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1 中 国 农 学 通 报 2014,30(8):2935 Chinese Agricultural cience Bulletin 湖 北 江 苏 团 头 鲂 源 嗜 水 气 单 胞 菌 致 病 性 与 药 敏 特 性 研 究 陈 婷 婷 1, 杨 永 波 1 1,2, 杨 东 辉, 石 炎 1, 袁 改 玲 1, 罗 宇 良 1 1, 王 卫 民 ( 1 华 中 农 业 大 学 水 产 学 院 / 农 业 动 物 遗 传 育 种 与 繁 育 教 育 部 重 点 实 验 室 / 农 业 部 淡 水 生 物 繁 育 重 点 实 验 室, 武 汉 ; 2 信 阳 农 林 学 院 水 产 科 学 系, 河 南 信 阳 46400) 摘 要 : 对 湖 北 江 苏 两 省 的 8 个 团 头 鲂 主 养 区 分 离 的 嗜 水 气 单 胞 菌 的 致 病 性 和 药 敏 特 性 进 行 比 较, 分 析 不 同 地 区 嗜 水 气 单 胞 菌 在 致 病 力 和 耐 药 性 方 面 的 差 异 结 果 表 明 : 气 溶 素 基 因 (aer) 丝 氨 酸 蛋 白 酶 基 因 (ahp) 溶 血 素 基 因 (hly) 抗 金 属 蛋 白 酶 基 因 (ast) 肠 毒 素 基 因 (alt) 在 各 中 的 携 带 率 分 别 为 100%(8/8) 75%(6/8) 87.5%(7/8) 100%(8/8) 75%(6/8), 仅 分 别 缺 少 ahp alt 基 因 和 ahp hly alt 基 因 ;6 株 均 携 带 上 述 5 个 毒 力 基 因 的, 其 中 有 5 株 菌 的 溶 血 价 和 溶 蛋 白 效 价 均 达 到 最 高 的, 为, 和 分 别 是 和 1:32 和 ; 上 述 6 株 菌 的 LD 50 值 在 ~ cfu/ml 之 间, 和 的 LD 50 值 分 别 为 cfu/ml 和 cfu/ml; 不 同 地 区 的 嗜 水 气 单 胞 菌 对 孢 头 菌 素 类 氟 苯 尼 考 高 度 敏 感, 对 青 霉 素 类 高 度 不 敏 感, 对 氨 基 糖 苷 类 磺 胺 类 呈 现 一 定 程 度 的 耐 药 性 ; 江 苏 省 分 离 对 恩 诺 沙 星 四 环 素 的 耐 药 性 明 显 高 于 湖 北 省 的 分 离 株, 而 湖 北 省 分 离 株 对 新 生 霉 素 的 耐 药 性 要 高 于 江 苏 省 的 分 离 可 以 得 出, 不 同 地 区 的 致 病 力 没 有 显 著 差 异, 而 在 耐 药 性 方 面 呈 现 一 定 的 区 域 差 异 性 关 键 词 : 嗜 水 气 单 胞 菌 ; 毒 力 基 因 ; 致 病 力 ; 药 敏 特 性 中 图 分 类 号 :9 文 献 标 志 码 :A 论 文 编 号 : tudies on Pathogenicity and Drugresistance Characteristics of Aeromonas hydrophila solated from Megalobrama amblycephala in Hubei and Jiangsu Province Chen Tingting 1, Yang Yongbo 1, Yang Donghui 2, hi Yan 1, Yuan Gailing 1, Luo Yuliang 1, Wang Weimin 1 ( 1 College of Fishery, Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics, Breeding and eproduction of Ministry of Education/ Key Laboratory of Freshwater Animal Breeding, Ministry of Agriculture, Huazhong Agricultural University, Wuhan ; 2 Department of Fisheries cience, Xinyang College of Agriculture and Forestry, Xinyang Henan ) Abstract: Pathogenicity experiment and drug sensitivity characteristics of 8 Aeromonas hydrophila strains isolated from Megalobrama amblycephala collected in Jiangsu and Hubei Province were investigated. The results showed that presence of aer, ahp, hly, ast and alt virulence genes was 100%(8/8), 75%(6/8), 87.5%(7/8), 100% (8/8) and 75% (6/8) of tested strains, respectively. The strain has not observed ahp, alt genes and strain has not observed ahp, hly, alt genes. A total of 6 strains were recorded with all above virulence genes, among 5 strains the hemolytic and proteolytic were up to, and 1 strain the hemolytic and proteolytic were up to,, respectively. The hemolytic and proteolytic of and were, ; and 1:32,, respectively, which were lower than others. The LD 50 for M. amblycephala of the 6 strains were 基 金 项 目 : 现 代 农 业 产 业 技 术 体 系 建 设 专 项 团 头 鲂 种 质 资 源 与 育 种 (CA4605); 中 央 高 校 基 本 科 研 业 务 费 专 项 资 金 (2011PY023) 第 一 作 者 简 介 : 陈 婷 婷, 女,1989 年 出 生, 安 徽 黄 山 人, 硕 士 研 究 生, 研 究 方 向 : 鱼 类 遗 传 育 种 [email protected] 通 讯 作 者 : 王 卫 民, 男,1959 年 出 生, 湖 北 武 汉 人, 教 授, 博 士 生 导 师, 研 究 方 向 : 鱼 类 遗 传 育 种 通 信 地 址 : 湖 北 省 武 汉 市 洪 山 区 狮 子 山 街 一 号 华 中 农 业 大 学 水 产 学 院,Tel: , [email protected] 收 稿 日 期 : , 修 回 日 期 :

2 30 中 国 农 学 通 报 from to cfu/ml. The LD 50 of another 2 strains and was cfu/ml and cfu/ml, respectively. The 8 strains showed highly sensitive to fluoroquinolones, cephalosporins, resistant to penicillins, and certain extent resistance to aminoglycosides and sulfonamides. The strains isolated from Jiangsu Province showed more resistant than the strains isolated from Hubei Province to enrofloxacin and tetracycline. The strains isolated from Huhei Province showed more resistant than the strains obtained from Jiangsu Province to novobiocin. t suggested that the strains isolated in Hubei and Jiangsu Province were no significant differences in pathogenicity, while presented certain regional difference in drug resistance. Key words: A. hydrophila; virulence genes; pathogenicity; sensitivity test 0 引 言 嗜 水 气 单 胞 菌 (Aeromonas hydrophila) 引 起 的 细 菌 性 出 血 病 是 水 产 养 殖 过 程 中 危 害 最 为 严 重 的 细 菌 性 疾 [1] 病 之 一 国 内 外 已 有 大 量 研 究 证 实 嗜 水 气 单 胞 菌 的 [24] 致 病 性 与 其 产 生 的 毒 素 密 切 相 关 自 然 水 体 中 存 在 不 同 致 病 力 的 嗜 水 气 单 胞 菌, 可 分 为 强 毒 株 弱 毒 株 以 及 非 致 病 菌, 主 要 是 由 于 不 同 含 有 多 种 不 同 的 毒 [5] 力 基 因 型 大 量 研 究 表 明 气 溶 素 溶 血 素 丝 氨 酸 蛋 白 酶 金 属 蛋 白 酶 及 细 胞 毒 性 肠 毒 素 等 是 嗜 水 气 单 胞 菌 的 主 要 毒 力 基 因 研 究 不 同 的 主 要 毒 力 基 因 携 带 率 可 以 初 步 鉴 定 不 同 地 区 的 致 病 力 近 年 来, 由 于 抗 生 素 的 过 度 使 用, 病 原 菌 耐 药 性 现 象 越 来 越 明 [67] 显, 并 呈 现 出 多 重 耐 药 性 为 了 了 解 不 同 养 殖 地 区 团 头 鲂 (Megalobrama amblycephala) 源 嗜 水 气 单 胞 菌 致 病 力 和 耐 药 特 性, 本 研 究 对 湖 北 江 苏 两 省 共 8 个 团 头 鲂 主 养 地 区 的 分 离 进 行 了 检 测, 为 致 病 性 嗜 水 气 单 胞 菌 对 团 头 鲂 的 致 病 机 理 快 速 诊 断 防 治 提 供 基 础 资 料 1 实 验 材 料 及 方 法 1.1 实 验 材 料 : 在 湖 北 江 苏 等 8 个 主 养 团 头 鲂 地 区 于 爆 发 了 细 菌 性 败 血 症 的 池 塘, 从 病 症 明 显 的 团 头 鲂 的 肝 脾 肾 肠 道 等 组 织 和 腹 水 中, 以 平 板 划 线 培 养, 挑 取 优 势 单 菌 落 的 纯 化 方 法, 初 步 分 离 出 一 批, 然 后 再 通 过 生 化 实 验 和 基 因 序 列 比 对 进 行 鉴 定, 统 一 选 取 了 来 自 不 同 地 区 病 鱼 肾 脏 的 株 菌 共 8 株 ( 表 1) 进 行 分 析 研 究 1.2 的 鉴 定 生 化 试 验 参 考 致 病 性 嗜 水 气 单 胞 菌 鉴 定 方 法 的 [8] 国 家 标 准, 进 行 氧 化 酶 试 验 吲 哚 试 验 革 兰 氏 染 色 试 验 葡 萄 糖 蔗 糖 阿 拉 伯 糖 七 叶 苷 及 水 杨 苷 等 糖 类 发 酵 试 验 rna 基 因 序 列 检 测 采 用 酚 氯 仿 法 提 取 菌 株 DNA [9], 参 考 嗜 水 气 单 胞 菌 rna 基 因 的 特 异 性 [10] 引 物, 由 上 海 生 工 股 份 有 限 公 司 进 行 引 物 合 成, 引 物 序 列 见 表 2 利 用 PC 技 术 扩 增 rna 基 因 序 列, 进 行 1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳, 送 华 大 基 因 公 司 进 行 测 序, 所 测 序 列 在 NCB 中 利 用 Blast 软 件 与 GenBank 基 因 库 中 已 知 的 嗜 水 气 单 胞 菌 rna 序 列 进 行 同 源 性 分 析 动 物 感 染 实 验 用 0.65% 的 无 菌 生 理 盐 水 将 28 恒 温 培 养 24 h 的 菌 苔 稀 释 成 10 6 cfu/ml, 对 健 康 的 1 龄 团 头 鲂 进 行 腹 腔 注 射 0.1 ml/ 尾, 对 照 组 注 射 等 量 的 生 理 盐 水, 将 各 组 鱼 分 别 置 于 水 族 箱 中 观 察, 记 录 结 果, 并 从 出 现 病 症 的 实 验 鱼 体 内 再 次 分 离, 进 行 鉴 定 1.3 毒 力 基 因 的 分 布 表 1 株 菌 的 来 源 来 源 江 苏 无 锡 江 苏 常 州 江 苏 常 州 湖 北 五 湖 湖 北 东 西 湖 湖 北 阳 新 湖 北 鄂 州 湖 北 仙 桃 注 : 团 头 鲂 : 健 康 1 团 头 鲂 来 自 湖 北 鄂 州 团 头 鲂 良 种 场, 体 重 约 为 (100±10) g; 主 要 试 剂 : 生 化 试 管 和 药 敏 纸 片 均 来 自 杭 州 微 生 物 试 剂 有 限 公 司 检 测 嗜 水 气 单 胞 菌 5 种 主 要 毒 力 基 因 (aer ahp hly ast art) 的 分 布 情 况 根 据 已 有 文 献 中 设 计 的 相 关 [11] 引 物 进 行 引 物 合 成 引 物 序 列 退 火 温 度 及 扩 增 片 段 大 小 见 表 2 利 用 PC 技 术 对 以 上 5 种 基 因 进 行 扩 增, 采 用 25 μl 体 系 :Buffer,2.5 μl;dntp( 含 Mg 2 ) 2 μl; 引 物 (20 μmol/l) 各 1 μl; 模 板 DNA 1 μl;taq 酶 0.2 μl 加 超 纯 水 至 25 μl 扩 增 程 序 为 :94 预 变 性 5 min;94 30 s,60 (aera) 或 62 (hlya) 或 55 (ahpa) 或 57 (ast) 或 58 (art)30 s,72 30 s,35 个 循 环 ;72 延 伸 10 min 反 应 结 束 后 进 行 1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检

3 陈 婷 婷 等 : 湖 北 江 苏 团 头 鲂 源 嗜 水 气 单 胞 菌 致 病 性 与 药 敏 特 性 研 究 31 表 2 rna 基 因 和 5 种 主 要 毒 力 基 因 PC 扩 增 引 物 序 列 基 因 名 称 引 物 序 列 (5'3 ' ) 退 火 温 度 / 预 计 扩 增 片 段 长 度 /bp rna 基 因 GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA CGTGCTGGCAACAAAGGACAG 气 容 素 基 因 CAAGAACAAGTTCAAGTGGCCA ACGAAGCTGTGGTTCCAGT 溶 血 素 基 因 GGCCGGTGGCCCAAGATACGGG GGCGGCGCCGGACGAGACGGGG 丝 氨 酸 蛋 白 酶 基 因 ATTGGATCCCTGCCTATCGCTTCAGTTCA GCTAAGCTTGCATCCGTGCCGTATTCC 肠 毒 素 基 因 TGACCCAGTCCTGGCACGGC GGTGATCGATCACCACCAGC 抗 金 属 蛋 白 酶 基 因 ATCGTCAGCGACAGCTTCTT CTCATCCCTTGGCTTGTTGT 验, 对 扩 增 条 带 符 合 目 的 基 因 片 段 大 小 的 扩 增 结 果 进 行 测 序, 并 与 目 的 基 因 序 列 比 对 分 析 1.4 溶 血 价 及 溶 蛋 白 效 价 的 比 较 采 用 LB 液 体 培 养 基 对 嗜 水 气 单 胞 菌 进 行 摇 床 28 恒 温 培 养 48 h, 比 较 不 同 培 养 上 清 的 溶 血 价 和 溶 蛋 白 效 价 细 菌 培 养 物 经 r/min 离 心 15 min, 收 集 上 清, 并 用 孔 径 为 0.22 μm 的 无 菌 滤 器 过 滤, 在 96 孔 微 量 板 中 加 入 0.65% 的 无 菌 生 理 盐 水 进 行 2 倍 倍 比 稀 释, 现 配 现 用 溶 血 价 将 30 μl 倍 比 稀 释 的 培 养 上 清 加 至 96 孔 微 量 板 内, 分 别 加 等 量 的 1% 的 团 头 鲂 血 细 胞, 轻 微 振 荡 均 匀,37 恒 温 作 用 1 h, 置 4 冰 箱 过 夜, 显 微 镜 下 观 察, 以 使 50% 的 红 细 胞 溶 解 的 毒 素 最 高 稀 释 度 为 其 溶 血 价 每 个 设 3 个 重 复, 同 时 以 无 菌 生 理 盐 水 作 为 空 白 对 照 1% 团 头 鲂 血 细 胞 的 制 备 过 程 : 用 抗 凝 剂 肝 素 钠 溶 液 润 洗 的 注 射 器 抽 取 3~5 ml 团 头 鲂 血 液,3000 r/min 离 心 10 min, 弃 上 清, 再 用 10 倍 的 0.65% 生 理 盐 水 洗 涤 3 次, 取 沉 淀 的 红 细 胞 制 成 1% 的 悬 液, 于 4 保 存 备 用 溶 蛋 白 效 价 在 1.5% 脱 脂 乳 平 板 上 打 孔, 孔 径 5 mm 每 孔 加 入 30 μl 倍 比 稀 释 的 培 养 上 清,37 温 箱 作 用 24 h, 以 产 生 溶 蛋 白 圈 的 最 高 稀 释 度 作 为 溶 蛋 白 效 价 每 个 设 3 个 重 复, 同 时 以 无 菌 生 理 盐 水 作 为 空 白 对 照 1.5 致 病 力 的 测 定 将 培 养 过 夜 的 8 株 菌 用 0.65% 无 菌 生 理 盐 水 洗 脱 斜 面 上 的 菌 苔, 每 株 菌 分 别 稀 释 成 10 5 ~10 9 cfu/ml 5 个 等 比 浓 度 梯 度 的 菌 悬 液, 将 实 验 团 头 鲂 随 机 分 成 41 组, 每 组 20 尾, 采 用 腹 腔 注 射 法,0.1 ml/ 每 尾, 对 照 组 注 射 等 量 无 菌 生 理 盐 水, 分 别 放 入 直 径 100 cm, 水 深 60 cm 的 水 族 箱 试 验 水 温 (26±2),pH 7.6 观 察 1 周, 每 日 观 察 3 次, 记 录 死 亡 数 并 移 出 死 鱼 根 据 [13] eedmueneh 法 计 算 8 株 菌 96 h 的 半 数 致 死 浓 度 LD 药 敏 特 性 的 研 究 挑 选 了 25 种 常 用 抗 生 素 对 8 株 菌 进 行 药 敏 试 验 挑 取 致 病 菌 接 种 于 5 ml LB 液 体 培 养 基 中,28 摇 床 培 养 过 夜, 用 无 菌 生 理 盐 水 调 整 至 10 6 cfu/ml, 然 后 吸 取 0.1 ml 滴 入 LB 琼 脂 平 板 涂 布 均 匀, 将 药 敏 纸 片 平 贴 于 其 上, 每 种 药 设 3 个 平 行,28 培 养 过 夜, 以 抑 菌 环 直 径 的 大 小 判 定 结 果, 检 测 标 准 参 考 [14] 2 结 果 与 分 析 2.1 病 原 菌 的 鉴 定 生 理 生 化 特 性 各 生 化 反 应 结 果 :AHM 革 兰 氏 染 色 VP 试 验 吲 哚 试 验 氧 化 酶 甘 露 醇 水 杨 素 七 叶 苷 阿 拉 伯 糖 蔗 糖 葡 萄 糖 乳 糖 与 致 病 性 嗜 水 气 单 胞 菌 鉴 定 方 法 的 国 家 标 准 相 一 致 rna 基 因 扩 增 结 果 各 PC 扩 增 结 果 经 1% 凝 胶 电 泳 得 到 和 预 期 条 带 大 小 一 致 的 基 因 片 段, 测 序 结 果 与 GenBank 基 因 库 中 已 知 的 嗜 水 气 单 胞 菌 rna 序 列 进 行 同 源 性 比 对,8 株 菌 与 嗜 水 气 单 胞 菌 rna 基 因 序 列 的 相 似 率 均 在 98% 以 上, 结 合 菌 落 形 态 和 生 化 反 应 特 征, 确 定 为 嗜 水 气 单 胞 菌 动 物 感 染 试 验 团 头 鲂 感 染 试 验 结 果 显 示, 注 射 菌 液 约 5 h 后 部 分 实 验 鱼 出 现 不 适 反 应, 并 开 始 死 亡, 3 天 后 在 病 鱼 的 内 脏 中 再 次 分 离 到, 经 鉴 定 确 定 为 嗜 水 气 单 胞 菌

4 32 中 国 农 学 通 报 毒 力 基 因 的 分 布 PC 扩 增 结 果 8 株 嗜 水 气 单 胞 菌 的 5 个 毒 力 基 因 经 PC 扩 增, 通 过 1% 的 凝 胶 电 泳 获 得 和 预 期 片 段 大 小 吻 合 的 条 带, PC 扩 增 结 果 见 图 1, 毒 力 基 因 的 分 布 见 表 毒 力 基 因 序 列 分 析 对 毒 力 基 因 PC 扩 增 结 果 进 行 测 序, 结 果 与 目 的 基 因 相 似 率 均 在 97% 以 上, 确 定 所 获 得 的 基 因 即 为 目 的 基 因 A B C D E (1,2,3,4,5,6,7,8 分 别 为 J1 J4 J7 HB3 HB7 HB10 HB13 HB15 ) 图 1 8 株 A. hydrophila ahp (A) ast(b) aer (C) hly (D) 以 及 alt(e) 基 因 的 PC 扩 增 结 果 表 3 5 种 毒 力 基 因 在 8 株 嗜 水 气 单 胞 菌 中 的 分 布 毒 力 基 因 检 测 aer ahp hly alt ast 注 : 为 阳 性 ; 为 阴 性 2.3 溶 血 价 和 溶 蛋 白 效 价 各 的 培 养 上 清 稀 释 液 对 团 头 鲂 红 细 胞 的 溶 血 价 和 溶 蛋 白 效 价 的 测 定 结 果 见 表 4 结 果 显 示 :8 株 菌 均 具 有 溶 血 和 溶 蛋 白 特 性, 有 5 株 菌 的 溶 血 价 和 溶 蛋 白 效 价 均 达 到 了, 为, 和 的 溶 血 价 和 溶 蛋 白 效 价 分 别 为, 为 1:32 和 2.4 致 病 力 的 测 定 结 果 根 据 eedmueneh 法, 计 算 得 出 等 6 株 菌 96 h 的 半 致 死 剂 量 LD 50 值 依 次 在 ~ cuf/ml 之 间, 有 毒 力 基 因 缺 失 的 为 cfu/ml 为 cfu/ml 可 以 看 出 的 致 病 力 与 其 毒 力 基 因 的 分 布 具 有 一 定 的 关 系, 见 表 药 敏 特 性 8 株 嗜 水 气 单 胞 菌 表 现 出 较 一 致 的 敏 感 性 : 对 青 霉 素 类 耐 药 性 高 达 100% 对 氨 基 糖 苷 类 氟 喹 诺 酮 类 磺 胺 类 四 环 素 类 等 呈 现 不 同 程 度 的 敏 感 性, 多 数 耐 药 都 具 有 多 重 耐 药 性 对 孢 头 菌 素 类 药 物 以 及 氟 苯 尼 考 阿 米 卡 星 高 度 敏 感, 没 有 耐 药 结 果 见 表 5 江 苏 湖 北 两 省 的 对 检 测 的 25 种 抗 生 素 的 敏 感 性 和 耐 药 性 除, 其 他 7 株 菌 差 异 不 明 显, 对 药 物 的 耐 药 性 显 著 高 于 其 他 从 表 5 中 还 可 以 看 出 两 省 对 恩 诺 沙 星 四 环 素 新 生 霉 素 的 药 敏 反 应 表 现 出 明 显 的 差 异 江 苏 省 分 离 的 对 恩 诺 沙 星 四 环 素 均 不 敏 感, 而 湖 北 省 分 离 的 5 株 菌 均 对 恩 诺 沙 星 表 现 敏 感, 有 4 株 对 于 四 环 素 表 现 敏 感, 江 苏 省 有 2 株 菌 对 新 生 霉 素 敏 感,1 株 中 度 敏 感, 而 湖 北 省 分 离 的 5 株 菌 均 表 现 为 中 度 敏 感

5 陈 婷 婷 等 : 湖 北 江 苏 团 头 鲂 源 嗜 水 气 单 胞 菌 致 病 性 与 药 敏 特 性 研 究 33 表 4 8 株 嗜 水 气 单 胞 菌 对 团 头 鲂 致 病 力 与 基 因 分 布 溶 血 和 溶 蛋 白 效 价 之 间 的 关 系 aer ahp 毒 力 基 因 型 hly alt ast 溶 血 价 溶 蛋 白 效 价 LD50/(cfu/mL) : 注 : 为 阳 性 ; 为 阴 性 表 5 8 株 菌 的 药 敏 试 验 统 计 结 果 抗 菌 药 物 纸 片 青 霉 素 /(10 U/ 片 ) 阿 莫 西 林 /(10 μg/ 片 ) 氨 苄 西 林 /(10 μg/ 片 ) 头 孢 噻 肟 /(30 μg/ 片 ) 头 孢 曲 松 /(30μg/ 片 ) 头 孢 他 啶 /(30 μg/ 片 ) 头 孢 吡 肟 /(30 μg/ 片 ) 先 锋 霉 素 V/(30 μg/ 片 ) 新 霉 素 /(30 μg/ 片 ) 卡 那 霉 素 /(30 μg/ 片 ) 大 庆 霉 素 /(30 μg/ 片 ) 阿 米 卡 星 /(30 μg/ 片 ) 恩 诺 沙 星 /(5 μg/ 片 ) 诺 氟 沙 星 /(10 μg/ 片 ) 环 丙 氟 哌 酸 /(5 μg/ 片 ) 左 氧 氟 沙 星 /(5 μg/ 片 ) 氧 氟 沙 星 /(4 μg/ 片 ) 磺 胺 异 噁 唑 /(300 μg/ 片 ) 四 环 素 /(30 μg/ 片 ) 强 力 霉 素 /(30 μg/ 片 ) 新 生 霉 素 /(30μg/ 片 ) 红 霉 素 /(15 μg/ 片 ) 阿 奇 霉 素 /(15 μg/ 片 ) 利 福 平 /(5 μg/ 片 ) 氟 苯 尼 考 /(75 μg/ 片 ) 耐 药 率 /% 中 度 敏 感 率 /% 敏 感 率 /% 注 :: 耐 药 性 ;: 中 度 敏 感 性 ;: 敏 感 性

6 34 中 国 农 学 通 报 3 结 论 研 究 结 果 表 明 : 从 患 病 团 头 鲂 体 内 分 离 的 8 株 致 病 菌, 有 6 株 菌 均 携 带 所 检 测 的 5 种 毒 力 基 因, 湖 北 省 另 有 两 株 分 离 菌 和 分 别 缺 失 部 分 毒 力 基 因 根 据 溶 血 溶 蛋 白 的 效 果 以 及 LD 50 的 实 验 结 果, 可 以 发 现 : 和 的 致 病 力 相 对 于 其 他 6 株 菌 有 所 减 弱, 但 仍 具 有 较 强 致 病 力, 且 的 致 病 力 比 稍 强 初 步 证 实 了 嗜 水 气 单 胞 菌 的 毒 力 因 子 与 其 致 病 性 具 有 显 著 相 关 性 ; 湖 北 江 苏 两 省 分 离 株 的 致 病 性 无 明 显 区 域 性 差 异 本 研 究 中 的 8 株 菌 对 1 龄 团 头 鲂 的 半 致 死 浓 度 LD 50 与 相 关 研 究 相 比 较 低, 表 明 所 分 离 的 致 病 力 更 强, 这 可 能 与 分 离 均 来 自 正 在 爆 发 细 菌 性 出 血 病 的 患 病 鱼 体 有 关 进 而 可 以 推 断 除 了 毒 力 基 因 的 分 布 情 况, 还 有 其 他 一 些 因 素 对 致 病 力 具 有 重 要 作 用, 例 如 毒 力 基 因 的 表 达 量 水 平 [15] 药 敏 试 验 结 果 显 示 :8 株 菌 表 现 出 较 为 一 致 的 药 敏 特 性, 但 是 对 个 别 抗 菌 药 物 呈 现 出 了 区 域 差 异 性 : 江 苏 省 分 离 菌 对 恩 诺 沙 星 四 环 素 的 耐 药 程 度 比 湖 北 省 分 离 菌 严 重 ; 江 苏 省 的 分 离 株 对 新 生 霉 素 敏 感 率 高, 而 湖 北 省 的 分 离 株 对 新 生 霉 素 则 呈 现 了 一 定 的 耐 药 趋 势 原 因 可 能 是 不 同 地 区 在 药 物 防 治 过 程 中 用 药 的 差 异 造 成 病 原 菌 产 生 了 适 应 性 耐 药 现 象 的 耐 药 率 显 著 高 于 其 他 7 株 菌, 可 能 与 当 地 长 期 用 药 有 关, 其 原 因 还 有 待 进 一 步 研 究 本 研 究 的 药 敏 结 果 与 相 关 研 究 相 比 [8,], 耐 药 程 度 相 对 较 低, 可 能 与 养 殖 环 境 的 恶 劣 程 度 和 对 抗 菌 药 的 依 赖 程 度 有 关 本 研 究 为 湖 北 江 苏 两 地 嗜 水 气 单 胞 菌 今 后 的 药 物 防 治 的 选 择, 避 免 产 生 更 严 重 的 耐 药 性 提 供 了 参 考 4 讨 论 目 前 普 遍 认 为 嗜 水 气 单 胞 菌 的 致 病 性 与 其 多 种 毒 力 因 子 特 别 是 胞 外 产 物 密 切 相 关, 其 中 胞 外 毒 素 和 酶 类 如 :aer [17] ahp [18] hly [19] alt [20] 是 重 要 的 毒 力 因 子 所 检 测 的 5 中 毒 力 基 因 在 致 病 性 嗜 水 气 单 胞 菌 中 分 布 广 [11] [] 泛, 朱 大 玲 付 巧 芳 等 认 为, 对 致 病 力 最 具 影 响 的 毒 力 基 因 是 aer 和 ahp, 而 hly 与 致 病 性 无 相 关 性 ; 王 春 [21] 林 等 的 研 究 表 明 胞 外 蛋 白 酶 ( 主 要 包 括 丝 氨 酸 蛋 白 酶 ) 对 嗜 水 气 单 胞 菌 的 致 病 性 具 有 重 要 影 响 本 研 究 中,8 株 菌 均 携 带 aer 基 因, 且 都 表 现 出 致 病 性, 有 部 分 缺 失 ahp hly alt, 致 病 力 也 有 所 减 弱, 与 已 有 研 究 结 果 相 符 对 不 同 种 类 的 抗 菌 药 物,8 株 菌 具 有 基 本 一 致 的 敏 感 性, 对 青 霉 素 类 的 耐 药 率 达 到 100%, 对 氟 苯 尼 考 头 孢 菌 素 类 ( 除 第 一 代 ) 高 度 敏 感, 对 氨 基 糖 苷 类 磺 胺 [6] [22] 类 药 物 均 呈 现 一 定 程 度 的 耐 药 性, 与 蔡 丽 娟 刘 亚 楠 [23] 等 的 研 究 结 果 基 本 一 致 Ansary 等 发 现, 嗜 水 气 单 胞 菌 对 青 霉 素 类 药 物 具 有 的 耐 药 性 是 一 种 固 有 耐 药 性, 具 有 稳 定 遗 传 特 性, 其 产 生 并 不 是 因 为 抗 菌 药 物 的 使 用 而 大 多 数 的 耐 药 性 属 于 获 得 性 耐 药 性, 主 要 有 [24] [25] [26] 基 因 突 变 质 粒 介 导 细 胞 膜 渗 透 性 改 变 等 嗜 水 气 单 胞 菌 获 得 性 耐 药 性 现 象 日 趋 明 显, 主 要 与 水 产 养 殖 中 过 度 依 赖 抗 生 素 有 关 江 苏 湖 北 两 省 的 分 离 株 在 耐 药 性 方 面 对 个 别 药 物 表 现 出 的 差 异 性, 可 能 是 由 于 不 同 抗 菌 药 物 的 选 择 及 用 量 的 差 异 江 苏 省 的 分 离 株 对 恩 诺 沙 星 的 高 度 耐 药 与 当 地 在 养 殖 中 长 期 使 用 恩 诺 沙 星 进 行 病 害 防 治 具 有 明 显 的 关 联 性 而 在 湖 北 省, 使 用 恩 诺 沙 星 进 行 治 疗 时 取 得 了 一 定 的 效 果 实 验 结 果 与 实 地 考 察 结 果 基 本 符 合 为 了 最 大 程 度 取 益 于 抗 生 素 最 小 程 度 推 进 其 耐 药 性, 可 以 对 所 用 抗 生 素 进 行 复 试, 或 者 将 抗 生 素 交 替 使 用, 来 减 少 耐 药 性 的 产 生 参 考 文 献 [1] 王 春 瑞. 嗜 水 气 单 胞 菌 的 分 子 流 行 病 学 调 查 及 其 两 种 分 型 方 法 的 研 究 [D]. 宁 波 : 宁 波 大 学,2011:158. [2] Howard P, Garland W J, Green M J, et al. Nucleotide sequence of the gene for the hole forming toxin aerolysin of Aeromonas hydrophila[j]. J Bacteriol,1987,9: [3] 陈 怀 青, 陆 承 平, 陈 琼, 等. 用 点 酶 法 检 测 鱼 类 致 病 性 嗜 水 气 单 胞 菌 HEC 毒 素 [J]. 动 物 检 疫,1993,10:6062. [4] Hirono, Aoki T. Nucleotide sequence and expression of an extracellular hemolysingene of Aeromonas hydrophila[j]. Microb Pathog,1991,11: [5] Hu M, Wang N, Pan Z H, et al. dentity and virulence properties of Aeromonas isolatesfrom diseased fish, healthy controls and waterenvironment in China[J]..Applied Microbiology,20(55): [6] 蔡 丽 娟, 许 宝 青, 林 启 存. 产 致 病 性 嗜 水 气 单 胞 菌 耐 药 性 比 较 与 分 析 [J]. 水 产 科 学,2011,30(1):4245. [7] Vivekanandhan G, avithamani K, Hatha A A M, et al. Antibiotic resistance of Aeromorras hydrophila isolated form marketed fish and prawn of outh ndia[j].nternational Journal of Food Microbiology,2002,76(1/2):58. [8] 南 京 农 业 大 学 动 物 医 学 院.GB/T 致 病 性 嗜 水 气 单 胞 菌 检 验 方 法 []. 北 京 : 中 国 标 准 出 版 社,2002. [9] ambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning: alaboratory manual [M]. Cold pring Harbor Laboratory Press,1989, [10] 储 卫 华, 陆 承 平.PC 扩 增 特 异 性 rdna 和 溶 血 素 基 因 检 测 致 病 性 嗜 水 气 单 胞 菌 [J]. 水 产 学 报,2005,29(1):7982. [11] 朱 大 玲, 李 爱 华, 汪 建 国, 等. 嗜 水 气 单 胞 菌 毒 力 与 毒 力 基 因 分 布 的 相 关 性 [J]. 中 山 大 学 学 报,2006,45(1):8285. [] 付 乔 芳, 邱 军 强, 胡 鲲, 等. 嗜 水 气 单 胞 菌 国 内 分 离 株 的 毒 力 因 子 分 布 与 致 病 性 相 关 性 分 析 [J]. 生 物 学 杂 志,2011,28(6):5357.

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