中 国 农 学 通 报 212,28():2-27 Chinese Agricultural cience Bulletin 血 清 11 型 鸭 疫 里 默 氏 菌 的 分 离 鉴 定 1,2 2, 2, 2, 2, 2, 2, 杨 晓 辉, 程 龙 飞, 陈 红 梅, 施 少 华, 傅 光 华, 万 春 和, 黄 瑜 ( 1 福 建 省 农 业 科 学 院 畜 牧 兽 医 研 究 所, 福 州 1; 2 江 西 农 业 大 学 动 物 科 学 学 院, 南 昌 ; 福 建 省 畜 禽 疫 病 防 治 工 程 技 术 研 究 中 心, 福 州 1) 摘 要 : 从 同 一 发 病 鸭 场 间 隔 天 分 离 到 两 株 鸭 疫 里 默 氏 菌 (A116 和 A117), 为 比 较 它 们 的 差 异 采 用 平 板 凝 集 试 验 和 琼 扩 试 验 鉴 定 血 清 型, 纸 片 法 测 定 耐 药 性, 动 物 试 验 测 定 致 病 性 结 果 显 示 : 两 株 鸭 疫 里 默 氏 菌 的 血 清 型 相 同, 均 为 11 型 ; 对 樱 桃 谷 鸭 的 致 病 性 相 同 ; 对 大 多 数 药 物 的 敏 感 性 相 同, A116 对 庆 大 霉 素 和 青 霉 素 敏 感, 而 A117 对 庆 大 霉 素 和 青 霉 素 耐 药 结 果 确 认 了 11 型 鸭 疫 里 默 氏 菌 在 福 建 的 存 在, 增 添 了 福 建 省 鸭 疫 里 默 氏 菌 的 流 行 病 学 资 料 ; 与 实 验 室 人 工 诱 导 相 比, 体 内 的 鸭 疫 里 默 氏 菌 更 容 易 产 生 耐 药 性 关 键 词 : 鸭 疫 里 默 氏 菌 ; 血 清 型 ; 药 敏 试 验 ; 致 病 性 中 图 分 类 号 :82.61 文 献 标 志 码 :A 论 文 编 号 :211-2896 Isolation and Identification of erotype 11 iemerella Anatipestifer Yang Xiaohui 1,2, Cheng Longfei 2,, Chen Hongmei 2,, hi haohua 2,, Fu Guanghua 2,, Wan Chunhe 2,, Huang Yu 2, ( 1 Institute of Animal Husbandry and Veterinary edicine, Fujian Academy of Agricultural ciences, Fuzhou 1; 2 Animal cience College of Jiangxi Agriculture University, Nanchang ; Fujian Animal Diseases Control Technology Development Center, Fuzhou 1) Abstract: Two strains of iemerella anatipestifer (A116 and A117) had been isolated from the same duck farm interval of four days. To compare the differences of the two strains, plate agglutination and agar gel precipitation tests were used to identify the serotypes of them, Kirby-Bauer method was used to detect the drug sensitivities, and animal testing was used to determine the pathogenic of them. The results showed that both of two strains were serotype 11, had the same pathogenic to duck, and had the same sensitivities to most drugs. train A116 was sensitive to Gentamicin and Penicillin, while strain A117 was resistant to these two drugs. This test confirmed the presence of serotype 11 iemerella anatipestifer in Fujian province and added the epidemiological data of iemerella anatipestifer. Compared with laboratory artificially induced, the strain in vivo might get the resistance to drug easier. Key words: riemerella anatipestifer; serotype; drug sensitivity test; pathogenic 基 金 项 目 : 现 代 农 业 产 业 技 术 体 系 建 设 专 项 资 金 鸭 疫 里 默 氏 菌 侵 染 机 制 及 功 能 基 因 解 析 (CA--7B); 福 建 省 公 益 类 科 研 院 所 专 项 鸭 疫 里 默 氏 菌 和 鸭 大 肠 杆 菌 二 联 灭 活 苗 的 研 制 (2112-6) 第 一 作 者 简 介 : 杨 晓 辉, 男,1987 年 出 生, 河 南 孟 州 人, 硕 士, 主 要 从 事 动 物 传 染 病 研 究 通 信 地 址 :1 福 建 省 福 州 市 晋 安 区 埔 党 福 建 省 农 科 院 畜 牧 兽 医 研 究 所,Tel:91-877296,E-mail:yxh1987819@16.com 通 讯 作 者 : 黄 瑜, 男,196 年 出 生, 江 西 宁 都 人, 研 究 员, 博 士, 主 要 从 事 畜 禽 传 染 病 研 究 通 信 地 址 :1 福 建 省 福 州 市 晋 安 区 埔 党 福 建 省 农 科 院 畜 牧 兽 医 研 究 所,Tel:91-877296,E-mail:huangyu_81@16.com 程 龙 飞, 男,1971 出 生, 福 建 莆 田 人, 研 究 员, 硕 士, 主 要 从 事 畜 禽 传 染 病 研 究 通 迅 地 址 :1 福 建 省 福 州 市 晋 安 区 埔 党 福 建 省 农 科 院 畜 牧 兽 医 研 究 所,Tel:91-877296,E-mail:lf96@yahoo.com.cn 收 稿 日 期 :211--11, 修 回 日 期 :211-11-1
2 中 国 农 学 通 报 http://www.casb.org.cn 引 言 鸭 疫 里 默 氏 菌 感 染 是 由 鸭 疫 里 默 氏 菌 (iemerella anatipestifer A.) 引 起 雏 鸭 的 一 种 接 触 性 急 性 或 慢 性 败 血 症 的 传 染 性 疾 病 该 病 主 要 侵 害 2~8 周 龄 各 品 种 雏 鸭 和 雏 鹅, 病 变 特 征 主 要 表 现 为 纤 维 素 性 心 包 炎 肝 周 炎 气 囊 炎 和 脑 膜 炎 [1] 目 前 国 际 上 公 认 的 A 血 清 型 有 21 种, 以 阿 拉 伯 数 字 来 表 示 [2-] 自 1982 年, 郭 玉 [] 璞 在 中 国 首 次 分 离 鉴 定 出 该 菌 后, 各 省 市 相 继 有 该 病 报 道, 影 响 范 围 不 断 扩 大, 已 经 成 为 鸭 最 主 要 的 细 菌 传 染 病, 严 重 影 响 养 鸭 业 的 发 展 目 前, 中 国 已 分 离 到 1~11 1~1 17 型 等 血 清 型 菌 株 [6-8], 说 明 临 床 上 流 行 的 鸭 疫 里 默 氏 菌 的 血 清 型 是 多 种 多 样 的, 再 加 上 A 各 血 清 型 之 间 缺 乏 有 效 的 交 叉 保 护, 同 时 对 抗 生 素 又 很 容 易 产 生 耐 药 性 [9], 对 该 病 的 综 合 防 治 提 出 了 更 高 的 要 求 211 年 7 月, 福 建 省 福 州 市 连 江 县 某 鸭 场 发 生 了 一 起 以 神 经 症 状 及 典 型 的 心 包 炎 肝 周 炎 气 囊 炎 为 特 征 的 传 染 病, 经 临 床 观 察 实 验 室 诊 断 及 动 物 回 归 试 验, 确 诊 为 11 型 鸭 疫 里 默 氏 菌 感 染 同 时, 还 对 该 鸭 场 间 隔 天 分 离 的 两 株 鸭 疫 里 默 氏 菌 (A116 和 A117) 的 血 清 型 药 敏 试 验 及 致 病 性 进 行 了 比 较 和 分 析, 现 报 道 如 下 1 材 料 与 方 法 1.1 临 诊 资 料 连 江 县 某 专 业 户 饲 养 了 2 羽 麻 鸭,1 日 龄 开 始 发 病, 病 鸭 精 神 沉 郁 不 愿 走 动 咳 嗽 眼 鼻 有 黏 液 性 分 泌 物 专 业 户 凭 本 人 经 验 购 买 了 卡 那 霉 素 庆 大 霉 素 和 四 环 素 拌 入 饲 料 中 饲 喂 17 日 龄 时 死 亡 羽, 病 重 鸭 头 颈 震 颤 摇 头 18 日 龄 时 死 亡 11 羽, 前 来 就 诊, 剖 检 见 心 包 膜 增 厚, 心 包 膜 有 灰 白 色 纤 维 素 渗 出 物 附 着, 肝 脏 表 面 覆 盖 着 一 层 灰 白 色 纤 维 素 性 膜, 易 剥 离, 肝 肿 大, 质 脆 气 囊 混 浊 增 厚, 上 有 纤 维 素 性 渗 出 物 附 着 呈 絮 状 或 斑 块 状 由 于 已 购 买 的 药 物 还 没 有 用 完, 所 以 没 有 增 加 用 药 因 病 情 没 有 明 显 好 转,22 天 再 次 就 诊, 发 病 情 况 剖 检 均 没 有 变 化 1.2 主 要 试 剂 胰 蛋 白 胨 大 豆 琼 脂 (Tryptic oy Agar,TA), 胰 蛋 白 胨 大 豆 肉 汤 (Tryptic oy Broth,TB), 购 自 Dfico 公 司 ; 麦 康 凯 琼 脂 购 自 北 京 陆 桥 技 术 有 限 公 司 ; 药 敏 纸 片 购 自 杭 州 微 生 物 试 剂 有 限 公 司 1. 细 菌 的 分 离 无 菌 采 集 18 天 和 22 天 死 亡 鸭 脑 组 织, 分 别 划 线 接 种 于 TA 麦 康 凯 琼 脂,7 蜡 烛 罐 培 养 2 h, 挑 取 单 菌 落 进 行 纯 培 养 从 18 天 22 天 死 亡 鸭 分 离 到 的 菌 株 分 别 命 名 为 A116 A117 1. 细 菌 染 色 特 性 取 纯 培 养 物 按 常 规 方 法 进 行 革 兰 氏 染 色 [], 光 学 显 微 镜 下 观 察 细 菌 的 形 态 和 染 色 特 性 1. 血 清 型 鉴 定 [11] 按 照 张 大 丙 介 绍 的 方 法, 分 别 进 行 玻 片 凝 集 试 验 和 琼 脂 扩 散 沉 淀 试 验 标 准 血 清 型 阳 性 菌 株 为 中 国 农 业 大 学 张 大 丙 教 授 鉴 定, 兔 抗 标 准 阳 性 菌 株 高 免 阳 性 血 清 由 福 建 省 农 业 科 学 院 禽 病 研 究 室 自 制 1..1 玻 片 凝 集 试 验 取 洁 净 载 玻 片 一 张, 滴 蒸 馏 水 一 滴, 用 接 种 环 沾 取 待 检 菌 的 纯 培 养 物 少 许 (1~2 个 菌 落 ) 于 蒸 馏 水 中 混 匀, 滴 加 未 稀 释 的 阳 性 血 清 一 滴 将 玻 片 轻 轻 反 复 摆 动 几 分 钟 后 观 察, 出 现 清 晰 的 乳 白 色 絮 状 凝 集 块 者 为 阳 性 1..2 琼 脂 扩 散 沉 淀 试 验 每 平 板 待 检 菌 纯 培 养 物 用 ml 高 盐 PB 溶 液 (.% 福 尔 马 林 8.% NaCl.2 mol/l PB,pH 7.) 洗 下 制 成 菌 悬 液, 于 沸 水 中 煮 1 h, 冷 却 后, r/min 离 心 min, 上 清 液 作 为 琼 扩 抗 原 在 蒸 馏 水 中 加 入.9% 琼 脂 和 8.%NaCl, 水 煮 融 化, 取 1 ml 加 入 直 径 9 mm 的 平 皿 中, 冷 却 凝 固 后 打 成 7 孔 梅 形 图 案, 孔 径 及 孔 距 均 为 mm, 中 央 孔 加 阳 性 血 清, 周 边 孔 加 抗 原, 置 7 湿 盒 过 夜, 出 现 清 晰 沉 淀 线 者 为 阳 性 1.6 PC 鉴 定 根 据 参 考 序 列 ATCC118 株 的 OmpA 序 列 ( 登 录 号 为 AF97) 和 CLV 1/89 株 OmpA 序 列 ( 登 录 号 AF96), 设 计 下 列 引 物 : ATF: -caacgaagatgcatggtttg AT: -cacaagcatcgtctttatcc 分 别 挑 取 A116 A117 纯 培 养 物 约 个 菌 落 于 μl ddh 2O 中, 吹 打 混 匀, 煮 沸 min, r/min 离 心 min, 上 清 作 为 模 板 进 行 PC 反 应, 同 时 以 Af2( 福 建 省 农 业 科 学 院 禽 病 研 究 室 ) 保 存 的 2 型 鸭 疫 里 默 氏 菌 菌 株 ) 作 为 阳 性 对 照, 双 蒸 水 为 空 白 对 照 PC 反 应 体 系 为 2 μl:12. μl 2 Dream Taq T Green PC aster ix ATF 和 AT 各. μl 2 μl 模 板 9. μl ddh 2O 反 应 程 序 为 9 预 变 性 min;9 变 性 s,2 退 火 s,72 延 伸 s, 个 循 环 ; 最 后 72 延 伸 min 扩 增 片 段 长 度 预 计 为 27 bp 扩 增 产 物 通 过 g/l 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳, 应 用 凝 胶 成 像 系 统 进 行 观 察 拍 照 1.7 药 敏 试 验 [12] 按 Kirby-Baure 法 进 行 药 物 敏 感 试 验, 按 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院 制 定 的 抗 菌 药 物 药 敏 试 验 判 断 标
杨 晓 辉 等 : 血 清 11 型 鸭 疫 里 默 氏 菌 的 分 离 鉴 定 2 准 进 行 判 定 1.8 致 病 性 试 验 挑 取 A116 A117 纯 培 养 物 约 个 菌 落, 分 别 接 种 于 ml TB 中,7 振 荡 培 养 过 夜 后 保 存 于 冰 箱 用 十 倍 连 续 稀 释 法 进 行 计 数, 然 后 用 TB 稀 释 成 2 8 CFU/mL 和 2 7 CFU/mL 购 进 7 日 龄 健 康 非 免 疫 麻 鸭 羽, 羽 用 于 试 验, 随 机 分 为 组, 分 别 经 皮 下 注 射 不 同 含 量 的 A116 A117 分 离 菌 纯 培 养 物. ml/ 羽, 羽 注 射 等 量 的 生 理 盐 水 作 为 对 照 攻 菌 后 观 察 天, 记 录 死 亡 数 并 从 死 亡 鸭 肝 脏 中 分 离 细 菌, 天 后 剖 杀 所 有 存 活 鸭, 观 察 有 无 心 包 炎 和 肝 周 炎 等, 并 做 细 菌 分 离 同 时 见 心 包 炎 和 肝 周 炎 的 存 活 鸭 为 严 重 病 变 鸭, 与 死 亡 鸭 合 并 计 算 死 亡 率 2 结 果 2.1 菌 落 形 态 与 形 态 染 色 麦 康 凯 琼 脂 无 细 菌 生 长 ;TA 上 的 菌 落 直 径 1~2 mm 凸 起 透 明 表 面 光 滑 边 缘 整 齐 A116 A117 革 兰 氏 染 色 均 为 阴 性 表 1 菌 株 对 鸭 的 致 病 性 含 菌 量 /(CFU/mL) 试 验 鸭 / 羽 死 亡 数 / 羽 存 活 鸭 中 严 重 病 变 鸭 数 / 羽 死 亡 率 /% A116 1 8 6 A116 1 7 8 A117 1 8 7 A117 1 7 8 对 照 2.2 血 清 学 鉴 定 玻 片 凝 集 试 验 和 琼 脂 扩 散 沉 淀 试 验 结 果 相 同, A116 A117 均 只 与 11 型 鸭 疫 里 默 氏 菌 阳 性 血 清 出 现 阳 性 反 应, 而 不 与 1 2 6 1 1 17 型 阳 性 血 清 出 现 阳 性 反 应 2. PC 鉴 定 A116 A117 Af2 做 模 板,PC 结 果 均 出 现 与 预 计 片 段 大 小 相 符 的 片 段, 见 图 1 1 2 2 bp bp 7 bp bp 27 bp 2 bp bp :DNA aker DL2;1:Af2;2:A116;:A117;: 空 白 对 照 图 1 菌 株 的 PC 鉴 定 结 果 2. 药 敏 试 验 分 离 菌 的 药 物 敏 感 性 试 验 ( 详 见 表 2) 表 明, A116 A117 对 大 多 数 药 物 的 敏 感 性 相 同, 但 对 几 种 药 物 的 敏 感 性 不 同,A116 对 庆 大 霉 素 和 青 霉 素 敏 感, 而 A117 对 庆 大 霉 素 和 青 霉 素 耐 药 ;A116 对 阿 莫 西 林 和 红 霉 素 敏 感, 而 A117 对 阿 莫 西 林 和 红 霉 素 中 度 敏 感 2. 动 物 回 归 试 验 皮 下 注 射 A116 A117 分 离 菌 纯 培 养 物 的 试 验 组, 在 攻 菌 2 h 后 陆 续 开 始 发 病, 表 现 头 颈 震 颤 流 泪, 拉 白 色 黏 稠 状 粪 便, 死 亡 鸭 剖 检 可 见 纤 维 素 性 心 包 炎 肝 周 炎 和 气 囊 炎, 从 死 亡 鸭 脑 中 可 分 离 到 细 菌, 经 血 清 学 鉴 定 仍 为 11 型 鸭 疫 里 默 氏 菌 各 试 验 组 的 死 亡 情 况 见 表 1, 皮 下 注 射 A116 A117 分 离 菌 纯 培 养 物 相 同 剂 量 的 试 验 组 之 间, 死 亡 率 没 有 差 异 对 照 鸭 全 部 健 康 结 论 与 讨 论 (1) 通 过 细 菌 分 离 菌 落 革 兰 氏 染 色 观 察 血 清 学 鉴 定 PC 鉴 定 和 动 物 回 归 试 验, 确 定 本 次 连 江 县 某 鸭 场 发 生 的 以 神 经 症 状 及 心 包 炎 肝 周 炎 气 囊 炎 为 特 征 的 传 染 病 为 11 型 鸭 疫 里 默 氏 菌 感 染 该 菌 株 皮 下 注 射 1 8 CFU, 可 引 起 7 日 龄 樱 桃 谷 鸭 % 的 死 亡 [1] 率 ( 死 亡 加 上 严 重 病 变 鸭 ), 与 程 龙 飞 等 测 定 的 2 型 鸭 疫 里 默 氏 菌 的 致 病 性 相 似, 也 是 强 致 病 性 菌 株 11 型 鸭 疫 里 默 氏 菌 的 分 离 鉴 定 确 认 了 该 血 清 型 在 福 建 省 鸭 场 的 流 行, 为 福 建 省 鸭 疫 里 默 氏 菌 的 流 行 病 学 又 增
26 中 国 农 学 通 报 http://www.casb.org.cn 表 2 菌 株 的 药 敏 试 验 药 物 类 别 药 物 名 称 纸 片 含 药 量 /(μg/ 片 ) A116 药 敏 结 果 A117 丁 胺 卡 那 霉 素 庆 大 霉 素 氨 基 糖 甙 类 卡 那 霉 素 链 霉 素 新 霉 素 青 霉 素 G IU 青 霉 素 类 氨 苄 青 霉 素 阿 莫 西 林 头 孢 类 头 孢 氨 苄 头 孢 唑 啉 四 环 素 类 四 环 素 强 力 霉 素 大 环 内 酯 类 红 霉 素 1 多 肽 类 多 粘 菌 素 B 其 他 抗 生 素 利 福 平 克 林 霉 素 2 磺 胺 类 磺 胺 甲 基 异 恶 唑 复 方 新 诺 明 2.7/1.2 氧 氟 沙 星 环 丙 沙 星 喹 诺 酮 类 氟 哌 酸 左 氧 氟 沙 星 恩 诺 沙 星 注 : 为 耐 药, 为 中 敏, 为 敏 感 添 了 新 的 内 容 由 于 鸭 疫 里 默 氏 菌 不 同 血 清 型 之 间 的 交 叉 保 护 率 很 低, 今 后 选 择 灭 活 苗 进 行 免 疫 预 防 时 应 考 虑 增 加 11 型 (2) 菌 株 A116 和 A117, 间 隔 天 从 同 一 发 病 麻 鸭 场 分 离, 血 清 型 均 为 11 型, 致 病 性 没 有 差 异, 由 此 推 测 A117 应 该 是 A116 在 鸭 体 内 传 代 的 同 一 株 菌 两 株 菌 的 药 物 敏 感 性 略 有 不 同, 应 该 是 鸭 疫 里 默 氏 菌 在 体 内 传 代 后 的 变 化 间 隔 天, 菌 株 对 庆 大 霉 素 和 青 霉 素 由 敏 感 变 为 耐 药, 说 明 鸭 疫 里 默 氏 菌 在 体 [1] 内 传 代 次 即 产 生 了 耐 药 性 蔡 良 水 通 过 逐 级 提 高 TB 液 体 培 养 基 中 红 霉 素 和 氯 霉 素 的 浓 度 培 养 A, 经 过 大 约 代, 使 A 分 别 能 够 耐 受 16 μg/ml 的 红 霉 素 和 8 μg/ml 的 氯 霉 素, 并 使 A 获 得 了 稳 定 的 耐 药 [1] 性 遗 传 刘 颖 等 在 实 验 室 条 件 下, 用 含 一 定 浓 度 丁 胺 卡 那 霉 素 的 TB 液 体 在 96 孔 板 中 对 敏 感 鸭 疫 里 默 氏 菌 进 行 耐 药 性 诱 导,2 次 后, 对 丁 胺 卡 那 霉 素 敏 感 [1] 的 细 菌 产 生 了 耐 药 性 与 体 外 诱 导 相 比, 体 内 传 代 的 鸭 疫 里 默 氏 菌 更 容 易 产 生 耐 药 性 这 提 示 兽 医 人 员 在 临 诊 中 及 早 进 行 药 敏 试 验, 及 早 选 择 敏 感 药 物 进 行 治 疗, 才 能 避 免 耐 药 菌 株 的 产 生 参 考 文 献 [1] Y 塞 弗. 禽 病 学 []. 第 11 版 : 北 京 : 中 国 农 业 出 版 社,2: 767-77. [2] andhu T, Leister L. erotypes of Pasteurella anatipestifer isolates from poultry in different countries[j]. Avian Pathology,1991, 2(2):2-29. [] Loh H, Teo T P, Tan H C. erotypes of Pasteurella anatipestifer isolates from ducks in ingapore: a proposal of new serotypes[j]. Avian Pathology,1992,21():-9. [] Pathanasophon P, awada T, Tanticharoenyos T. New serotypes of iemerella anatipestifer isolated from ducks in Thailand[J]. Avian Pathology,199,2(1):19-199. [] 郭 玉 璞, 陈 德 威, 范 国 雄, 等. 北 京 鸭 传 染 性 浆 膜 炎 的 调 查 研 究 [J]. 畜
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