Microsoft Word - 杨书尧.doc

Transcription

1 第 30 卷 第 3 期 2015 年 6 月 天 津 科 技 大 学 学 报 Journal of Tianjin University of Science & Technology Vol. 30 No. 3 Jun DOI: /j.issn 过 表 达 PNP 对 肌 苷 生 产 菌 合 成 利 巴 韦 林 的 影 响 杨 书 尧, 刘 莉, 马 跃 超, 陈 宁, 谢 希 贤 ( 代 谢 控 制 发 酵 技 术 国 家 地 方 联 合 工 程 实 验 室, 天 津 科 技 大 学 生 物 工 程 学 院, 天 津 ) 摘 要 : 采 用 PCR 技 术 从 枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bacillus subtilis)168 基 因 组 DNA 中 扩 增 其 编 码 嘌 呤 核 苷 磷 酸 化 酶 (purine nucleoside phosphorylase,pnp) 的 两 个 基 因 deod(pnp 702 ) 和 pupg(pnp 816 ). 以 肌 苷 生 产 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 (B.,subtilis) Q60 为 出 发 菌 株, 分 别 采 用 胞 内 与 胞 外 分 泌 过 表 达 PNP 的 方 式 构 建 4 株 重 组 菌 株, 通 过 外 源 添 加 底 物 1,2,4 三 氮 唑 3 羧 氨 酰 (TCA) 的 方 式 直 接 合 成 利 巴 韦 林. 摇 瓶 发 酵 数 据 显 示, 胞 内 过 表 达 PNP 702 和 PNP 816 的 利 巴 韦 林 产 量 分 别 为 (8.33±0.57),g/L 和 (11.00±0.38),g/L. 胞 外 分 泌 过 表 达 PNP 702 和 PNP 816 的 利 巴 韦 林 产 量 分 别 为 (9.06±0.17),g/L 和 (12.67±0.60),g/L.PNP 816 的 催 化 效 率 高 于 PNP 702, 胞 外 分 泌 过 表 达 比 胞 内 过 表 达 高, 其 中 胞 外 分 泌 过 表 达 PNP 816 重 组 菌 Q60/pBSApupG 最 高, 比 出 发 菌 (2.02±0.72),g/L 提 高 了 5.3 倍. 关 键 词 : 利 巴 韦 林 ; 肌 苷 ; 嘌 呤 核 苷 磷 酸 化 酶 ; 发 酵 中 图 分 类 号 :Q812 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 : (2015) Effect of Overexpression of Purine Nucleoside Phosphorylase on Ribavirin Production from Inosine Producing Strain YANG Shuyao,LIU Li,MA Yuechao,CHEN Ning,XIE Xixian (National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology,College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology,Tianjin ,China) Abstract:Purine nucleoside phosphorylase(pnp)genes deod(pnp 702 )and pupg(pnp 816 )were amplified from Bacillus subtilis 168,genome through polymerase chain reaction. Inosine producing strain B.,subtilis Q60,was used as the starting strain. Four recombined strains were constructed by overexpression of intracellular and extracellular secretion of PNP. By adding 1,H-1,2,4-triazole-3-carboxamide(TCA)into the culture medium,the recombined strains could be used for ribavirin synthesis. The results showed that the production of ribavirin through intracellular overexpression of PNP 702, and PNP 816 of the recombined strains was (8.33±0.57) g/l and (11.00±0.38) g/l,and that from the extracellular secretion overexpression of PNP 702 and PNP 816 of the recombined strains was (9.06±0.17) g/l and (12.67±0.60) g/l. The catalytic efficiency of PNP 816 was higher than that of PNP 702,and extracellular secretion was better than intracellular overexpression. The titer of ribavirin of Q60/pBSApupG,in which PNP 816 was overexpressed extracellularly,was up to (12.67±0.60) g/l,resulting in a 5.3 folds enhancement compared with the control strain. Key words:ribavirin;inosine;purine nucleoside phosphorylase;fermentation 利 巴 韦 林, 化 学 名 1 β D 呋 喃 核 糖 基 1,H 1, 2,4 三 氮 唑 3 羧 氨 酰, 又 名 病 毒 唑, 是 一 种 高 效 广 谱 的 核 苷 类 抗 病 毒 药 物, 对 多 种 DNA 和 RNA 病 毒 均 有 较 好 的 抑 制 作 用 [1]. 利 巴 韦 林 的 生 产 方 法 有 化 学 合 成 法 酶 催 化 法 和 微 生 物 发 酵 法. 目 前 化 学 合 成 法 是 合 成 利 巴 韦 林 的 主 要 生 产 方 法, 但 是 化 学 合 成 法 步 骤 繁 琐 条 件 苛 刻. 酶 催 化 法 主 要 是 利 用 嘌 呤 核 苷 磷 酸 化 酶 (PNP) 催 化 底 物 核 苷 或 D 核 糖 1 磷 酸 酯 与 1,2,4 三 氮 唑 3 羧 氨 酰 (TCA) 反 应, 直 接 合 成 利 巴 韦 林 [2]. 虽 然 酶 催 化 法 可 以 简 化 反 应 步 骤 条 件 简 收 稿 日 期 : ; 修 回 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 ( ) 作 者 简 介 : 杨 书 尧 (1988 ), 女, 天 津 人, 硕 士 研 究 生 ; 通 信 作 者 : 谢 希 贤, 副 教 授,[email protected].

2 2015 年 6 月 杨 书 尧, 等 : 过 表 达 PNP 对 肌 苷 生 产 菌 合 成 利 巴 韦 林 的 影 响 15 单, 但 诱 导 剂 的 添 加 提 高 了 生 产 成 本 且 不 利 于 后 续 的 分 离 纯 化. 发 酵 法 合 成 利 巴 韦 林 原 料 简 单 污 染 小, [3] 具 有 工 业 化 生 产 的 潜 力. 古 屋 晃 等 利 用 产 核 苷 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 属 和 短 杆 菌 属 的 微 生 物 进 行 发 酵 培 养 积 [4] 累 利 巴 韦 林, 但 利 巴 韦 林 产 量 小 于 1,g/L. 武 改 红 等 以 鸟 苷 产 生 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 TM903 为 供 试 菌, 在 5,L 发 酵 罐 发 酵 60,h 积 累 利 巴 韦 林 5.86,g/L. 谢 希 贤 [5] 等 利 用 枯 草 芽 孢 杆 菌 TM903 和 谷 氨 酸 棒 杆 菌 TL1105 进 行 发 酵 罐 混 菌 发 酵, 采 用 变 温 控 制 模 式 和 分 阶 段 供 氧 控 制 模 式 发 酵 60,h, 利 巴 韦 林 产 量 达 到 5.96,g/L. PNP 是 嘌 呤 核 苷 补 救 合 成 途 径 的 关 键 酶 之 一, 该 酶 的 主 要 功 能 是 催 化 核 苷 分 解 为 核 糖 1 磷 酸 和 相 应 的 嘌 呤 碱 基. 在 体 外 反 应 时, 若 加 入 另 外 一 种 嘌 呤 碱 基 或 其 类 似 物, 可 以 合 成 新 的 嘌 呤 核 苷 或 其 类 似 物, 现 已 广 泛 用 于 酶 催 化 法 生 产 核 苷 类 抗 病 毒 药 物 [6]. [7] Bzowska 等 根 据 PNP 底 物 专 一 性 和 相 对 分 子 质 量 大 小 的 不 同 将 PNP 分 为 低 相 对 分 子 质 量 同 源 三 聚 体 类 和 高 相 对 分 子 质 量 同 源 六 聚 体 类. 某 些 微 生 物 会 同 时 存 在 两 种 聚 体 的 PNP, 如 枯 草 芽 孢 杆 菌. 影 响 发 酵 法 合 成 利 巴 韦 林 的 主 要 因 素 是 前 体 物 核 苷 和 PNP. 理 论 上 嘌 呤 核 苷 和 嘧 啶 核 苷 都 可 作 为 利 巴 韦 林 的 合 成 前 体, 但 综 考 虑 生 产 成 本 与 PNP 的 催 化 效 率, 嘌 呤 核 苷 更 合 适. 研 究 表 明, 肌 苷 是 PNP 的 最 适 底 物 [8]. 本 文 以 肌 苷 生 产 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 B.,subtilis Q60 为 出 发 菌, 通 过 基 因 工 程 技 术 提 高 PNP 的 表 达 量, 比 较 了 两 种 PNP 的 催 化 效 率. 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 菌 种 质 粒 和 培 养 基 肌 苷 生 产 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 (B.,subtilis)Q60 枯 草 芽 孢 杆 菌 (B.,subtilis)168 大 肠 杆 菌 (E.,coli)DH5 和 质 粒 pbe43( 大 肠 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 穿 梭 质 粒, 含 有 P43 启 动 子 ) pbsa43( 大 肠 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 穿 梭 质 粒, 含 有 P43 启 动 子 和 sacb 基 因 信 号 肽 ) pwb980 ( 枯 草 芽 孢 杆 菌 质 粒, 含 有 P43 启 动 子 和 sacb 信 号 肽 ) 均 为 本 实 验 室 保 藏. 活 化 斜 面 培 养 基 (g/l): 葡 萄 糖 1, 蛋 白 胨 10, 牛 肉 膏 10, 酵 母 膏 5,NaCl 2.5, 琼 脂 20,pH 7.0~7.2. 种 子 培 养 基 (g/l): 葡 萄 糖 20, 蛋 白 胨 10, 酵 母 浸 膏 15, 玉 米 浆 12,NaCl 2.5, 尿 素 2,pH 7.0~7.2. 发 酵 培 养 基 (g/l): 葡 萄 糖 140( 单 独 灭 菌 ), 玉 米 浆 16, 酵 母 粉 15,(NH 4 ) 2 SO 4,22,MgSO 4 7H 2 O,5, KH 2 PO 4,5,CaCO 3 20,pH 7.0~ 试 剂 及 仪 器 限 制 性 内 切 酶 Kpn Ⅰ Sal Ⅰ 和 Xho Ⅰ, Fermentas 公 司 ;Solution Ⅰ Taq DNA 聚 合 酶 1,kbp DNA Ladder, 大 连 宝 生 物 工 程 有 限 公 司 ; 普 通 琼 脂 糖 凝 胶 DNA 回 收 试 剂 盒 质 粒 小 量 提 取 试 剂 盒, 天 津 为 科 生 物 有 限 公 司 ;TCA, 纯 度 99%, 山 东 阳 成 生 物 科 技 有 限 公 司 ; 其 他 试 剂 为 国 产 分 析 纯 试 剂. PCR 仪,Bio-Rad 公 司 ;SBA 40C 型 生 物 传 感 仪, 山 东 生 物 科 学 研 究 所.DNA 序 列 分 析 比 较 采 用 DNAMAN 2.0 软 件, 引 物 设 计 采 用 Primer Premier 5 软 件, 电 泳 图 分 析 采 用 Image master Total Lab v1.00 软 件. 1.2 实 验 方 法 过 表 达 PNP 质 粒 的 构 建 根 据 B.,subtilis 168 的 deod 的 基 因 序 列 (Gene ID:940038) 和 pupg 的 基 因 序 列 (Gene ID:938731) 设 计 引 物, 见 表 1.PCR 反 应 体 系 : 首 先 94, 预 变 性 3,min, 然 后 95, 变 性 30,s,58, 退 火 30,s,72, 延 伸 60,s, 进 行 30 轮 循 环 扩 增, 最 后 一 个 循 环 完 成 后, 72, 继 续 延 伸 10,min. 质 粒 构 建 流 程 :(1) 使 用 引 物 deod in -S 和 deod-a 扩 增 deod 基 因 片 段,Kpn Ⅰ 和 Sal Ⅰ 双 酶 切 后 连 接 到 载 体 pbe43, 构 建 deod 胞 内 表 达 质 粒 pbedeod.(2) 使 用 引 物 pupg in -S 和 pupg- A 扩 增 pupg 片 段,Kpn Ⅰ 和 SalⅠ 双 酶 切 后 连 接 到 载 体 pbe43, 构 建 pupg 胞 内 表 达 质 粒 pbepupg.(3) 以 质 粒 pwb980 为 模 板, 引 物 sacb-s 和 sacb-a 扩 增 sacb 信 号 肽 序 列 (144,bp); 引 物 deod-s 和 deod-a 扩 增 deod 基 因, 通 过 重 叠 PCR 将 sacb 信 号 肽 与 deod 连 接,KpnⅠ 和 SalⅠ 双 酶 切 后 连 接 到 载 体 pbe43, 构 建 分 泌 表 达 质 粒 pbsadeod.(4)pupg-s 和 pupg-a 扩 增 pupg 片 段,XhoⅠ 和 SalⅠ 双 酶 切 后 连 接 到 载 体 pbsa43, 构 建 分 泌 表 达 质 粒 pbsapupg. 所 有 连 接 产 物 转 化 大 肠 杆 菌 DH5, 提 取 阳 性 转 化 子 质 粒 进 行 双 酶 切 验 证, 并 送 华 大 基 因 公 司 测 序 过 表 达 PNP 重 组 菌 的 构 建 将 4 个 重 组 质 粒 分 别 电 转 化 导 入 肌 苷 生 产 菌 B.,subtilis Q60 [12],37, 培 养, 次 日 挑 取 转 化 子, 提 取 质 粒, 进 行 双 酶 切 验 证, 正 确 的 分 别 命 名 为 过 表 达 PNP 菌 株 Q60/pBEdeoD 和 Q60/pBEpupG; 分 泌 过 表 达 PNP 菌 株 Q60/pBSAdeoD 和 Q60/pBSApupG.

3 16 天 津 科 技 大 学 学 报 第 30 卷 第 3 期 表 1 本 研 究 所 用 引 物 Tab. 1 Primers in this study 引 物 名 称 引 物 序 列 5-3 deod in -S sacb-s sacb-a deod-s deod-a pupg in -S pupg-s pupg-a ATCGGGTACCGTTTCATCATGACATTCGTTG(KpnⅠ) CGAAGGTACCAGGAGGGCTGGAAGAAG(KpnⅠ) CACCTATATGTACACTGGCAAAAGCTTGAGTTG CAAGCTTTTGCCAGTGTACATATAGGTGCTG TATAGTCGACCCAGCACGCCTCTTGAT(SalⅠ) CCAGGGTACCGGAGAATTTTATGAAGGACAGAATTGAACG(KpnⅠ) AGGCCTCGAGCAAGGACAGAATTGAACGC(XhoⅠ) TGTAGTCGACCATATTTATTCGTACTGAGCG(SalⅠ) 重 组 菌 发 酵 生 产 利 巴 韦 林 将 4 个 重 组 菌 株 和 只 含 有 空 质 粒 pbe43 的 对 照 菌 株 进 行 500,mL 摇 瓶 发 酵 实 验. 活 化 培 养 : 取 斜 面 保 藏 菌 种 划 线 接 种 于 活 化 斜 面,32, 培 养 12~14,h, 转 接 后 重 复 1 次. 种 子 培 养 : 从 新 鲜 活 化 斜 面 上 挑 取 两 环 菌 体 接 入 种 子 培 养 基 中,500,mL 三 角 瓶 装 液 量 为 30,mL, 10,μg/mL 卡 纳 霉 素 抗 性,32, 200,r/min 振 荡 培 养 8~10,h 至 A 600 =8~10. 发 酵 培 养 :10% 接 种 量,36, 200,r/min 振 荡 培 养 96,h. 从 发 酵 12,h 开 始 每 隔 12,h 添 加 0.2,g TCA, 共 添 加 3 次 分 析 方 法 发 酵 过 程 中 每 12,h 测 定 波 长 600,nm 下 的 吸 光 度. 采 用 SBA 40C 型 生 物 传 感 仪 测 定 发 酵 液 中 残 糖 : 将 发 酵 液 离 心, 取 上 清 液, 用 去 离 子 水 稀 释 100 倍 后, 取 25,μL 稀 释 液 进 样 直 接 读 数. 采 用 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 发 酵 液 中 的 利 巴 韦 林 和 肌 苷 含 量 : 色 谱 柱 为 Kromasil C18 柱 (250,mm 416,mm,5,μm). 利 巴 韦 林 测 定 条 件 : 发 酵 液 用 离 子 水 稀 释 100 倍, 流 动 相 为 V( 乙 腈 ) V( 水 )=4 96 的 乙 腈 水 溶 液, 流 量 1.0,mL/min, 柱 温 18.5,, 检 测 波 长 207,nm. 肌 苷 测 定 条 件 : 发 酵 液 用 1,mol/L NaOH 溶 液 稀 释 10 倍, 沸 水 浴 5,min 后 离 心 取 上 清 液, 上 清 液 用 去 离 子 水 稀 释 100 倍, 流 动 相 为 V( 乙 腈 ) V( 水 )=10 90 的 乙 腈 水 溶 液, 流 量 1.0,mL/min, 柱 温 25,, 检 测 波 长 248,nm. 2 结 果 与 分 析 2.1 重 组 质 粒 和 重 组 菌 株 的 构 建 及 鉴 定 胞 内 过 表 达 质 粒 pbedeod pbepupg 和 分 泌 过 表 达 质 粒 pbsadeod pbsapupg 的 酶 切 验 证 结 果 如 图 1 所 示. 图 1(a) 中,pBEdeoD 用 KpnⅠ 和 SalⅠ 双 酶 切 后 在 800,bp 左 右 出 现 目 的 条 带.pBEpupG 用 KpnⅠ 和 SalⅠ 双 酶 切 后 在 830,bp 左 右 出 现 目 的 条 带, 与 预 期 相 符. 图 1(b) 中,pBSAdeoD 用 KpnⅠ 和 SalⅠ 双 酶 切 后 在 870,bp 左 右 出 现 目 的 条 带, 符 合 sacb 信 号 肽 序 列 和 deod 重 叠 后 的 片 段 大 小.pBSApupG 用 XhoⅠ 和 SalⅠ 双 酶 切 后 在 830,bp 左 右 出 现 目 的 条 带, 与 预 期 相 符. 重 组 质 粒 测 序, 结 果 与 GenBank 上 报 道 的 基 因 序 列 一 致. M.,1,kbp DNA Marker;1. pbedeod(kpnⅠ 和 SalⅠ);2. pbepupg (KpnⅠ 和 SalⅠ) (a) 重 组 质 粒 pbedeod 和 pbepupg 双 酶 切 图 谱 M. 1,kbp DNA Marker;1. pbsadeod(kpnⅠ 和 SalⅠ);2. pbsapupg (XhoⅠ 和 SalⅠ) (b) 重 组 质 粒 pbsadeod 和 pbsapupg 双 酶 切 图 谱 图 1 pbedeod pbepupg pbsadeod 和 pbsapupg 的 验 证 Fig. 1 Identification of the recombined plasmids pbedeod,pbepupg,pbsadeod and pbsapupg 2.2 重 组 菌 发 酵 合 成 利 巴 韦 林 为 了 研 究 两 种 结 构 的 PNP 在 肌 苷 生 产 菌 中 过 表

4 2015 年 6 月 杨 书 尧, 等 : 过 表 达 PNP 对 肌 苷 生 产 菌 合 成 利 巴 韦 林 的 影 响 17 达 以 及 不 同 的 表 达 方 式 对 合 成 利 巴 韦 林 的 影 响, 将 4 株 重 组 菌 株 和 只 含 有 pbe43 空 质 粒 的 对 照 菌 进 行 摇 瓶 发 酵 实 验, 定 期 取 样 测 定 菌 体 生 长 吸 光 度 肌 苷 和 利 巴 韦 林 的 产 量, 发 酵 过 程 曲 线 如 图 2 所 示. (a) 利 巴 韦 林 生 成 曲 线 (b) 肌 苷 生 成 曲 线 (c) 菌 体 干 质 量 曲 线 图 2 利 巴 韦 林 摇 瓶 发 酵 过 程 曲 线 Fig. 2 Fermentation parameters of ribavirin 结 果 显 示 :4 株 重 组 菌 的 菌 体 干 质 量 都 小 于 对 照 菌, 胞 外 分 泌 过 表 达 重 组 菌 Q60/pBSAdeoD 和 Q60/pBSApupG 减 少 明 显, 而 且 这 两 株 菌 的 对 数 期 缩 短,20,h 后 即 进 入 平 稳 期 ; 而 胞 内 表 达 重 组 菌 Q60/pBEdeoD 和 Q60/pBEpupG 与 对 照 菌 相 似, 在 40,h 左 右 才 进 入 平 稳 期. 其 原 因 可 能 是 酶 的 过 表 达 给 菌 体 的 生 长 造 成 了 不 同 程 度 的 负 担. 对 照 菌 从 10,h 开 始 积 累 肌 苷, 产 量 平 稳 上 升, 发 酵 80,h 后 趋 于 平 缓. 对 照 菌 在 添 加 TCA 后 开 始 有 少 量 的 利 巴 韦 林 积 累, 但 是 积 累 量 保 持 在 2,g/L, 不 随 着 肌 苷 的 增 长 而 上 升.4 株 重 组 菌 株 的 肌 苷 含 量 与 对 照 菌 相 比 则 明 显 减 少, 添 加 TCA 后, 利 巴 韦 林 合 成 量 明 显 增 长, PNP 816 重 组 菌 Q60/pBEpupG 和 Q60/pBSApupG 的 增 长 程 度 较 大.PNP 702 重 组 菌 Q60/pBEdeoD 和 Q60/pBSAdeoD 的 利 巴 韦 林 合 成 趋 势 虽 然 与 前 者 一 致, 但 是 合 成 量 低 20% 左 右. 另 外, 相 同 的 PNP 采 用 分 泌 过 表 达 利 巴 韦 林 合 成 量 比 胞 内 过 表 达 高. 4 株 重 组 菌 的 利 巴 韦 林 产 量 是 对 照 菌 的 4~6 倍 ; 肌 苷 剩 余 量 仅 为 对 照 菌 的 15%~30%, 说 明 过 表 达 PNP 可 以 提 高 利 巴 韦 林 的 合 成 效 率. 重 组 菌 的 利 巴 韦 林 产 量 肌 苷 转 化 率 和 TCA 利 用 率 见 表 2. 菌 株 表 2 重 组 菌 的 核 苷 总 产 量 及 转 化 率 比 较 Tab. 2 Comparison of the yields of total nucleoside and inosine utilization of the recombined strains 利 巴 韦 林 产 量 /(g L -1 ) c 利 巴 韦 林 /(mol L -1 ) 肌 苷 剩 余 量 / (g L -1 ) c 肌 苷 /(mol L -1 ) 肌 苷 转 化 率 /% TCA 利 用 率 /% Q60/pBEdeoD 08.33± ± Q60/pBSAdeoD 09.06± ± Q60/pBEpupG 11.00± ± Q60/pBSApupG 12.67± ± Q60/pBE ± ± 注 : 肌 苷 转 化 率 =c 利 巴 韦 林 /(c 利 巴 韦 林 +c 肌 苷 ). 由 表 2 可 以 看 出 重 组 菌 Q60/pBEpupG 的 利 巴 韦 林 产 量 比 Q60/pBEdeoD 高 32.5%;Q60/pBSApupG 的 利 巴 韦 林 产 量 比 Q60/pBSAdeoD 高 39.6%, 说 明 过 表 达 PNP 816 更 有 利 于 利 巴 韦 林 的 合 成. 胞 外 分 泌 型 过 表 达 重 组 菌 Q60/pBSAdeoD 的 产 量 比 Q60/ pbedeod 高 9.6%;Q60/pBSApupG 比 Q60/pBEpupG 高 15.5%,4 株 重 组 菌 的 TCA 利 用 率 也 呈 现 同 样 的 趋 势, 与 对 照 菌 相 比, 分 别 提 高 了 3.2~5.5 倍, 说 明 PNP 的 分 泌 表 达 有 利 于 利 巴 韦 林 的 合 成. 3 讨 论 发 酵 法 合 成 利 巴 韦 林 需 要 核 苷 作 为 前 体 物,PNP 作 为 催 化 剂. 研 究 表 明 3 种 嘌 呤 核 苷 中 肌 苷 是 最 适 底 物, 所 以 本 研 究 以 肌 苷 生 产 菌 作 为 出 发 菌, 构 建 4 株 不 同 类 型 的 PNP 过 表 达 菌 株, 通 过 外 源 添 加 TCA 的 方 法 将 利 巴 韦 林 的 合 成 和 肌 苷 的 发 酵 相 偶 联, 随 着 菌 体 生 长 前 体 物 肌 苷 的 积 累 和 酶 的 表 达, 实 现 一 步

5 18 天 津 科 技 大 学 学 报 第 30 卷 第 3 期 法 合 成 利 巴 韦 林. 发 酵 结 果 显 示, 在 肌 苷 生 产 菌 中 过 表 达 PNP 816 利 巴 韦 林 的 合 成 效 率 和 底 物 TCA 的 利 用 率 都 高 于 [9] PNP 702, 这 与 已 发 表 的 研 究 结 果 一 致.Xie 等 发 现 当 以 肌 苷 作 为 反 应 底 物 时,PNP 702 和 PNP 816 的 酶 促 动 力 学 参 数 K m 值 分 别 为 (1.23±0.01),μmol/L 和 (0.31±0.01),μmol/L,PNP 816 具 有 更 强 的 亲 和 力, 所 以 利 巴 韦 林 产 量 更 高. 另 外 三 聚 体 酶 蛋 白 每 形 成 1 个 具 有 催 化 活 性 的 酶 分 子 需 要 3 条 肽 链 ; 而 六 聚 体 酶 蛋 白 每 形 成 1 个 具 有 催 化 活 性 的 酶 分 子 需 要 6 条 肽 链, 当 利 用 同 样 的 表 达 质 粒, 在 同 样 的 发 酵 条 件 下, 相 同 时 间 的 转 录 量 相 近, 三 聚 体 形 成 具 有 催 化 活 性 的 酶 分 子 所 需 要 的 能 量 少 于 六 聚 体, 效 率 更 高 [10]. 利 巴 韦 林 的 合 成 过 程 中 外 源 添 加 的 底 物 TCA 存 在 于 发 酵 液 中, 将 PNP 分 泌 到 胞 外 可 能 会 提 高 反 应 效 率, 实 验 结 果 也 显 示 分 泌 过 表 达 重 组 菌 的 利 巴 韦 林 产 量 和 TCA 的 利 用 率 都 高 于 胞 内 表 达 的 重 组 菌, 但 是 肌 苷 的 利 用 率 并 没 有 胞 内 表 达 高. 利 巴 韦 林 是 核 苷 类 似 物, 含 有 1 分 子 5 磷 酸 核 糖, 从 两 种 核 苷 类 产 物 的 总 量 上 看, 分 泌 表 达 比 胞 内 表 达 积 累 的 核 苷 总 量 更 高, 可 能 原 因 是 底 物 肌 苷 直 接 与 TCA 在 胞 外 进 行 反 应, 减 少 了 TCA 跨 膜 输 入 和 利 巴 韦 林 跨 膜 输 出 的 消 耗, 菌 株 的 负 担 更 小. 转 化 率 低 的 可 能 性 是 酶 的 表 达 方 式 不 同, 导 致 酶 量 和 活 性 方 面 存 在 差 异 ; 另 外, 胞 内 和 胞 外 的 催 化 环 境 不 同, 酶 的 催 化 活 性 也 可 能 受 到 了 影 响 [11]. 研 究 表 明 [12] : 当 催 化 以 肌 苷 为 底 物 反 应 时 的 催 化 活 性 设 定 为 酶 活 标 准 (100%) 时,PNP 702 催 化 鸟 苷 的 活 性 为 46.2%;PNP 816 催 化 鸟 苷 的 活 性 为 87.7%; 等 质 量 的 纯 化 重 组 PNP 在 磷 酸 盐 缓 冲 液 中 以 鸟 苷 为 核 糖 基 供 体 时 两 种 酶 的 利 巴 韦 林 终 产 率 均 略 高 于 肌 苷. 理 论 上 鸟 苷 的 分 解 产 物 鸟 嘌 呤 较 肌 苷 的 分 解 产 物 次 黄 嘌 呤 溶 解 性 低, 有 利 于 反 应 向 利 巴 韦 林 合 成 方 向 进 行 [13] ; 但 是 目 前 还 未 见 通 过 改 造 鸟 苷 生 产 菌 提 高 PNP 活 性 来 研 究 利 巴 韦 林 合 成 的 相 关 报 道. 因 此, 今 后 的 研 究 方 向 可 以 考 虑 以 鸟 苷 作 为 核 苷 前 体 物, 对 鸟 苷 高 产 菌 进 行 改 造, 提 高 其 PNP 的 酶 活 性, 研 究 对 利 巴 韦 林 合 成 的 影 响. 参 考 文 献 : [1] 郑 人 华, 孙 莉, 裴 文. 三 氮 唑 核 苷 合 成 研 究 进 展 [J]. 浙 江 工 业 大 学 学 报,2003,31(3): [2] 张 绍 谭, 倪 孟 祥, 阮 期 平. 核 苷 类 药 物 的 酶 法 合 成 [J]. 药 学 进 展,2005,29(2): [3] 古 屋 晃, 菊 地 惠 子, 佐 藤 章. 发 酵 法 生 产 利 巴 韦 林 : 日 本,17830[P] [4] 武 改 红, 赵 希 景, 徐 庆 阳, 等. 微 生 物 发 酵 法 生 产 利 巴 韦 林 的 初 步 研 究 [J]. 中 国 医 药 工 业 杂 志,2007, 38(10): [5] 谢 希 贤, 武 改 红, 陈 宁. 利 巴 韦 林 混 合 菌 发 酵 工 艺 条 件 优 化 [J]. 现 代 化 工,2007,27( 增 刊 2): [6] 郭 勇 莉, 丁 庆 豹, 欧 伶, 等. 酶 法 合 成 抗 病 毒 药 物 阿 糖 腺 苷 [J]. 生 物 技 术,2006,16(1): [7] Bzowska A,Kulikowska E,Shugar D. Purine nucleoside phosphorylases:properties,functions,and clinical aspects[j]. Pharmacology & Therapeutics,2000, 88(3): [8] 蔡 显 鹏, 储 炬, 庄 英 萍, 等. 芽 孢 杆 菌 生 产 嘌 呤 核 苷 研 究 进 展 [J]. 中 国 生 物 工 程 杂 志,2002,22(5):9 14. [9] Xie X X,Xia J G,He K F,et al. Low-molecular-mass purine nucleoside phosphorylase:characterization and application in enzymatic synthesis of nucleoside antiviral drugs[j]. Biotechnology Letters,2011,33(6): [10] 沈 同, 王 镜 岩. 生 物 化 学 [M]. 北 京 : 高 等 教 育 出 版 社,1993. [11] 邱 蔚 然, 唐 孝 宣, 沈 荣 坤. 酶 法 生 产 三 氮 唑 核 苷 的 进 展 [J]. 中 国 生 化 药 物 杂 志,1995,16(2): [12] Shi S B,Shen Z,Chen X,et al. Increased production of riboflavin by metabolic engineering of the purine pathway in Bacillus subtilis[j]. Biochemical Engineering Journal,2009,46(4): [13] 夏 俊 刚, 何 逵 夫, 谢 希 贤, 等. 枯 草 芽 孢 杆 菌 嘌 呤 核 苷 磷 酸 化 酶 酶 学 性 质 研 究 及 在 利 巴 韦 林 酶 法 合 成 中 的 应 用 [J]. 中 国 生 物 工 程 杂 志,2010,30(12): 责 任 编 辑 : 周 建 军