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1 HPLC 在抗生素领域的应用 Leo Zeng 广州太玮生物科技有限公司市场 技术部 / (2014 年 12 月 )

2 抗生素的定义和分类 定义 : 抗生素是指在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称 抗生素是细菌 放线菌和真菌等微生物的代谢产物, 对各种病原微生物有强大的抑制或杀灭作用 使用 HPLC 方法检测抗生素种类 β 内酰胺类 ( 青霉素类和头孢菌素类 ) 四环素类 大环内酯类 氨基糖苷类和其他抗生素类

3 抗生素类药物结构特点 同一类型抗生素药物结构类似,HPLC 分析时具有更高的系统适用性要求 ; 抗生素类药物稳定较差, 易降解, 降解产品通常具有严重副作用,HPLC 分析时对色谱柱的分离性能要求更高 ; 抗生素类药物经常带有碱性基团, 易导致峰形拖尾 ; 许多抗生素类药物极性较大, 流动相经常添加离子对试剂, 导致色谱柱寿命变短 ; 大环内酯类和氨基糖苷类抗生素无紫外吸收, 检测时使用末端吸收波长或 ELSD 检测器, 限制了流动相选择的灵活性 ; 四环素类药物结构易与高价金属离子络合, 即便流动相已加入 EDTA, 仍然建议避免使用 A 类硅胶色谱柱

4 HPLC 分析 β- 内酰胺类抗生素 色谱讲堂 ( 三十四 ) 母核没有紫外吸收, 由侧链发色基团选择检测波长 ; 母核带酸性基团, 侧链常带碱性基团 ; 酸性条件和高水环境药物不稳定 ; 易聚合 侧链 母核 :6- 氨基青霉烷酸 (6-APA) 侧链 母核 :7- 氨基头孢菌烷酸 (7-ACA) 母核具有共轭结构 ; 母核带酸性基团, 侧链常带碱性基团 ; 酸性条件和高水环境药物不稳定 ; 易聚合

5 案例 : 氨苄西林 方法依据 :CHP2010 二部 P 色谱柱 :JADE-PAK TM ODS-AQ 5um mm( 货号 : ) 流动相 : A:B=(85:15) 流动相 A:12% 醋酸溶液 -0.2mol/l 磷酸二氢钾溶液 - 乙腈 - 水 (0.5:50:50:900) 流动相 B:12% 醋酸溶液 -0.2mol/l 磷酸二氢钾溶液 - 乙腈 - 水 (0.5:50:400:550) 流速 :1.0ml/min 波长 :254nm 柱温 : 室温进样量 :20ul 样品制备 : 按中国药典方法系统适应性试验图谱 系统适用性试验原理 : 氨苄西林与头孢拉定侧链相同, 母核不同, 要求色谱柱具有很好分离性能! R=12.75 药典要求 R>3.0

6 与标准图谱比较 图谱来源 : 2010 年版 < 中国药典 > 化学药品标准物质分析方法及应用图谱 ( 人民卫生出版社 )P56

7 阿莫西林有关物质检查 色谱讲堂 ( 三十四 ) 方法依据 : 中国药典二部色谱柱 :JADE-PAK TM ODS-AQ 5um mm( 货号 : ) 流动相 : 0.05M 磷酸二氢钾溶液, 用 2mol/l 氢氧化钾溶液调 ph5.0- 乙腈 99:1 % 洗脱时间 (time) 流速 :1.0ml/min 波长 :254nm 柱温 : 室温进样量 :20ul 样品制备 : 按中国药典方法 0.05M 磷酸二氢钾溶液, 用 2mol/l 氢氧化钾溶液调 ph5.0- 乙腈 80:20 % 供试品图谱

8 头孢拉定 头孢拉定含量测定方法依据 :2010 版中国药典二部 P 色谱柱 :JADE-PAK TM ODS 5um mm( 货号 : ) 流动相 : 水 - 甲醇 -3.86% 醋酸钠溶液 -4% 醋酸溶液 (1564:400:30:6) 流速 :1.0ml/min 波长 :254nm 柱温 : 室温进样量 :10ul 样品制备 : 按中国药典方法 供试品图谱 分子结构仅差一个双键

9 头孢拉定 色谱讲堂 ( 三十四 ) 头孢拉定有关物质检查方法依据 : 中国药典二部 P 色谱柱 :JADE-PAK TM ODS 5um mm( 货号 : ) 色谱条件 : 同含量测定系统适应性试验图谱 R=2.27

10 与标准图谱比较 色谱讲堂 ( 三十四 ) 图谱来源 : 2010 年版 < 中国药典 > 化学药品标准物质分析方法及应用图谱 ( 人民卫生出版社 )P1050

11 注射用头孢唑啉钠含量测定 色谱讲堂 ( 三十四 ) 法依据 :2010 版中国药典二部 P207 色谱柱 :JADE-PAK TM ODS 5um mm( 货号 : ) 流动相 : A:B(88:12) 流动相 A( 取无水磷酸氢二钠 1.33g 和枸橼酸 1.12g, 加水稀释至 1000ml) 流动相 B 乙腈流速 :1.6ml/min 波长 :254nm 柱温 : 室温进样量 :10ul 样品制备 : 按中国药典方法 系统适应性试验图谱 ( 碱性降解 ) 要求保留时间约为 7.5min 设定流速 :1.6ml/min 供试品图谱

12 讨论 : β 内酰胺类 ( 青霉素类和头孢菌素类 ) 1 大多数 β 内酰胺类抗生素为半合成药物, 母核基本相同, 根据不同的药用目的引入不同的侧链单元, 但整体结构还是非常接近, 因此, 为了确保方法的专属性, 常常使用结构接近的同类药物做系统适用性试验 2 由于 β 内酰胺类药物稳定性较差, 易降解, 为了确保方法可以完全分离降解杂质, 且降解杂质本身难以提供对照品, 经常使用加速降解目标物进行系统适用性试验 ; 有明确杂质对照品的品种, 需要做更严格的系统适用性试验 3 β 内酰胺类药物通常极性较大, 常见酸碱两性, 流动相往往使用高盐 高水流动相, 导致色谱柱寿命变短 我们推荐使用高水条件更稳定的 JADE-PAK ODS-AQ 色谱柱, 对大多数 β 内酰胺类药物均能取得良好的实验效果 β 内酰胺类抗生素聚合物检查专用色谱柱推荐 : JADE-PAK Sephadex G mm (40 120um) P/N

13 HPLC 分析四环素类抗生素 基本结构 提示 : 1 同类抗生素不同药物结构差异小, 为提高分离, 应选用碳载量更高的 C18 色谱柱 2 结构易与高价金属离子络合, 尽可能选用金属残留量低 C18 色谱柱

14 盐酸多西环素 方法依据 : 中国药典二部色谱柱 :JADE-PAK TM C18 II 5um mm( 货号 : ) 流动相 : A:B(85:15) A 醋酸盐缓冲液 (0.25mol/l 醋酸铵 -0.1mol/l 乙二胺四醋酸二钠 - 三乙胺 100:10:1) B 乙腈流速 :1.0ml/min 波长 :280nm 柱温 :35 进样量 :20ul 系统适应性试验图谱 USP Tf=1.03 USP Tf=1.00 USP Tf=1.07 USP Tf=1.04 R=6.48 药典要求 R>4.0

15 盐酸美他环素相关物质检查 方法依据 : 中国药典二部色谱柱 :JADE-PAK TM ODS 5um mm( 货号 : ) 流动相 : A:B(85:15) A: 醋酸盐缓冲液 (0.25mol/l 醋酸铵 -0.1mol/l 乙二胺四醋酸二钠 - 三乙胺 100:10:1) B: 乙腈流速 :1.0ml/min 波长 :280nm 柱温 :35 进样量 :20ul R=13.0 系统适应性试验 ( 要求 R>6.0) 供试品图谱

16 与标准图谱比较 图谱来源 : 2010 年版 < 中国药典 > 化学药品标准物质分析方法及应用图谱 ( 人民卫生出版社 )P1371

17 讨论 : HPLC 分析四环素类抗生素 1 四环素类药物对高价金属离子极其敏感, 由于硅胶基质色谱柱不可避免存在高价金属离子残留, 欧洲药典和英国药典等国外法定方法使用聚苯乙烯 - 二乙烯基苯聚合物为固定相的色谱柱, 但这类色谱柱批间稳定性差, 柱效低, 问题频现 ; 2 中国药典使用十八烷基硅胶键合相色谱柱, 并在流动相中添加 EDTA 屏蔽固定相残留金属离子对四环素类药物的影响, 同时获得更高的柱效和分离度, 是一个非常精妙的设计! 3 但我们依然建议避免使用 A 类硅胶 C18 我们推荐 JADE-PAK C18 II 色谱柱, 分析四环素类药物可以获得非常理想的效果 了解目前市面上哪些常用 C18 属于 A 类硅胶, 直接联系 :marketing@techway-gz.com

18 HPLC 分析大环内酯类抗生素 大环 大环 强碱 强碱 内酯结构

19 红霉素肠溶片中红霉素 A 方法依据 : 中国药典二部 P300 色谱柱 :JADE-PAK TM ODS 5um mm( 货号 : ) 流动相 : 磷酸盐溶液 ( 取磷酸氢二钾 8.7g, 加水 1000ml, 用磷酸调节 ph 值至 8.2)- 乙腈 (40 :60) 流速 :1.0ml/min 波长 :215nm 柱温 :35 进样量 :20ul 药典要求 : 红霉素 A 拖尾因子 <2.0, 红霉素 A 与红霉素烯醇醚 R>14.0 Tf=0.94 Tf=0.97 Tf=1.0 系统适应性试验图谱

20 与标准图谱比较 图谱来源 : 2010 年版 < 中国药典 > 化学药品标准物质分析方法及应用图谱 ( 人民卫生出版社 )P421

21 注射用阿奇霉素有关物质检查 方法依据 : 注射用阿奇霉素 2013 年 7 月 1 日公示标准色谱柱 :JADE-PAK TM C18(II) 5um mm( 货号 : ) 流动相 A: 磷酸盐缓冲液 ( 取 0.05mol/L 磷酸氢二钾溶液, 用 20% 的磷酸溶液调节 ph 值至 8.2)- 乙腈 (45:55) 流动相 B: 甲醇梯度程序 : 时间 (min) 流动相 A (%) 流动相 B (%) 流速 :1.0ml/min 波长 :210nm 柱温 : 40 进样量 :50ul 样品制备 : 按标准方法

22 注射用阿奇霉素有关物质检查 要求 : 阿奇霉素峰的保留时间应在 30 分钟 ~40 分钟之间 供试品图谱

23 克拉霉素有关物质检查 色谱讲堂 ( 三十四 ) 方法依据 : 中国药典二部色谱柱 :JADE-PAK TM ODS 5um mm( 货号 : ) 流动相 : A:B(60:40) A 磷酸盐缓冲液 ( 取磷酸二氢钾 9.11g, 加水溶解并稀释至 1000ml, 加三乙胺 2ml, 用磷酸调节 ph=5.5) B 乙腈流速 :1.0ml/min 波长 :210nm 柱温 :45 进样量 :20ul 供试品图谱

24 与标准图谱比较 图谱来源 : 2010 年版 < 中国药典 > 化学药品标准物质分析方法及应用图谱 ( 人民卫生出版社 )P544

25 讨论 : HPLC 分析大环内酯类抗生素 1 大环内酯类抗生素通常带有强碱性基团, 易引起峰拖尾 中国药典多个此类抗生素拖尾因子规定放宽至 由于生产工艺的原因, 大环内酯类抗生素往往含有多种活性不同的成分, 对色谱柱分离要求更高 有关物质检查项更是此类药物分析的难点 3 大环内酯类抗生素没有紫外吸收, 需要用到末端波长检测, 限制流动相设计的灵活度 4 流动相偏碱性居多, 导致色谱柱寿命变短!

26 HPLC 分析氨基糖苷类和其他类型抗生素 氨基糖苷类抗生素的 HPLC 分析, 参见 色谱讲堂 32: 色谱技术在氨基糖苷类药物检测的应用

27 盐酸林可霉素含量测定 方法依据 : 中国药典二部色谱柱 :JADE-PAK TM ODS-AQ 5um mm( 货号 : ) 流动相 : 0.05M 硼砂溶液 ( 用 85% 磷酸调 ph=6.1)- 甲醇 (1:1) 流速 :1.0ml/min 波长 :214nm 柱温 : 室温进样量 :10ul 样品制备 : 按中国药典方法 药典要求 : 保留时间 :0.4~0.7 分离度 >2.6 相对保留时间 :0.53

28 与标准图谱比较 图谱来源 : 2010 年版 < 中国药典 > 化学药品标准物质分析方法及应用图谱 ( 人民卫生出版社 )P1347

29 盐酸克林霉素胶囊含量测定 方法依据 : 中国药典二部 P707 色谱柱 :JADE-PAK TM ODS 5um mm( 货号 : ) 流动相 : 磷酸二氢钾溶液 (6.8mg/ml, 用 25% 氢氧化钾调节 ph7.5)- 乙腈 (55:45) 流速 :1.0ml/min 波长 :210nm 柱温 : 室温进样量 :20ul 样品制备 : 按中国药典方法 药典要求 : 保留时间 :0.65 和 0.80 分离度 >3.0 相对保留时间 :0.80 相对保留时间 :0.64 R=7.3 R=7.5

30 盐酸克林霉素胶囊含量测定 方法依据 : 中国药典二部 P707 色谱柱 :JADE-PAK TM ODS 5um mm( 货号 : ) 流动相 : 磷酸二氢钾溶液 (6.8mg/ml, 用 25% 氢氧化钾调节 ph7.5)- 乙腈 (55:45) 流速 :1.0ml/min 波长 :210nm 柱温 : 室温进样量 :20ul 样品制备 : 按中国药典方法

31 与标准图谱比较 图谱来源 : 2010 年版 < 中国药典 > 化学药品标准物质分析方法及应用图谱 ( 人民卫生出版社 )P1341

32 结语 1 抗生素类药物的 HPLC 分析一直以来都是行业的难点 一方面由于抗生素类药物的用药特点, 决定了必须要有更高的检验标准保证药品质量, 确保用药安全 ; 另一方面, 建立的方法必须具有广泛的可操作性和重复性, 保证更多相关机构具有良好的监控能力 2 检测抗生素类药物的色谱柱, 需要兼顾峰形和分离度, 性能要求更高!JADE-PAK 系列色谱柱可以满足大多数抗生素类药物检测的要求, 效果不比官方标准图谱差 3 我们会持续关注抗生素领域 HPLC 分析的难点和热点问题, 并及时与我们的用户分享我们的心得, 请关注我们的动态 4 以上部分品种官方暂时没有标准图谱比照

33 色谱讲堂 公司简介 广州太玮生物科技有限公司是一家专注于为色谱实验室提供关键性消耗品的专业公司 我们的骨干员工均有行业主流公司关键岗位的工作经历, 对各知名品牌的产品都有更深入的了解, 可以更准确地为我们的客户推荐最合适的产品 代理品牌 ThermoFisher 色谱产品正式授权代理 Waters,Shimadzu,Merck,Agilent,Alltech,YMC, Sigma(Supelco) USP EP BP 中检院 DR.E Accustandard TRC Witega Chem Service NIST Chiron

34 色谱讲堂栏目色谱讲堂 公司简介 提供服务 : 免费技术咨询 免费分析方法开发 定期 色谱讲堂 上门的技术培训 ( 免费 收费 ) 上门的实操培训( 收费 ) 色谱技术交流群 : ( 色谱那些事 )

35 色谱讲堂 公司简介 提供的产品 : HPLC/UPLC 色谱柱 GC 色谱柱 薄层板等色谱耗材 ; SPE 前处理小柱 散装 SPE 填料 针头式过滤器和微孔滤膜等样品前处理耗品 ; 标准品和对照品 ; 样品瓶 顶空瓶 氘灯 进样针 密封垫 石墨卡套 衬管等色谱仪器配件 ; 移液器 电子天平 离心机等小型仪器设备 ; 培养基等

36 色谱讲堂 公司简介 签约合作物流 : 顺丰快递 最及时供货速度 : 广州市区和珠三角城区当天到达 ( 上午 10:00 前下单 ) 华南地区 华东地区 环渤海地区 省会城市 24 小时到达其他地区 48 小时到达

37 色谱讲堂 公司简介 自主品牌产品 : JADE-PAK 系列色谱柱 : 可能是您最称手的色谱柱美国公司制造, 通用性强, 性能卓越分离度和峰对称性的完美平衡 10 种固定相, 质谱 分析 制备等规格可供药物分析和食品分析大量代表性应用案例点击浏览 :JADE-PAK 色谱柱技术和应用资料 ( ) 促销火热进行中

38 色谱讲堂 公司简介 TECHWAY 系列针式过滤器和滤膜 现正促销中

39 色谱讲堂 广州太玮生物科技有限公司服务宗旨 : 专业 高效 诚信 责任 品质 价值 服务 急客户所需 一站式优质服务 技术信息反馈和咨询 :technical@techway-gz.com 销售咨询 :sales@techway-gz.com QQ:

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日 本 位 于 亚 洲 东 部, 太 平 洋 西 北 角, 是 我 国 东 方 的 一 个 岛 国 在 洪 积 世 ( 注 1) 的 大 部 分 时 期 内, 日 本 与 大 陆 相 连 大 约 在 洪 积 世 晚 期 至 冲 积 世 ( 注 2) 初 期, 日 本 各 地 发 生 海 进, 出 现 前 言 日 本 是 我 们 的 邻 国 文 献 可 考 的 两 国 关 系, 至 少 已 有 21 个 世 纪 古 代 日 本 文 化 的 发 展 晚 于 中 国, 而 日 本 民 族 却 能 在 固 有 文 化 的 基 础 上 对 外 国 文 化 采 取 选 择 吸 收 和 创 新 的 态 度, 形 成 自 己 独 特 的 文 化 封 建 末 期, 中 国 和 日 本 同 受 西 方 列 强 的

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