胰高血糖素样肽 -1 类似物对糖尿病模型大鼠胰岛功能 1 的影响 于婷, 赵海军, 刘娅吉林大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室, 长春 (130021) E-mail: Liuya@jlu.edu.cn 摘要 : 目的探讨胰高血糖素样肽 -1(GLP-1) 类似物对实验性糖尿病胰岛功能的影响. 方法 4 只 Wistar 大鼠, 采用高脂饮食和注射 40mg/kg STZ 方法建立实验性糖尿病动物模型 GLP-1 类似物治疗 14d 后, 采用酶化学方法检测空腹血糖 ; 采用放射免疫方法检测血清胰岛素和 C 肽 胰腺组织切片 HE 染色和链霉菌抗生物素 - 过氧化物酶 (SABC) 免疫组化染色方法对胰岛结构和胰岛素表达情况进行观察 结果 GLP-1 类似物中剂量组 (10μg/kg) 高剂量组 (100μg/kg) 与糖尿病模型组比较血糖明显降低 (P<0.01); 中剂量组 (10μg/kg ) 高剂量组 (100μg/kg) 的血清胰岛素和 C 肽水平明显高于糖尿病模型组 (P<0.05);GLP-1 类似物各剂量组对糖尿病大鼠的胰岛组织结构有显著的保护作用, 并且可以增加胰岛素表达阳性的 β 细胞 (P<0.01) 结论 GLP-1 类似物可以通过保护大鼠胰岛细胞免受 STZ 的伤害和增加胰岛 β 细胞数量来增加胰岛素的表达和分泌, 从而降低糖尿病动物血糖 关键词 : 胰高血糖素样肽 -1; 糖尿病 ; 胰岛素 ;C 肽 ; 免疫组织化学中图分类号 : R57.1;R332 文献标识码 :A 胰高血糖素样肽 -1 (GLP-1) 是第一个被描述的肠促胰岛素 (incretin), 是前胰高血糖素 (proglucagon) 衍生的多肽激素 由胃肠道系统释放, 促进葡萄糖依赖性的胰岛素从胰腺 β 细胞释放 GLP-1 还具有降低血浆中的胰高血糖素水平, 降低胃排空速率, 促进饱食感和刺激胰岛 β 细胞的增殖与分化等多种生理活性, 这些特性使 GLP-1 可能成为治疗 2 型糖尿病比较理想的药物 但是机体产生的活性 GLP-1 由于受到特异性酶的降解和肾脏排泄的影响, 在体内的半衰期非常短, 严重限制了 GLP-1 的应用 [1-2] 而对其结构进行改变或修饰获得的 GLP-1 类似物则可以大大提高其生物学活性和在体内的作用时间 因此,GLP-1 类似物成为糖尿病治疗药物研究的一个热点 本研究将探讨合成的新型 GLP-1 类似物对实验性糖尿病动物模型的血糖以及胰岛功能的影响 1. 材料与方法 1.1 动物及饲料 体重 10-200g 成年雄性 wistar 大鼠及基础饲料由吉林大学白求恩医学部基础医学院实验动物中心提供 高脂饲料组成的各成分的质量分数 : 基础饲料.%, 猪油 10%, 胆固醇 1%, 胆盐 0.2% 1.2 试剂 链脲佐菌素 (streptozotocin,stz) 购自 Sigma 公司,GLP-1 类似物和 Exendin-4 由杭州中肽生化有限公司合成,GLP-1 类似物生物半衰期为 1.5h 胆固醇 胆盐( 上海惠世生化试剂有限公司 ) 胰岛素 C 肽放免试剂盒 ( 北京市福瑞生物技术有限公司 ) 胰岛素抗体 SABC 及 DBA 显色试剂盒 ( 福州迈新生物技术开发有限公司 ) 1 高等学校博士点基金资助项目 (2005013034) - 1 -
1.3 主要仪器京都血糖仪及检测试纸条 ( 日本 ARKRAY 公司 ) 7171 全自动生化分析仪 ( 日本日立公司 ) GC-1200γ 放射免疫计数器 ( 科大创新股份有限公司 ) 1.4 糖尿病动物模型复制 分组及处理 4 只成年雄性 Wistar 大鼠 (10-200g) 在基础饲料条件下喂养适应 7d, 禁食 12h 后断尾取血 ( 1.5-2mL), 置于 4 条件下自然凝聚后离心,3000 r/min,5min, 取上清 -20 保存备检测各项血清生化学指标 根据体重将实验动物随机分为两个实验组, 即正常对照组 (normal control) 和高脂饮食组 (high fat diet) 正常组 12 只大鼠继续给予基础饲料喂养到实验结束, 高脂饮食组 72 只动物给予高脂饲料喂养 高脂饲料喂养 4 周后, 给予其中 0 只大鼠左下腹腔一次性注射 STZ 40mg/kg(STZ 4 保存 ; 用 0.1mol/L 的柠檬酸缓冲液在冰浴下配制成 2% STZ 溶液, 调至 ph4.4, 现配现用 ), 其余 12 只给予相应体积柠檬酸缓冲液 给药 1 周后检测各实验组的空腹血糖, 血糖 1.7mmol/L 诊断为糖尿病模型, 本实验成模率为 100% 将 0 只糖尿病动物随机分为低剂量组 (low dose) 中剂量组(medium dose) 高剂量组(high dose) 阳性对照组(positive control) 和糖尿病模型组 (diabetes mellitus); 低 中 高三个剂量组分别皮下注射 1μg/kg 10μg/kg 和 100μg/kg 的 GLP-1 类似物, 阳性对照组给予皮下注射 10μg/kg 的 Exendin-4, 正常对照组 高脂饮食组 糖尿病模型组皮下注射相当体积的 0.1M PBS 缓冲液 药物治疗共 2 周, 实验期间动物自由饮水 进食 于治疗的第 1 周末, 采取动物尾静脉检测各组动物的空腹血糖 治疗的第 2 周末, 采血 4-5mL, 检测血清生化学指标 然后将动物处死, 取胰腺放入 100mL/L 中性甲醛溶液固定, 以备病理组织学观察和免疫组织化学染色 实验过程中, 根据实验需要和动物状态, 正常对照组和高脂饮食组每组剔出 4 只大鼠, 糖尿病模型及各治疗组因死亡等原因共剔出 30 只大鼠 1.5 血生化指标检测血糖测定采用葡萄糖氧化酶法 ; 各组血清胰岛素和 C 肽采用放射免疫试剂盒检测 1. 胰岛 HE 染色和免疫组化染色取出中性甲醛溶液固定胰腺组织块石蜡包埋 苏木精和伊红染色后, 显微镜下观察并拍照 取胰腺组织石蜡切片行 insulin 链霉菌抗生物素 - 过氧化物酶 (SABC) 免疫组化染色 : 组织切片脱腊至水,30mL/L 的 H 2 O 2 室温 10min, 灭活内源性过氧化物酶, 热源修复抗原后, 滴加正常山羊血清封闭液, 室温 20min, 甩去多余的液体, 不能冲洗 滴加 1:5 insulin 抗体 ( 一抗 ),4 过夜孵育, 阴性对照片用 PBS 替代一抗, 按试剂盒操作说明进行免疫组化反应, 用二氨基联苯胺 ( DAB)- 3%H 2 O 2 系统显色 10 min 苏木素衬染 脱水透明后, 中性树胶封片, 显微镜下观察 染色阳性结果为棕黄色颗粒, 在显微镜下观察每张标本 10 个高倍镜不重复视野, 数 1 000 个细胞中的阳性细胞数, 计算阳性细胞百分率 1.7 统计学处理用 SPSS 11.0 统计软件进行分析 数据以 ( x ±s) 表示, 多组资料间比较, 采用方差分析 以 P <0.05 为有统计学意义 2. 结果 - 2 -
2.1 GLP-1 类似物对糖尿病动物血糖的影响 给予 GLP-1 类似物治疗 1 周, 高剂量组的血糖水平比糖尿病模型组显著降低 (P <0.01); 治疗 2 周, 高剂量组 中剂量组和 Exendin-4 组 (10μg/kg) 比糖尿病模型组血糖明显降低 (P <0.01) 整个治疗期间, 糖尿病模型组和各治疗组的血糖水平明显高于正常对照组和高脂饮食组 (P <0.01) 见表 1 group normal control high fat diet low dose medium dose high dose diabetes mellitus positive control 表 1 GLP-1 类似物对于大鼠血糖的影响 Table 1 Effects of GLP-1 analog on blood glucose level of rats( x ±s, mmol/l) time n Stz 0 week Stz 1 week GLP-1 1 week GLP-1 2 week 7 5 5.77±1.04 5.21±0. 7.33±0.5 7.19±0.4 7.40±0.5 5.0±0.90.74±1.79 4.73±0.5 4.4±0.5 25.9±5.9 * 2.34±.15 * 24.50±5.43 * 20.±7.31 * 22.00±5.7 * 4.14±0.55 3.70±0.27 23.40±4.44 * 22.0±3.75 * 17.00±3.7 * # 22.19±3.90 * 29.50 ±5.29 * * P<0.01 vs. normal control group and high fat diet group; # P<0.01 vs. diabetes mellitus group 2.2 GLP-1 类似物对糖尿病动物血清胰岛素和 C 肽水平的影响 5.34±0. 5.70±0.4 2.91±0.3 * 1.12±1.10 * # 17.72±0.7 * # 27.7±0.94 * 19.41±4.92 * # GLP-1 类似物治疗 2 周, 糖尿病模型组和各治疗组的血清胰岛素 C 肽水平明显低于正常对照组和高脂饮食组 (P<0.01) 其中, 中剂量组 高剂量组和 Exendin-4(10μg/kg) 组的胰岛素 C 肽水平明显高于糖尿病模型组 (P<0.05) 见表 2 group normal control high fat diet low dose medium dose high dose diabetes mellitus positive control 表 2 GLP-1 类似物对于大鼠血清胰岛素和 C 肽水平的影响 Table 2 Effects of GLP-1 analog on serum insulin and C-peptide level of rats( x ±s) n 7 5 insulin (μiu/ml) 41.70±1.5 44.11±11.21 14.9±3.5 * 21.74±5.7 * # 19.13±7.3 * # 13.7±1.1 * 21.4±4.73 * # C-peptide (ng/ml) 7.29±3.0 7.40±2.1 1.97±0.59 * 3.03±0.70 * # 2.93±0.2 * # 1.0±0.4 * 2.2±0.5 * # * P<0.01 vs. normal control group and high fat diet group;# P<0.05 vs. diabetes mellitus group 2.3 GLP-1 类似物对糖尿病动物胰岛病理组织学影响 正常对照组胰腺中的胰岛呈现淡浅的细胞团, 边界清楚, 形状规则, 胰岛内细胞排列整齐, 大小一致, 分布均匀 细胞核呈现紫蓝色, 大而圆, 核清晰 核仁明显, 胞浆丰富 而糖尿病模型组大鼠胰岛内分泌细胞结构紊乱, 形态不规则, 多数胞核变形 固缩 大小不等, 出现空泡样变形, 胰岛数量极少 GLP-1 类似物高剂量组 中剂量组和 Exendin-4 组的胰岛数量与糖尿病模型组相比较明显增加, 胰岛细胞的形态与正常对照组相接近 边缘较清楚, 细胞排列紊乱 图 1-3 -
图 1 胰腺中胰岛 HE 染色 Fig. 1 Islet in Pancreatic stained by Hematoxylin and eosin A:normal control group( 200);B:high fat diet group( 200); C:JC003 low dose group( 200);D:JC003 medium dose group( 200); E:JC003 high dose group( 200);F:diabetes mellitus model group( 200); G:positive control group( 200) 2.4 GLP-1 类似物对糖尿病动物胰岛素阳性表达细胞百分率的影响 免疫组化染色, 胰岛 β 细胞分泌的胰岛素与其特意性的抗体结合后呈现棕黄色颗粒 常对照组和高脂饮食组胰岛多呈圆形和椭圆形, 大小不一, 形态完整 β 细胞占据胰岛细胞的绝大部分 位于胰岛的中央, 棕黄色的分泌颗粒分布在胰岛 β 细胞的细胞质内, 含量丰富, 较致密, 着色深 糖尿病组胰岛结构遭到破坏, 边缘不整齐,β 细胞数量和细胞质内棕黄色颗粒均明显减少 GLP-1 类似物低剂量组 中剂量组 高剂量组及阳性对照组与糖尿病模型组比较胰岛素阳性表达的 β 细胞百分率有显著性差异 (p<0.01), 见表 3 和图 2 表 3 GLP-1 类似物对于大鼠胰岛素阳性细胞百分率的影响 Table 3 Effects of GLP-1 analog on insulin positive rate of rats( x ±s,%) group n insulin positive rate normal control high fat diet low dose medium dose high dose diabetes mellitus positive control 7 5 53.±2.3 49.±3.5 10.4±2.9 * # 25.1±3.1 * # 2.3±2. * # 3.1±1.5 * 24.7±3.2 * # * P<0.01 vs. normal control group and high fat forage group; # P<0.01 vs. diabetes mellitus group - 4 -
图 2 胰岛中胰岛素表达 Fig. 2 Insulin positive cell of Pancreatic Islet stained by immuno-histochemistry A:normal control group( 200);B:high fat diet group( 200); C:GLP-1low dose group( 200);D:GLP-1 medium dose group( 200); E:GLP-1 high dose group( 200);F:diabetes mellitus model group( 200); G:positive control group( 200) 3. 讨论 GLP-1 除了具有促进抑制食物在胃肠道内吸收 抑制胰高血糖素释放 增加外围组织葡萄糖利用率等经典作用外, 还可以通过刺激 β 细胞特异基因表达 降低食欲 [3] 促进胰腺干 [4] 细胞和导管细胞分泌胰岛素等多种途径来降低糖尿病血糖 在分离的 Langerhans 细胞 灌注的胰腺中动物和人体实验均证实 GLP-1 能刺激胰岛素分泌, 且这种促进作用是葡萄糖依赖性的 [5], 即血糖越高 GLP-1 的作用越强 本研究结果表明 :GLP-1 类似物治疗 1 周, 高剂量组血糖出现了显著降低 治疗 2 周后, 中剂量组 高剂量组和 Exendin-4 组血糖出现显著性降低 这提示短期使用 GLP-1 类似物可以达到控制糖尿病高血糖症状的目的 中剂量组 高剂量组和 Exendin-4 组血清胰岛素和 C 肽水平明显升高, 但是糖尿病模型组和各治疗组的血清胰岛素和 C 肽的水平与正常对照组和高脂饮食组相比较均明显降低 这说明 GLP-1 类似物可以提高糖尿病动物的血清胰岛素水平, 且作用与 Exendin-4 相当 HE 染色和免疫组化染色我们可以看到 GLP-1 类似物各剂量组可以对于胰岛机构有明显的保护作用并且增加表达胰岛素阳性 β 细胞百分比 综上所述, 我们认为新型的 GLP-1 类似物是通过保护糖尿病大鼠胰岛结构和增加胰岛 β 细胞来增加动物的胰岛素表达和分泌, 从而达到降低血糖的目的 - 5 -
参考文献 [1] Gautier JF, Fetita S, Sobngwi E, et al. Biological actions of the incretins GIP and GLP-1 and therapeutic perspectives in patients with type 2 diabetes [J]. Diabetes Metab, 2005, 31(3pt1): 233-242. [2] Kluz J, Adamiec R.. New therapeutic approach in patients with type 2 diabetes based on glucagon-like peptide 1 (GLP-1) and gastric inhibitory peptide (GIP)[J]. Postepy Hig Med Dosw, 200, 0: 15-23. [3] 刘青, 杨翰仪. 治疗 2 型糖尿病新药胰高血糖素样肽 -1 的研究进展 [J]. 白求恩医科大学学报,2001,27(1): 103-104. [4] 施秉银. 胰岛干细胞的研究现状与展望 [J]. 西安交通大学学报 ( 医学版 ),2005,2(5):409-412. [5] Schirra J,Katschinski M,Weidmann C,et al. Gastric emptying and release of incretin hormones after glucose ingestion in humans [J].J Clin Invest,199, 97:92-103. Effects of GLP-1 analog on blood glucose and pancreatic functions of diabetes mellitus rats Yu Ting, Zhao Haijun, Liu Ya Department of Nutrition and Food Hygiene,School of Public Health, Jinlin University,Changchun (130021) Abstract Objective To investigate the therapeutic effects of glucagon-like peptide-1(glp-1) analog on blood glucose and pancreatic functions of diabetes mellitus rats. Methods 4 Wistar rats were used in this experiment. Diabetes mellitus animal models were induced with high fat diet and injection of 40mg/kg STZ. After 14 d of GLP-1 analog therapy, The level of serum insulin and C-peptide were measured with immunoradiometric assay method.serial pancreatic sections were made and stained by hematoxylin-eosin(he)and streptavidin-biotin-peroxidase complex(sabc). Results After 14d of GLP-1 analog injection, the level of FPG of middle dose group(10μg/kg) and high dose group (100μg/kg) was lower than diabetes mellitus (DM)group(P<0.01); The level of serum insulin and C-peptide of medium dose group(10μg/kg) and high dose group(100μg/kg) were higher than DM group(p<0.05);glp-1 can protect pancreatic islet from injury of STZ and increase insulinexpressing positive rate(p<0.01). Conclusion GLP-1 analog can debase level of blood glucose of diabetes mellitus through protecting pancreatic islet β cells and increasing insulin expression and secretion. Keywords:glucagon-like peptide-1;diabetes mellitus;insulin;c-peptide;immunohistochemical - -