贺 兼 斌, 等. 果 王 素 对 提 高 吉 西 他 滨 联 合 顺 铂 治 疗 肺 腺 癌 小 鼠 移 植 瘤 敏 感 性 的 影 响 1121 control group and GP group (P < 0.01). The expression levels of P-gp and GR

1120 基 础 研 究 Basic Research www.tumorsci.org 肿 瘤 2014 年 12 月 第 34 卷 第 12 期 TUMOR Vol. 34, December 2014 DOI: 10.3781/j.issn.1000-7431.2014.11. 508 Copyright 2014 by TUMOR 果 王 素 对 提 高 吉 西 他 滨 联 合 顺 铂 治 疗 肺 腺 癌 小 鼠 移 植 瘤 敏 感 性 的 影 响 贺 兼 斌 1, 易 高 众 1, 陈 智 魁 1, 何 微 1, 邓 湘 2 2, 张 平 1. 湖 南 医 药 学 院 附 属 怀 化 市 第 一 人 民 医 院 呼 吸 内 科, 湖 南 怀 化 418000;2. 南 华 大 学 附 属 第 一 医 院 呼 吸 内 科, 湖 南 衡 阳 421001 [ 摘 要 ] 目 的 : 本 研 究 旨 在 观 察 果 王 素 对 提 高 吉 西 他 滨 (gemcitabine) 联 合 顺 铂 (cisplatin,ddp)(gp 方 案 ) 治 疗 腺 癌 小 鼠 移 植 敏 感 性 的 影 响, 并 初 步 探 讨 其 可 能 的 作 用 机 制 方 法 :40 只 接 种 Lewis 癌 的 C57BL/6J 小 鼠 随 机 分 成 5 组, 分 别 给 予 相 应 的 药 预 : 对 照 组 高 剂 量 果 王 素 组 (180 mg/kg) GP 化 疗 组 [DDP(3 mg/kg)+ 吉 西 他 滨 (50 mg/kg)] 低 剂 量 果 王 素 (60 mg/kg) 联 合 GP 化 疗 组 和 高 剂 量 果 王 素 (180 mg/kg) 联 合 GP 化 疗 组 观 察 的 长 情 况, 并 于 接 种 20 d 后 处 死 各 组 小 鼠 分 别 采 用 免 疫 组 织 化 学 及 反 转 录 聚 合 酶 链 反 应 (reverse transcription-polymerase chain reaction,rt-pcr) 法 检 测 组 织 中 P- 糖 蛋 白 (P-glycoprotein, P-gp) 及 葡 萄 糖 调 节 蛋 白 78(glucose-regulated proteins 78,GRP78) 蛋 白 和 mrna 的 表 达 结 果 : 各 用 药 组 的 长 速 度 均 低 于 对 照 组, 以 高 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组 的 抑 效 果 最 好 低 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组 高 剂 量 果 王 素 组 及 高 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组 中 P-gp 和 GRP78 mrna 及 蛋 白 的 表 达 水 平 均 较 对 照 组 和 GP 化 疗 组 明 显 降 低, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P < 0.01); 且 高 剂 量 果 王 素 组 及 高 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组 中 P-gp 和 GRP78 mrna 及 蛋 白 的 表 达 水 平 均 较 低 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组 下 调 结 论 : 果 王 素 能 明 显 增 强 GP 方 案 疗 对 腺 癌 的 疗 效, 其 作 用 机 制 可 能 与 下 调 P-gp 及 GRP78 的 表 达 有 关 [ 关 键 词 ] 癌, 非 小 细 胞 肺 ;α 亚 麻 酸 ; 抗 肿 瘤 联 合 化 学 治 疗 ; 多 药 耐 药 相 关 蛋 白 质 类 [ 中 图 分 类 号 ] R734.2 R284.1 [ 文 献 标 志 码 ] A [ 文 章 编 号 ] 1000-7431 (2014) 12-1120-06 Reversing multidrug resistance of lung adenocarcinoma xenografts to gemcitabine in combination with cisplatin in mice by Kiwi essence and its mechanism HE Jian-bin 1, YI Gao-zhong 1, CHEN Zhi-kui 1, HE Wei 1, DENG Xiang 2, ZHANG Ping 2 1. Department of Respiratory Medicine, Huaihua First People s Hospital, Hu nan University of Medicine, Huaihua 418000, Hu nan Province, China; 2. Department of Respiratory Medicine, First Affiliated Hospital of Nanhua University, Hengyan 421001, Hu nan Province, China [ABSTRACT] Objective: To investigate the effect of Kiwi essence on sensitivity of lung adenocarcinoma xenografts in mice to gemcitabine in combination with cisplatin (DDP) (GP regimen) in mice, and to explore the possible mechanism. Methods: Forty C57BL/6J mice bearing tumor xenografts of Lewis cells were randomized into 5 groups: control group (not tearted with Kiwi essence), high-dose (180 mg/kg) Kiwi essence group, GP group [DDP (3 mg/kg) + gemcitabine (50 mg/kg)], low-dose (60 mg/kg) Kiwi essence combined with GP group, and high-dose (180 mg/kg) Kiwi essence combined with GP group. The growth of tumor xenografts was observed. The mice were sacrificed 20 d after transplantation. The protein and mrna expression levels of P-glycoprotein (P-gp) and glucose-regulated protein 78 (GRP78) in tumor xenografts were detected by immunohistochemistry and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results: The tumor growth was inhibited in various degrees in each drug intervention group as compared with that of the control group, and this inhibition effect was most significant in highdose (180 mg/kg) Kiwi essence combined with GP group. The mrna and protein expression levels of P-gp and GRP78 were significantly decreased in low-dose Kiwi essence combined with GP group, high-dose Kiwi essence group, and high-dose Kiwi essence combined with GP group, as compared with those of the [ 基 金 项 目 ] 湖 南 省 中 医 药 管 理 局 科 研 基 金 资 助 项 目 ( 编 号 :201281) Correspondence to: HE Jian-bin( 贺 兼 斌 ) E-mail: hjb0919@aliyun.com Received 2014-08-04 Accepted 2014-10-14

贺 兼 斌, 等. 果 王 素 对 提 高 吉 西 他 滨 联 合 顺 铂 治 疗 肺 腺 癌 小 鼠 移 植 瘤 敏 感 性 的 影 响 1121 control group and GP group (P < 0.01). The expression levels of P-gp and GRP78 proteins and mrnas were significantly decreased in high-dose Kiwi essence group and high-dose Kiwi essence combined with GP group as compared with that of the low-dose Kiwi essence combined with GP group. Conclusion: Kiwi essence can obviously reverse the multidrug resistance of lung adenocarcinoma to GP chemotherapy in mice. This mechanism may be associated to the down-regulation of P-gp and GRP78. [KEY WORDS] Carcinoma, non-small cell lung; Alpha-linolenic acid; Antinoplastic combined chemotherapy protocols; Multidrug resistance-associated proteins [TUMOR, 2014, 34 (12): 1120-1125] 肺 癌 是 目 前 世 界 上 最 常 见 及 病 死 率 最 高 的 恶 性 肿 瘤 之 一, 近 年 来 肺 腺 癌 在 肺 癌 中 所 占 的 比 [1, 例 明 显 升 高 2], 由 于 肺 癌 的 临 床 表 现 缺 乏 特 异 性, 大 部 分 患 者 被 确 诊 时 已 处 于 中 晚 期, 丧 失 了 手 术 的 机 会, 因 此, 目 前 化 疗 是 临 床 上 肺 癌 综 合 治 疗 中 最 有 力 和 常 用 的 手 段 然 而, 由 于 肿 瘤 细 胞 多 药 耐 药 (multidrug resistance,mdr) 的 产 生, 治 疗 的 效 果 往 往 不 能 令 人 满 意, 存 在 预 后 不 佳 等 问 题 [3] 因 此, 寻 找 不 良 反 应 少, 并 能 逆 转 MDR, 提 高 肿 瘤 对 化 疗 药 物 敏 感 性 的 药 物, 对 提 高 化 疗 的 疗 效 具 有 重 要 的 临 床 意 义 果 王 素 (Kiwi essence) 为 猕 猴 桃 果 仁 油 脂 肪 酸, 具 有 抗 [4, 氧 化 抗 肿 瘤 和 保 护 细 胞 的 作 用 5], 但 目 前 其 是 否 能 协 同 逆 转 肿 瘤 对 化 疗 药 物 耐 药 性 的 作 用 尚 缺 乏 研 究 因 此, 本 研 究 中 首 先 通 过 构 建 Lewis 肺 癌 小 鼠 移 植 瘤 模 型, 随 后 采 用 果 王 素 联 合 GP 方 案 [ 吉 西 他 滨 (gemcitabine) 联 合 顺 铂 (cisplatin, DDP)] 对 移 植 瘤 进 行 治 疗, 以 观 察 果 王 素 联 合 GP 化 疗 对 小 鼠 移 植 瘤 生 长 的 影 响, 并 通 过 检 测 移 植 瘤 内 MDR 指 标 P- 糖 蛋 白 (P-glycoprotein, P-gp) 及 凋 亡 抑 制 蛋 白 葡 萄 糖 调 节 蛋 白 78(glucoseregulated protein 78,GRP78) 的 表 达, 以 探 讨 果 王 素 对 提 高 化 疗 敏 感 性 可 能 的 作 用 机 制 1 材 料 与 方 法 1.1 实 验 动 物 C57BL/6J 小 鼠 40 只, 雄 性, 无 特 定 病 原 体 (specific pathogen-free,spf) 级, 平 均 体 质 量 为 (20±2)g, 购 自 中 国 医 学 科 学 院 肿 瘤 医 院 实 验 动 物 中 心 [ 实 验 动 物 饲 养 许 可 证 号 : SCXK( 京 )2009-0004], 由 南 华 大 学 动 物 部 提 供 SPF 级 的 饲 养 环 境 Lewis 肺 癌 ( 鼠 源 ) 荷 瘤 种 鼠 2 只, 购 自 中 国 医 学 科 学 院 基 础 医 学 研 究 所 细 胞 中 心 [ 实 验 动 物 饲 养 许 可 证 号 :SCXK( 京 ) 2009-0004] 1.2 药 品 及 试 剂 果 王 素 ( 浓 度 60%) 由 湘 西 老 爹 生 物 有 限 公 司 惠 赠 DDP 购 于 江 苏 豪 森 药 业 股 份 有 限 公 司 ( 生 产 批 号 :040605), 吉 西 他 滨 (gemcitabine) 购 于 江 苏 豪 森 药 业 股 份 有 限 公 司 ( 生 产 批 号 :121113) 兔 抗 鼠 P-gp 单 克 隆 抗 体 购 于 美 国 Santa Cruz 公 司, 兔 抗 鼠 GRP78 单 克 隆 抗 体 购 于 武 汉 博 士 德 生 物 工 程 有 限 公 司 免 疫 组 织 化 学 检 测 试 剂 盒 及 DAB 显 色 剂 均 购 自 北 京 中 杉 金 桥 生 物 技 术 有 限 公 司 反 转 录 聚 合 酶 链 反 应 (reverse transcription-polymerase chain reaction,rt-pcr) 法 试 剂 盒 和 Taq 酶 购 自 生 工 生 物 工 程 ( 上 海 ) 股 份 有 限 公 司 TRIzol 试 剂 购 自 美 国 BBI 公 司 1.3 动 物 模 型 的 建 立 处 死 Lewis 肺 癌 荷 瘤 种 鼠, 无 菌 条 件 下 剥 离 肿 瘤, 除 去 肿 瘤 表 面 的 血 管 结 缔 组 织 以 及 内 部 坏 死 的 组 织 按 1 g 肿 瘤 组 织 加 4 ml 0.9% 氯 化 钠 溶 液 的 比 例 在 匀 浆 机 中 研 磨 成 匀 浆 液, 过 360 目 ( 孔 径 0.042 mm) 的 钢 网, 制 成 肿 瘤 细 胞 悬 液, 调 节 细 胞 密 度 为 2 10 6 个 /ml, 接 种 于 C57BL/6J 小 鼠, 于 每 只 小 鼠 右 后 腿 根 部 外 侧 皮 下 注 射 0.2 ml 的 肿 瘤 细 胞 悬 液, 构 建 小 鼠 皮 下 移 植 瘤 模 型 1.4 实 验 分 组 及 用 药 小 鼠 皮 下 接 种 肿 瘤 细 胞 4 d 后 均 有 硬 质 的 小 结 节 出 现, 即 可 开 始 进 行 药 物 干 预 将 40 只 小 鼠 随 机 分 成 5 组, 每 组 8 只 : (1) 对 照 组, 分 别 于 肿 瘤 细 胞 接 种 后 的 第 5 12 和 19 天 时 腹 腔 注 射 0.9% 氯 化 钠 溶 液 ( 每 只 小 鼠 每 次 0.4 ml), 同 时 每 只 小 鼠 每 天 用 0.3 ml 的 蒸 馏 水 灌 胃 1 次 ;(2) 高 剂 量 果 王 素 组, 于 肿 瘤 细 胞 接 种 后 的 次 日 开 始, 每 天 用 高 剂 量 果 王 素 (180 mg/kg) 灌 胃 1 次 ( 体 积 为 0.3 ml);(3)gp 化 疗 组, 分 别 于 肿 瘤 细 胞 接 种 后 的 第 5 12 和 19 天 时 腹 腔 注 射 DDP(3 mg/kg) 和 吉 西 他 滨 (50 mg/kg) 各 1 次, 药 物 体 积 均 为 0.2 ml;(4) 低 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组, 化 疗 方 案 同 GP 化 疗 组, 同 时 于 肿 瘤 细 胞 接 种 后 的 次 日 开 始, 每 天 用 低 剂 量 果 王 素 (60 mg/kg) 灌 胃 1 次 ( 体 积 为 0.3 ml);(5) 高 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组, 化 疗 方 案 同 GP 化 疗 组, 同 时 于 肿 瘤 细 胞 接 种 后 的 次 日 开 始, 每 天 用 高 剂 量 果 王 素 (180 mg/kg) 灌 胃 1 次 ( 体 积 为 0.3 ml) 所 有 小 鼠 都 在 肿 瘤 细 胞

1122 贺 兼 斌, 等. 果 王 素 对 提 高 吉 西 他 滨 联 合 顺 铂 治 疗 肺 腺 癌 小 鼠 移 植 瘤 敏 感 性 的 影 响 接 种 20 d 后 被 处 死, 并 取 出 肿 瘤 部 分 肿 瘤 置 于 4% 的 中 性 甲 醛 溶 液 中 固 定 处 理, 石 蜡 包 埋 后 制 备 组 织 切 片 ( 厚 度 为 4 µm), 随 后 行 免 疫 组 织 化 学 检 测 或 苏 木 精 - 伊 红 (hematoxylin-eosin,he) 染 色 ; 部 分 肿 瘤 迅 速 放 入 - 196 的 液 氮 中 保 存, 用 于 提 取 总 RNA 1.5 肿 瘤 生 长 情 况 的 观 察 肿 瘤 细 胞 接 种 4 d 后, 每 日 测 量 1 次 小 鼠 皮 下 肿 瘤 的 最 大 长 径 (a) 和 横 径 (b), 肿 瘤 体 积 = 1/2 ab 2 ; 处 死 小 鼠 后, 完 整 剥 取 移 植 瘤 并 称 取 瘤 体 质 量, 计 算 各 组 药 物 的 抑 瘤 率, 抑 瘤 率 (%)=(1 - 治 疗 组 平 均 瘤 体 质 量 / 对 照 组 平 均 瘤 体 质 量 ) 100% 1.6 免 疫 组 织 化 学 检 测 采 用 免 疫 组 织 化 学 法 检 测 各 组 肿 瘤 标 本 中 P-gp 和 GRP78 蛋 白 的 表 达, 检 测 步 骤 严 格 按 试 剂 盒 操 作 说 明 书 进 行, 一 抗 分 别 为 兔 抗 鼠 P-gp 单 克 隆 抗 体 和 兔 抗 鼠 GRP78 单 克 隆 抗 体, 用 PBS 缓 冲 液 代 替 一 抗 作 为 阴 性 对 照 结 果 判 断 : 肿 瘤 细 胞 细 胞 质 内 出 现 清 晰 的 黄 褐 色 至 棕 黄 色 颗 粒 者 为 阳 性 ; 高 倍 光 学 显 微 镜 下 计 数 100 个 细 胞, 肿 瘤 细 胞 细 胞 质 内 及 细 胞 膜 上 呈 棕 黄 色 的 阳 性 细 胞 所 占 的 比 例 < 10% 为 阴 性, 10% 为 阳 性 ; 采 用 全 自 动 图 像 分 析 系 统 测 定 并 计 算 肿 瘤 组 织 中 P-gp 和 GRP78 蛋 白 的 平 均 灰 度 值 1.7 半 定 量 RT-PCR 法 检 测 P-gp 和 GRP78 mrna 的 表 达 从 GenBank 检 索 获 得 P-gp 和 GRP78 基 因 的 全 序 列, 并 采 用 Primer5 软 件 进 行 引 物 设 计 MDRl 基 因 引 物 序 列 ( 用 于 P-gp mrna 的 检 测 ): 上 游 引 物 为 5 -CCCATCATTGCAAT- AGCAGG-3, 下 游 引 物 为 5 -GTTCAAACT- TCTGCTCCTGA-3, 片 段 大 小 为 167 bp; 以 GAPDH 为 内 参 照,GAPDH 基 因 : 上 游 引 物 为 5 -CTGCACCACCAACTGCTT-3, -3, 下 游 引 物 为 5 -GTCTGGGATGGAAATTGTGA-3, -3, 片 段 大 小 为 660 bp;grp78 基 因 : 上 游 引 物 为 5 -GA- TAATCAACCAACTGTTAC-3, 下 游 引 物 为 5 -GTATCCTCTTCACCAGTTGG-3, -3, 片 段 大 小 为 575 bp; 以 GAPDH 为 内 参 照,GAPDH 基 因 : 上 游 引 物 为 5 -CCCATCTACGAGGGCTAT-3, -3, 下 游 引 物 为 5 -TGTCACGCACGATTTCC-3, -3, 片 段 大 小 为 145 bp 上 述 引 物 均 由 生 工 生 物 工 程 ( 上 海 ) 股 份 有 限 公 司 合 成 采 用 TRIzo1 法 提 取 肿 瘤 组 织 的 总 RNA, 并 用 二 步 法 扩 增 目 的 片 段 ( 第 一 步 将 RNA 反 转 录 为 cdna, 第 二 步 PCR 扩 增 获 得 目 的 基 因 ), 所 有 检 测 步 骤 按 RT-PCR 试 剂 盒 操 作 说 明 进 行 P-gp 基 因 的 PCR 扩 增 条 件 : 第 一 步,4 预 变 性 2 min; 第 二 步,96 15 s 62 20 s 70 60 s, 共 35 个 循 环 ; 最 后,72 延 伸 5 min GRP78 基 因 的 PCR 扩 增 条 件 : 第 一 步,95 预 变 性 1 min; 第 二 步,95 30 s 49 30 s 72 30 s, 共 33 个 循 环 ; 最 后,72 延 伸 10 min PCR 产 物 经 2% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 鉴 定, 用 Totallab 分 析 软 件 进 行 条 带 扫 描 分 析, 测 量 电 泳 条 带 密 度, 计 算 mrna 相 对 量 mrna 相 对 表 达 量 = 目 标 基 因 扫 描 值 /GAPDH 扫 描 值 100 1.8 统 计 学 方 法 应 用 SPSS 17.0 软 件 对 所 有 的 实 验 数 据 进 行 统 计 学 处 理, 定 量 资 料 采 用 ± s 表 示, 两 组 间 比 较 使 用 组 间 t 检 验, 多 样 本 均 数 间 多 重 比 较 采 用 方 差 分 析 及 LSD-t 检 验, 率 的 比 较 采 用 χ 2 检 验, 以 P < 0.05 为 差 异 有 统 计 学 意 义 2 结 果 2.1 肿 瘤 生 长 情 况 Lewis 肺 癌 细 胞 接 种 后 的 第 1 ~ 4 天, 移 植 瘤 的 生 长 情 况 基 本 相 同, 接 种 的 细 胞 均 成 瘤, 肿 瘤 呈 结 节 状 生 长 ; 第 18 ~ 20 天, 对 照 组 移 植 瘤 的 生 长 明 显 快 于 其 他 各 治 疗 组, 其 中 以 高 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组 肿 瘤 生 长 最 慢 (P < 0.05, 图 1A) 根 据 肿 瘤 的 质 量 计 算 各 组 的 抑 瘤 率, 结 果 显 示 高 剂 量 果 王 素 组 GP 化 疗 组 低 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组 和 高 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组 分 别 为 14.95% 41.77% 44.21% 和 59.68%, 各 药 物 组 对 移 植 瘤 的 生 长 均 有 抑 制 作 用, 并 以 高 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组 更 为 明 显 ; 高 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组 与 对 照 组 比 较, 瘤 体 质 量 的 差 异 有 显 著 的 统 计 学 意 义 (P < 0.01, 图 1B) 2.2 P-gp 和 GRP78 蛋 白 的 表 达 对 各 药 物 组 移 植 瘤 组 织 的 免 疫 组 织 化 学 检 测 结 果 ( 图 1C) 及 定 量 分 析 结 果 显 示,P-gp 及 GRP78 均 定 位 于 Lewis 肺 癌 细 胞 的 细 胞 质 及 细 胞 膜 上,P-gp 及 GRP78 蛋 白 的 表 达 具 有 一 致 性, 在 对 照 组 及 GP 化 疗 组 中 的 表 达 量 最 高, 经 比 较 组 间 差 异 无 统 计 学 意 义 ; 而 各 果 王 素 干 预 组 中 P-gp 及 GRP78 蛋 白 的 表 达 量 均 明 显 降 低, 与 对 照 组 及 GP 化 疗 组 比 较, 差 异 均 有 统 计 学 意 义 (P < 0.01); 高 剂 量 果 王 素 组 与 高 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组 间 经 比 较, 差 异 无 统 计 学 意 义 ; 低 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组 与 高 剂 量 果 王 素 组 及 高 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组 比 较,P-gp 及 GRP78 蛋 白 的 表 达 量 均 高 于 高 剂 量 果 王 素 组 及 高 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P < 0.01) 以 上 结 果 提 示, 果 王 素 能 明 显 下 调 肿 瘤 组 织 中 耐 药 相 关 蛋 白 P-gp 及 GRP78 的 表 达, 并 以 果 王 素 高 剂 量 组 更 有 优 势

贺 兼 斌, 等. 果 王 素 对 提 高 吉 西 他 滨 联 合 顺 铂 治 疗 肺 腺 癌 小 鼠 移 植 瘤 敏 感 性 的 影 响 1123 F ig. 1 Effects of Kiwi essence alone, GP (gemcitabine combined with cisplatin) regimen, and Kiwi essence in combination with GP regimen on the growth of tumor xenografts of Lewis cells in mice and the expression levels of P-glycoprotein (P-gp) and glucose-regulated protein 78 (GRP78) proteins and mrnas in tumor xenografts were detected by immunohistochemistry and semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), respectively. A: The growth curves of tumor xenografts in mice. B: Gross specimens of tumor xenografts. The tumor-bearing mice were sacrificed on the 20th day after transplantation. C: The expression levels of P-gp and GRP78 proteins in tumor xenografts (DAB, 400). D: The expression levels of P-gp and GRP78 mrnas in tumor xenografts. * P<0.05, ** P<0.01, vs control group (group 1); P<0.01, vs the control group (group 1) and GP group (group 3); P<0.01, vs high-dose Kiwi essence group (group 2) and high-dose Kiwi essence combined with GP group (group 5). Control group (group 1): The tumorbearing mice were treated with 0.9% sodium chloride solution (intraperitoneal injection on the 5th, 12th and 19th day after transplantation) and distilled water (gastric lavage everyday from the 2th day after transplantation); High-dose Kiwi essence group (group 2): The tumor-bearing mice were treated with Kiwi essence (180 mg/kg) (gastric lavage everyday from the 2th day after transplantation); GP group (group 3): The tumor-bearing mice were treated with gemcitabine (50 mg/kg) combined with cisplatin (3 mg/kg) (intraperitoneal injection on the 5th, 12th and 19th day after transplantation); Lowdose Kiwi essence combined with GP group (group 4): The tumor-bearing mice were treated with Kiwi essence (60 mg/kg) (gastric lavage everyday from the 2th ady after transplantation) combined with GP regimen; High-dose Kiwi essence combined with GP group (group 5): The tumor-bearing mice were treated with Kiwi essence (180 mg/kg) (gastric lavage everyday from the 2th day after transplantation) combined with GP regimen; n=8. 图 1 果 王 素 单 药 或 联 合 GP 化 疗 对 小 鼠 Lewis 肺 癌 移 植 瘤 生 长 的 影 响 以 及 对 移 植 瘤 组 织 中 P-gp 及 GRP78 蛋 白 及 mrna 表 达 的 影 响

1124 贺 兼 斌, 等. 果 王 素 对 提 高 吉 西 他 滨 联 合 顺 铂 治 疗 肺 腺 癌 小 鼠 移 植 瘤 敏 感 性 的 影 响 2.3 P-gp 和 GRP78 mrna 的 表 达 半 定 量 RT- PCR 检 测 结 果 表 明 ( 图 1D), 与 对 照 组 及 GP 化 疗 组 比 较, 各 果 王 素 干 预 组 中 P-gp 和 GRP78 mrna 的 表 达 量 均 明 显 降 低, 差 异 均 有 统 计 学 意 义 (P 均 < 0.01); 而 对 照 组 与 GP 化 疗 组 的 差 异 无 统 计 学 意 义 ; 高 剂 量 果 王 素 组 与 高 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组 间 差 异 亦 无 统 计 学 意 义 ; 低 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组 与 高 剂 量 果 王 素 组 及 高 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组 间 经 比 较, 低 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组 中 P-gp 和 GRP78 mrna 的 表 达 量 均 明 显 高 于 高 剂 量 果 王 素 组 及 高 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组, 差 异 均 有 统 计 学 意 义 (P < 0.01) 以 上 结 果 再 次 提 示, 果 王 素 能 明 显 下 调 肿 瘤 组 织 中 耐 药 相 关 基 因 P-gp 及 GRP78 的 表 达 水 平, 并 以 果 王 素 高 剂 量 组 更 佳 3 讨 论 [1, 肺 腺 癌 的 发 病 率 日 趋 增 高 2], 由 于 肺 腺 癌 细 胞 的 恶 性 程 度 高, 且 肿 瘤 内 血 管 丰 富, 转 移 发 生 早, 因 此 化 疗 是 最 重 要 的 一 种 治 疗 手 段, 其 中 DDP 和 吉 西 他 滨 均 为 肺 癌 的 一 线 化 疗 药 物, 由 其 组 成 的 GP 化 疗 方 案 是 非 小 细 胞 肺 癌 化 疗 的 经 典 方 案, 在 肺 癌 化 疗 中 具 有 重 要 的 地 位, 但 往 往 由 于 耐 药 的 产 生 而 影 响 了 其 临 床 疗 效 [6] 因 此, 如 何 逆 转 肿 瘤 的 耐 药 性 是 提 高 化 疗 疗 效 的 重 要 课 题 果 王 素 即 奇 异 果 精 华 素, 主 要 成 分 为 α 亚 麻 酸, 并 含 有 一 定 量 的 维 生 素 E 及 微 量 元 素 硒 等 物 [4, 质, 其 抗 肿 瘤 的 作 用 已 被 证 实 5], 但 其 逆 转 肺 癌 耐 药 的 研 究 却 鲜 见 报 道, 因 此, 本 研 究 构 建 了 小 鼠 肺 腺 癌 动 物 模 型, 以 探 讨 果 王 素 对 GP 化 疗 方 案 耐 药 的 逆 转 作 用 及 可 能 的 作 用 机 制 肿 瘤 细 胞 耐 药 是 多 因 素 共 同 作 用 的 结 果, 作 用 机 制 较 复 杂, 主 要 包 括 限 制 化 疗 药 物 的 吸 收 和 积 累 改 变 修 复 机 制 药 物 解 毒 系 统 的 激 活 和 促 进 细 胞 生 存 的 改 变 等 [7] MDR 是 指 肿 瘤 细 胞 对 分 子 结 构 不 同 及 作 用 机 制 有 差 异 的 抗 肿 瘤 药 物 发 生 交 叉 性 的 耐 药, 近 年 来 研 究 者 对 MDR 的 发 生 机 制 检 测 手 段 及 其 逆 转 的 研 究 取 得 了 较 大 的 进 展 目 前 普 遍 认 为, 膜 转 运 蛋 白 过 表 达 是 肿 瘤 细 胞 耐 药 的 主 要 因 素 之 一, 由 膜 转 运 蛋 白 介 导 的 耐 药 是 迄 今 研 究 最 为 广 泛 的 一 种 肿 瘤 细 胞 耐 药 的 机 制, 也 是 目 前 研 究 最 为 广 泛 和 深 入 且 唯 一 在 临 床 实 践 中 得 到 证 实 的 耐 药 机 制, 是 大 多 数 实 体 肿 瘤 产 生 耐 药 的 经 典 机 制 [8],MDR1 基 因 定 位 于 7 号 染 色 体 q21.1 上, 其 编 码 蛋 白 P-gp 的 相 对 分 子 质 量 为 1.70 10 5, 属 ATP 结 合 盒 式 转 运 蛋 白 (ATP-binding cassette transporter,abc) 超 家 族 的 一 个 成 员 ;P-gp 是 主 要 的 多 药 转 运 体, 在 耐 药 的 肿 瘤 细 胞 中 经 常 过 表 达, 一 般 可 通 过 细 胞 膜 上 的 蛋 白 将 药 物 从 细 胞 内 泵 出, 减 少 肿 瘤 细 胞 内 抗 肿 瘤 药 物 的 积 累 和 滞 留, 使 药 物 浓 度 低 于 治 疗 浓 度 的 阈 值, 阻 止 肿 瘤 细 胞 的 杀 灭 导 致 耐 药 [9] 在 部 分 实 体 瘤 及 其 肿 瘤 转 移 灶 中 发 现,MDR1 基 因 以 及 由 此 编 码 的 P-gp 蛋 白 表 达 增 加, 其 表 达 水 平 与 细 胞 耐 药 程 度 有 关, 抑 制 MDRl 基 因 后 能 够 恢 复 肿 瘤 细 胞 对 化 疗 药 物 的 敏 感 性, 从 而 控 制 [10, 肿 瘤 的 发 展 11] 本 研 究 中, 对 照 组 和 GP 化 疗 组 肿 瘤 中 P-gp mrna 和 蛋 白 的 表 达 水 平 明 显 高 于 果 王 素 干 预 后 的 各 药 物 组, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P < 0.01), 而 高 剂 量 果 王 素 组 及 高 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组 中 P-gp mrna 的 表 达 水 平 与 低 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组 比 较, 均 明 显 下 调, 差 异 亦 有 统 计 学 意 义 (P < 0.01); 以 上 结 果 提 示, MDRl 基 因 的 表 达 产 物 P-gp 与 MDRl 基 因 的 表 达 有 一 致 性, 并 且 推 测 果 王 素 可 以 通 过 下 调 肿 瘤 细 胞 中 MDR1 基 因 及 其 产 物 P-gp 的 表 达 发 挥 抗 耐 药 作 用, 且 呈 剂 量 相 关 性 有 研 究 认 为, 肿 瘤 耐 药 与 凋 亡 的 抑 制 有 密 切 的 相 关 性 [12],GRP78 属 于 热 休 克 蛋 白 70(heat shock protein 70,HSP70) 家 族, 是 参 与 内 质 网 应 激 的 主 要 蛋 白, 凋 亡 因 子 caspase-12 特 异 性 地 存 在 于 内 质 网 内,GRP78 通 过 与 其 结 合 来 抑 制 细 胞 的 凋 亡 [13] GRP78 在 正 常 组 织 中 低 表 达, 而 在 包 括 绒 毛 膜 癌 乳 腺 癌 和 前 列 腺 癌 等 很 多 肿 瘤 组 织 中 高 表 达, 可 能 与 肿 瘤 细 胞 对 多 种 化 疗 药 物 的 耐 药 性 相 关 [14-16] 有 文 献 报 道 [17], 下 调 GRP78 的 表 达 可 逆 转 肿 瘤 细 胞 的 多 药 耐 药 性, 增 加 肿 瘤 对 化 疗 药 物 的 敏 感 性, 降 低 肿 瘤 细 胞 的 侵 袭 和 转 移 能 力, 因 此 认 为 抑 制 肿 瘤 细 胞 发 生 过 强 的 GRP78 表 达 可 能 是 逆 转 肿 瘤 耐 药 的 一 个 很 有 前 景 的 潜 在 靶 点 本 研 究 发 现, 对 照 组 和 GP 化 疗 组 肿 瘤 中 GRP78 mrna 及 GRP78 蛋 白 的 表 达 水 平 均 明 显 高 于 果 王 素 干 预 后 的 各 药 物 组, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P < 0.01), 而 高 剂 量 果 王 素 组 及 高 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组 中 GRP78 mrna 及 蛋 白 的 表 达 水 平 与 低 剂 量 果 王 素 联 合 GP 化 疗 组 比 较, 差 异 亦 有 统 计 学 意 义 (P < 0.01), 说 明 GRP78 在 肺 腺 癌 组 织 中 高 表 达, 可 能 参 与 了 肿 瘤 的 耐 药, 而 果 王 素 能 下 调 GRP78 的 表 达, 逆 转 其 耐 药 性, 并 且 呈 剂 量 相 关 性 观 察 各 组 移 植 瘤 的 生 长 情 况, 各 用 药 组 皆 能 抑 制 肿 瘤 的 生 长, 果 王 素 与 化 疗 药 物 联 合 使 用, 明 显 增 强 了 化 疗 药 物 的 抑 瘤 作 用, 且 果 王 素 的 剂 量 越 大, 与 化 疗 药

贺 兼 斌, 等. 果 王 素 对 提 高 吉 西 他 滨 联 合 顺 铂 治 疗 肺 腺 癌 小 鼠 移 植 瘤 敏 感 性 的 影 响 1125 物 联 合 使 用 的 抑 瘤 作 用 越 明 显 ; 同 时 本 研 究 发 现, 单 用 果 王 素 亦 有 一 定 的 抑 瘤 作 用, 这 一 结 果 提 示 果 王 素 除 了 有 逆 转 耐 药 的 作 用 外, 其 本 身 亦 有 抗 肿 瘤 的 作 用, 这 可 能 是 下 调 了 GRP78 的 表 达, 解 除 了 对 细 胞 凋 亡 的 抑 制, 从 而 起 到 抗 肿 瘤 的 作 用 综 上 所 述, 果 王 素 在 化 疗 过 程 中 具 有 提 高 化 疗 疗 效 的 作 用, 其 作 用 机 制 可 能 与 下 调 耐 药 相 关 蛋 白 P-gp 及 凋 亡 抑 制 GRP78 的 表 达 有 关 目 前 关 于 肺 癌 MDR 的 机 制 尚 未 完 全 明 了, 化 疗 耐 药 的 机 制 颇 为 复 杂, 有 关 果 王 素 逆 转 肺 癌 化 疗 耐 药 更 为 具 体 的 机 制 有 待 于 进 一 步 的 研 究 [ 参 考 文 献 ] [1] Krzakowski M. New agents within the preoperative chemotherapy of non-small cell lung cancer[j]. Lung Cancer, 2001, 34(Suppl2):s159-163. [2] Harris JE, Thun MJ, MondulAM, et al. Cigarette taryields in relation to mortality from lung cancer in the cancer prevention study Ⅱ prospectivecohort, 1982-8[J]. BMJ, 2004, 328(7431):72-76. [3] Xin H, Kong Y, Jiang X, et al. Multi-drugresistant cells enriched from chronic myeloid leukemia cells by Doxorubicin prossess tumorinitiating-cell properties[j]. J Pharmacol Sci, 2013, 122(4):299-304. [4] 向 志 钢, 李 先 辉, 刘 锋, 等. 果 王 素 对 小 鼠 酒 精 性 肝 病 保 护 作 用 的 实 验 研 究 [J]. 中 国 现 代 医 学 杂 志, 2010, 20(3):374-376. [5] 周 卫 华, 米 长 忠, 吴 仕 筠, 等. 果 王 素 对 D- 半 乳 糖 致 衰 老 小 鼠 学 习 记 忆 功 能 的 改 善 作 用 [J]. 时 珍 国 医 国 药, 2010, 21(8):1915-1916. [6] 安 永 寿, 李 柱, 柴 文 玲, 等. 多 药 耐 药 基 因 在 膀 胱 尿 路 上 皮 癌 中 的 表 达 及 临 床 意 义 [J]. 中 华 泌 尿 外 科 杂 志, 2013, 34(1):53-58. [7] 王 倩, 程 堃. Gankyrin 基 因 沉 默 对 人 卵 巢 癌 SKOV3/CDDP 细 胞 顺 铂 耐 药 性 的 逆 转 作 用 和 机 制 [J]. 中 国 癌 症 杂 志, 2014, 24(1):35-40. [8] 耿 明, 王 琳, 曹 永 成, 等. 胃 癌 细 胞 对 化 疗 药 物 的 敏 感 性 及 其 与 Pgp GST 和 Topo Ⅱ 表 达 的 关 系 [J]. 中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志, 2010, 19(3):295-299. [9] 陈 文 慧, 徐 萌, 杜 超 超, 等. 碱 性 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子 单 克 隆 抗 体 通 过 P- 糖 蛋 白 逆 转 乳 腺 癌 MCF-7/ ADM 细 胞 多 药 耐 药 性 的 分 子 机 制 [J]. 肿 瘤, 2013, 33(1):8-14. [10] Scott AM,Wolchok JD,Old LJ. Antibody therapy of cancer[j]. Nat Rev Cancer, 2012, 12(4):278-287. [11] 方 强, 董 丹 丹, 杨 红, 等. 多 药 耐 药 相 关 蛋 白 在 食 管 鳞 癌 原 发 灶 与 淋 巴 结 转 移 灶 中 的 差 异 表 达 及 意 义 [J]. 中 国 癌 症 杂 志, 2014, 24(1):15-20. [12] 罗 文, 杨 杰, 廉 超, 等. 尾 型 同 源 盒 基 因 2 沉 默 对 人 胃 癌 耐 顺 铂 细 胞 SGC7901/DDP 多 药 耐 药 性 的 逆 转 [J]. 中 华 消 化 外 科 杂 志, 2014, 13(1):55-61. [13] 杨 磊, 杨 书 云, 季 建 美, 等. 葡 萄 糖 调 节 蛋 白 78 在 胃 癌 组 织 中 的 表 达 及 其 临 床 意 义 [J]. 中 华 肿 瘤 杂 志, 2013, 35(11):837-842. [14] 韩 冰, 向 阳, 冯 凤 芝, 等. 内 质 网 蛋 白 质 折 叠 分 子 伴 侣 在 氟 尿 苷 耐 药 绒 毛 膜 癌 JeG-3/FUDRA 细 胞 中 的 作 用 [J]. 中 华 妇 产 科 杂 志, 2013, 48(1):41-45. [15] Lee E, Nichols P, Spicer D, et al. GRP78 as a novel predictor of responsiveness to chemotherapy i n b r e a s t c a n c e r [ J ]. C a n c e r R e s, 2 0 0 6, 66(16):7849-7853. [16] Pootrakul L, Datar RH, Shi SR, et al. Expression of stress response protein Grp88 is associated with the development of castration-resistant prostate cancer[j]. Clin Cancer Res, 2006, 12(20pt1):5987-5993. [17] 范 丽 梅, 苏 静, 董 慧, 等. 抑 制 葡 萄 糖 调 节 蛋 白 78 表 达 逆 转 人 卵 巢 癌 细 胞 顺 铂 耐 药 机 制 的 分 析 [J]. 中 华 医 学 杂 志, 2013, 93(17):1341-1344. [ 本 文 编 辑 ] 林 琳