akt and p-erk in PC9/G cells treated with gefitinib (5 μmol/l) and AG1024 (10 μmol/l) alone or in combination detected by Western blotting 3 讨论目前, 由于肺癌的治疗效果并不令人满意, 因此人们对肺癌治疗的关注较多, 特别是 IGF- 1R 信号通路和现有的 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂之间有无关联以及能否克服抗 EGFR 治疗引起的获得性耐药等更是备受关注的焦点 [2] EGFR 属于 Ⅰ 型生长因子家族, 具有酪氨酸激酶活性, 是 erbb 家族成员之一 EGFR 与配体结合后形成同源或异源二聚体, 引起构象变化, 激活细胞内酪氨酸激酶, 发生分子内磷酸化, 最终通过多个细胞内信号通路, 如促分裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) PI3K/Akt 及 Janus 激酶 / 信号转导与转录激活子 (Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,jak/stat) 信号通路, 调节肿瘤发生与转移的多个环节, 包括肿瘤细胞浸润血管生成细胞增殖和凋亡抵抗等吉非替尼属于小分子的 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂, 其通过竞争性地与 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂的催化区域中 Mg-ATP 位点结合, 抑制酪氨酸激酶磷酸化, 阻断 EGFR 的信号转导通路 [3], 从而抑制细胞周期进程, 加速细胞凋亡, 抑制血管生成, 最终抑制肿瘤浸润和转移吉非替尼与 ATP 位点的结合是非共价键结合的, 因此其属于可逆性的酪氨酸激酶抑制剂然而临床研究发现,EGFR 酪氨酸激酶抑制剂仅对部分 NSCLC 患者有效, 而且初始治疗有效的患者最终常会复发, 提示其存在原发性和获得性耐药目前研究显示, 外显子 T790M 突变和 Met [4, 基因扩增是获得性耐药的主要机制 5], 但是除此之外的其他耐药机制尚未被完全阐明人 NSCLC 细胞株 PC9 具有外显子 19E746 ~ A750 缺失突变, 因此对吉非替尼高度敏感 (IC 50 为 0.03 ~ 0.05 μmol/l) 本研究所采用的 PC9/G 细胞是从 PC9 细胞诱导突变获得的对吉非替尼耐药的细胞株 [6], 因此可以在一定程度上模拟吉非替尼继发性耐药的分子作用过程细胞内存在许多转导增殖刺激的酪氨酸激酶受体, 包括 EGFR IGF-1R 血管内皮生长因子受体 (vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR) 血小板衍生生长因子受体(platelet- derived growth factor receptor,pdgfr) 以及肝细胞生长因子受体 (hepatocyte growth factor receptor,hgfr) c-met 其中,IGF-1R 是一种跨膜的酪氨酸蛋白受体, 对细胞的分裂分化和增殖具有重要的调控作用 IGF-1R 与其配体结合, 通过启动 2 条信号转导途径 Ras/Raf/ MEK/ERK 和 PI3K/AKT, 促进有丝分裂及细胞生长 IGF-1R 信号转导通路通过多种机制介导, 调控肿瘤的发生转移血管生成和抗凋亡等, 并涉及到肿瘤的化疗放疗以及针对人表皮生长因子受体 2(human epidermal growth factor receptor 2,HER-2) 和 EGFR 的靶向治疗等方面 [7] IGF-1R 信号通路与其他生长因子的结合有利于启动肿瘤的发生与发展, 通过 IGF-1R 激活其下游的 PI3K-Akt 信号通路, 从而在肿瘤细胞内传递生存信号, 这可能是 IGF 轴与抗肿瘤治疗的原发或获得性耐药产生关联的原因在与 EGFR 信号通路的相互作用方面,IGF-1R 活化既可以引起 EGFR 通路的反式激活 ( 同时也需要 EGFR 酪氨酸激酶的活性以激活下游的 ERK 通路 ), 也可以直接方式即 EGFR 与 IGF-1R 形成二聚物而引起 ERK 的蓄积近年来研究发现,IGF-1R 通路与吉非替尼获得性耐药有关 [8] 本研究以人 NSCLC 细胞株为研究对象, 观察 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼和 IGF-1R 小分子酪氨酸酶抑制剂 AG1024 分别或联合处理耐药的 PC9/G 细胞后, 对细胞增殖和凋亡的影响以及对信号通路蛋白表达的抑制作用与单药作用组相比, 吉非替尼和 AG1024 联合作用于细胞后, 能使其抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用明显增强, 且能有效地抑制 Akt

6 范理宏, 等. IGF-1R 抑制剂联用可增强人非小细胞肺癌 PC9/G 细胞对吉非替尼的敏感性 227 激活由此说明,IGF-1R 能增强耐药细胞对吉非替尼的敏感性, 这一结果与以往的研究结论 [9] 相类似 Morgillo 等研究发现, 厄洛替尼诱导细胞膜表面形成 EGFR/IGF-1R 异源二聚体, 通过 IGF-1R 及其下游通路 PI3K/Akt 和 p44/ 42 MAPK, 传递生存信号并调节 EGFR 和抗凋亡蛋白 survivin 的合成, 抑制 IGF-1R 能使 EGFR 过表达的 NSCLC 细胞对厄洛替尼的敏感性增加因此,IGF-1R 表达或许能成为预测 NSCLC 患者对吉非替尼治疗有效的标志, 抑制 IGF-1R 信号通路可能阻止或延迟吉非替尼耐药的产生 [10] [11] Kokubo 等研究发现, 对 EGFR 抑制剂耐药的亚组人群的 p-akt 表达量增加 ( 不被 EGFR 抑制剂所抑制 ),10 号染色体上缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物 (phosphatase and tensinhomology deleted on chromosome ten, [12] PTEN) 蛋白表达量减少 Sos 等研究结果显示,PTEN 缺失导致 NSCLC 细胞 H1650 对厄洛替尼耐药, 然而 Akt 的持续活化在 EGFR 突变的 NSCLC 细胞中可能发挥更为重要的作用这些结果提示, 在耐药细胞中重建 PTEN 功能或抑制 PI3K/Akt 激活或许可以逆转耐药本研究结果即显示,IGF-1R 酪氨酸激酶抑制剂和 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂联用能有效抑制 Akt 的激活 [13] Chakravarti 等研究发现, 对于敏感的人多形性恶性胶质瘤 (glioblatoma multiforme,gbm) 细胞株,EGFR 抑制剂 AG1478 能诱导其凋亡, 降低其侵袭能力 ; 而耐药的 GBM 细胞株则表现出 IGF-1R 表达水平提高和 PI3K/Akt 信号通路持续活化 ; 联合 IGF-1R 抑制剂 AG1024 和 EGFR 抑制剂 AG1478, 则能显著地增加 GBM 耐药细胞的凋亡, 并降低其侵袭力迄今为止, 尚无一种理论能够完整地解释 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂的耐药机制, 因此有关 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂产生耐药性的研究仍是肿瘤研究领域的一个热点想要克服 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂的原发或继发性耐药, 除了不断开发新一代酪氨酸激酶抑制剂以及选择对靶向治疗药物敏感的患者外, 与其他药物联用以克服其耐药性, 从而多途径多层次地抑制肿瘤细胞生长将是今后研究的一个重要方向 [ 参考文献 ] [1] CHOU T C. Preclinical versus clinical drug combination studies[j]. Leuk Lymphoma, 2008, 49(11): [2] HEWISH M, CHAU I, CUNNINGHAM D. Insulin-like growth factor 1 receptor targeted therapeutics: n o v e l c o m p o u n d s a n d n o v e l t r e a t m e n t strategies for cancer medicine[j]. Recent Pat Anticancer Drug Discov, 2009, 4(1): [3] ARTEAGA C L. ErbB-targeted therapeutic approaches in human cancer[j]. Exp Cell Res, 2003, 284(1): [4] ENGELMAN J A, ZEJNULLAHU K, MITSUDOMI T, et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 s i g n a l i n g [ J ]. S c i e n c e, , ( ) : [5] BEAN J, BRENNAN C, SHIH J Y, et al. MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib[j]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(52) : [6] 粟波, 苏春霞, 张海平, 等. 吉非替尼耐药细胞株的筛选和基因谱表达研究 [J]. 肿瘤, 2008, 28(7): [7] YEE D. Targeting insulin-like growth factor pathways[j]. Br J Cancer, 2006, 94(4): [8] JONES H E, GODDARD L, GEE J M, et al. Insulinlike growth factor- Ⅰ receptor signalling and acquired resistance to gefitinib (ZD1839; Iressa) in human breast and prostate cancer cells[j]. Endocr Relat Cancer, 2004, 11(4): [9] M O R G I L L O F, W O O J K, K I M E S, e t a l. Heterodimerization of insulin-like growth factor receptor/epidermal growth factor receptor and induction of survivin expression counteract the antitumor action of erlotinib[j]. Cancer Res, 2006, 66 (20): [10] MORGILLO F, KIM W Y, KIM E S, et al. Implication of the insulin-like growth factor-ir pathway in the resistance of non-small cell lung cancer cells to treatment with gefitinib[j]. Clin Cancer Res, 2007, 13(9): [11] KOKUBO Y, GEMMA A, NORO R, et al. Reduction of PTEN protein and loss of epidermal growth factor receptor gene mutation in lung cancer with natural resistance to gefitinib (IRESSA)[J]. Br J Cancer, 2005, 92(9): [12] SOS M L, KOKER M, WEIR B A, et al. PTEN loss contributes to erlotinib resistance in EGFRmutant lung cancer by activation of Akt and EGFR[J]. Cancer Res, 2009, 69(8): [13] C H A K R A V A R T I A, L O E F F L E R J S, D Y S O N N J.Insulin-like growth factor receptor Ⅰ mediates resistance to anti-epidermal growth factor receptor therapy in primary human glioblastoma cells through continued activation of phosphoinositide 3-kinase signaling[j]. Cancer Res, 2002, 62(1): [ 收稿日期 ] [ 本文编辑 ] 张俊彦

168 任峰, 等. 培美曲塞联合奥沙利铂对人胃癌 BGC-823 细胞生长的影响培美曲塞是一种结构上含有核心为吡咯嘧啶基团的抗叶酸制剂, 通过破坏细胞内叶酸依赖性的正常代谢

168 任峰, 等. 培美曲塞联合奥沙利铂对人胃癌 BGC-823 细胞生长的影响培美曲塞是一种结构上含有核心为吡咯嘧啶基团的抗叶酸制剂, 通过破坏细胞内叶酸依赖性的正常代谢肿瘤 211 年 12 月第 31 卷第 12 期 TUMOR Vol. 31, December 211 www.tumorsci.org 167 基础研究 Basic Research DOI: 1.3781/j.issn.1-7431.211.12. 3 Copyright 211 by TUMOR 培美曲塞联合奥沙利铂对人胃癌 BGC-823 细胞生