微生物学实验室常用试剂与培养基

Transcription

1 微 生 物 学 实 验 室 常 用 试 剂 与 培 养 基 第 一 节 常 用 试 剂 及 其 使 用 方 法 一 诊 断 用 纸 片 ⑴ 杆 菌 肽 纸 片 (0.04U/ 片 ): 抑 菌 圈 >10mm 为 敏 感 质 控 菌 株 : D 群 链 球 菌 阴 性, A 群 链 球 菌 阳 性 ⑵ SMZ 纸 片 (1.25μg/ 片 23.75μg/ 片 ): 出 现 抑 菌 圈 即 为 敏 感 质 控 菌 株 :D 群 链 球 菌 阳 性, A 群 链 球 菌 阴 性 ⑶ 新 生 霉 素 纸 片 (5.0μg/ 片 ): 抑 菌 圈 16mm 为 敏 感 质 控 菌 株 : 表 皮 葡 萄 球 菌 阳 性, 腐 生 葡 萄 球 菌 阴 性 ⑷ O129 纸 片 奥 普 托 欣 (Optochin) 纸 片 : 参 见 第 五 节 生 化 试 验 培 养 基 二 诊 断 用 血 清 1. 沙 门 菌 属 诊 断 血 清 ⑴ A-F 群 O 多 价 诊 断 血 清 ⑵ 特 异 O 群 因 子 诊 断 血 清 : 常 用 的 有 O2,O4,O7,O9,O10 诊 断 血 清 ⑶ 特 异 H 因 子 诊 断 血 清 常 用 的 有 Ha,Hb,Hc,Hd,Hgm,Hi,Hf Vi 因 子 诊 断 血 清 2. 志 贺 菌 属 诊 断 血 清 志 贺 菌 属 4 种 多 价 血 清 : 痢 疾 志 贺 菌 Ⅰ Ⅱ 血 清, 福 氏 志 贺 菌 多 价 血 清 及 分 型 血 清 (1~6 型 ), 宋 内 志 贺 菌 诊 断 血 清, 鲍 氏 志 贺 菌 多 价 血 清 及 分 型 血 清 3. 致 病 性 大 肠 埃 希 菌 诊 断 血 清 肠 致 病 性 大 肠 埃 希 菌 (EPEC) 诊 断 血 清, 产 肠 毒 素 大 肠 埃 希 菌 (ETEC) 诊 断 血 清, 肠 侵 袭 性 大 肠 埃 希 菌 (EIEC) 诊 断 血 清, 肠 出 血 性 大 肠 埃 希 菌 (EHEC) 诊 断 血 清 O157: H 7 4. 霍 乱 弧 菌 O1 O139 混 合 多 价 诊 断 血 清 及 稻 叶 小 川 彦 岛 O139 分 型 血 清 5. 脑 膜 炎 奈 瑟 菌 多 价 血 清 及 分 群 血 清 6. 链 球 菌 分 类 诊 断 血 清 7. 肺 炎 链 球 菌 诊 断 血 清 8. 耶 尔 森 菌 诊 断 血 清 三 常 用 染 色 液 1. 革 兰 染 色 液 ⑴ 结 晶 紫 溶 液 A 液 : 结 晶 紫 20g,95% 乙 醇 20 ml; B 液 : 草 酸 铵 0.8g, 蒸 馏 水 80 ml 染 色 前 24h 将 A 液 B 液 混 合, 过 滤 后 装 入 试 剂 瓶 内 备 用 ⑵ 碘 液 : 碘 1g, 碘 化 钾 2g, 蒸 馏 水 300ml 将 碘 与 碘 化 钾 混 合 并 研 磨, 加 入 几 毫 升 蒸 馏 水, 使 其 逐 渐 溶 解, 然 后 研 磨, 继 续 加 入 少 量 蒸 馏 水 至 碘 碘 化 钾 完 全 溶 解 最 后 补 足 水 量 也 可 用 少 量 蒸 馏 水 将 碘 化 钾 完 全 溶 解, 再 加 入 碘 片, 待 完 全 溶 解 后, 加 水 至 300ml ⑶ 脱 色 液 :95% 乙 醇 ⑷ 复 染 液 : 沙 黄 2.5g,95% 乙 醇 100ml 为 贮 存 液, 取 贮 存 液 10ml, 加 蒸 馏 水 90ml 为 应 用 液 2. 抗 酸 染 色 液

2 ⑴ 碱 性 复 红 染 色 液 : 1 萋 纳 石 炭 酸 复 红 溶 液 : 碱 性 复 红 乙 醇 饱 和 溶 液 10ml,5% 石 炭 酸 溶 液 90ml 2 脱 色 液 : 浓 盐 酸 3ml,95% 乙 醇 97ml 3 复 染 液 ( 吕 弗 勒 美 蓝 液 ): 美 蓝 乙 醇 饱 和 溶 液 30ml,100g/L 氢 氧 化 钾 溶 液 0.1ml, 蒸 馏 水 100ml ⑵ 金 胺 O- 罗 丹 明 B 染 色 液 : 1 罗 丹 明 B 液 : 罗 丹 明 B 0.1g 加 蒸 馏 水 100ml 21g/L 金 胺 O 液 : 金 胺 O 液 0.1g 加 蒸 馏 水 95ml, 再 加 入 纯 石 炭 酸 5ml, 混 匀 33% 盐 酸 乙 醇 4 稀 释 美 蓝 液 : 吕 弗 勒 美 蓝 液 100ml, 加 蒸 馏 水 90ml, 混 匀 3. 鞭 毛 染 色 液 ( 改 良 Ryu 法 ) A 液 :5% 石 炭 酸 10ml, 鞣 酸 2g, 饱 和 硫 酸 铝 钾 溶 液 10ml; B 液 : 结 晶 紫 乙 醇 饱 和 液 应 用 液 A 液 10 份,B 液 1 份, 混 合, 室 温 存 放 备 用 4. 异 染 颗 粒 染 色 液 甲 液 : 甲 苯 胺 蓝 0.15g, 孔 雀 绿 2g/L, 95% 乙 醇 2.0ml, 蒸 馏 水 100ml 乙 液 : 碘 2g, 碘 化 钾 3g, 蒸 馏 水 300ml 先 将 碘 化 钾 加 入 少 许 蒸 馏 水 ( 约 2ml), 充 分 振 摇, 待 完 全 溶 解, 再 加 入 碘, 使 完 全 溶 解 后, 加 蒸 馏 水 至 300ml 5. 荚 膜 染 色 液 ⑴ 印 度 墨 汁 或 50g/L 黑 色 素 水 溶 液 ⑵ 5g/L 苯 胺 蓝 水 溶 液 第 二 节 基 础 培 养 基 一 液 体 基 础 培 养 基 1. 蛋 白 胨 水 用 于 细 菌 靛 基 质 试 验 ; 一 般 细 菌 培 养 和 传 代 蛋 白 胨 ( 或 胰 蛋 白 胨 )10g, 氯 化 钠 5g, 蒸 馏 水 1L 将 上 述 成 分 溶 于 水 中, 校 正 ph 至 7.2, 分 装 试 管, 每 管 2~3ml, 置 121 灭 菌 15min 备 用 大 肠 埃 希 菌 生 长 良 好, 靛 基 质 阳 性 ; 伤 寒 沙 门 菌 生 长 良 好, 靛 基 质 阴 性 2. 营 养 肉 汤 一 般 细 菌 的 增 菌 培 养, 加 入 1% 的 琼 脂 粉 亦 可 作 营 养 琼 脂 蛋 白 胨 10g, 牛 肉 膏 3g, 氯 化 钠 5g, 蒸 馏 水 1L 将 上 述 成 分 称 量 混 合 溶 解 于 水 中, 校 正 ph 至 7.4, 按 用 途 不 同 分 装 于 烧 瓶 或 试 管 内 经 121 灭 菌 15min, 作 无 菌 试 验 后 冷 藏 备 用 金 黄 色 葡 萄 球 菌 伤 寒 沙 门 菌 化 脓 性 链 球 菌 生 长 良 好

3 置 冰 箱 3 周 内 用 完 3. 牛 肉 浸 液 培 养 基 细 菌 培 养 最 基 础 的 培 养 基, 除 用 于 一 般 细 菌 的 培 养 外, 又 可 以 作 营 养 琼 脂 及 其 它 培 养 基 的 基 础 新 鲜 除 脂 牛 肉 500g, 氯 化 钠 5g 蛋 白 胨 10g, 蒸 馏 水 1L 先 将 牛 肉 清 洗, 除 脂 肪 肌 腱, 并 切 块 绞 碎 称 取 500g 置 容 器 加 入 蒸 馏 水 1L, 搅 匀 后 置 冰 箱 过 夜, 次 日 煮 沸 加 热 30min, 并 用 玻 棒 不 时 搅 拌 用 绒 布 或 麻 布 进 行 粗 过 滤, 再 用 脱 脂 棉 过 滤 即 成 在 过 滤 中 加 入 蛋 白 胨 10g 氯 化 钠 5g 溶 解 后, 用 氢 氧 化 钠 溶 液 校 正 ph 至 7.6~7.8, 并 加 热 煮 沸 10min, 补 充 蒸 馏 水 至 1L, 最 后 用 滤 纸 过 滤, 呈 清 晰 透 明 淡 黄 色 液 体, 经 min 灭 菌 备 用 根 据 用 途 不 同 可 以 制 成 营 养 肉 汤, 以 此 为 基 础 制 成 其 它 培 养 基 如 制 作 固 体 培 养 基, 加 入 琼 脂 15 ~20g/L 即 可 金 黄 色 葡 萄 球 菌 大 肠 埃 希 菌 伤 寒 沙 门 菌 痢 疾 志 贺 菌 等 均 生 长 良 好 置 4 冰 箱 内 可 以 使 用 较 长 时 间 商 品 牛 肉 浸 膏 粉, 一 般 使 用 量 为 3~5g/L 二 固 体 基 础 培 养 基 1. 营 养 琼 脂 一 般 细 菌 和 菌 株 的 纯 化 及 传 种 蛋 白 胨 10g, 牛 肉 膏 3g, 氯 化 钠 5g, 琼 脂 粉 ( 优 质 )12g, 蒸 馏 水 1L 将 上 述 成 分 ( 除 琼 脂 外 ) 溶 于 水 中, 校 正 ph 7.2~7.4 后 加 入 琼 脂, 煮 沸 溶 解, 根 据 用 途 不 同 进 行 分 装, 经 121 灭 菌 15min, 倾 注 平 板 或 制 成 斜 面, 冷 藏 备 用 金 黄 色 葡 萄 球 菌 菌 落 呈 浅 黄 色 ; 痢 疾 志 贺 菌 菌 落 无 色 ; 铜 绿 假 单 胞 菌 菌 落 无 色 或 浅 绿 色 置 4 冰 箱 保 存,2 周 内 用 完 2. 血 琼 脂 培 养 基 一 般 病 原 菌 的 分 离 培 养 和 溶 血 性 鉴 别 及 保 存 菌 种 ph 7.4~7.6 牛 肉 浸 液 琼 脂 100ml, 脱 纤 维 羊 血 ( 或 兔 血 ) 5~10ml

4 将 血 琼 脂 基 础 经 121 灭 菌 15min, 待 冷 却 至 50 左 右 以 无 菌 手 续 加 入 羊 血, 摇 匀 后 立 即 倾 注 灭 菌 平 皿 内, 待 凝 固 后, 经 无 菌 实 验 冷 藏 备 用 化 脓 性 链 球 菌 ATCC 生 长 良 好,β- 溶 血 ; 肺 炎 链 球 菌 ATCC 6303 生 长 良 好,α- 溶 血 ; 表 皮 葡 萄 球 菌 ATCC 生 长 良 好, 不 溶 血 置 4 冰 箱,1 周 内 用 完 3. 巧 克 力 琼 脂 培 养 基 主 要 用 于 嗜 血 杆 菌 的 分 离 培 养, 亦 可 用 于 奈 瑟 菌 的 增 殖 培 养 鲜 牛 肉 浸 出 液 1L, 蛋 白 胨 10g, 氯 化 钠 5g, 琼 脂 粉 12g, 无 菌 脱 纤 维 羊 血 或 兔 血 100ml 将 上 述 成 分 ( 除 兔 血 外 ) 加 热 溶 解, 调 ph 至 7.2, 置 min 高 压 灭 菌, 待 冷 至 约 85, 以 无 菌 方 式 加 入 兔 血, 摇 匀 后 置 85 水 浴 中, 维 持 该 温 度 10min, 使 之 成 巧 克 力 色 取 出 置 室 温 冷 至 约 50, 倾 注 平 板 或 制 成 斜 面 备 用 流 感 嗜 血 杆 菌 ATCC 肺 炎 链 球 菌 ATCC 6305 生 长 良 好, 菌 落 典 型 置 4 冰 箱,1 周 内 用 完 4. 胱 氨 酸 胰 化 酪 蛋 白 琼 脂 常 用 于 测 定 脑 膜 炎 奈 瑟 菌 和 淋 病 奈 瑟 菌 以 及 营 养 要 求 较 高 细 菌 的 糖 发 酵 试 验 胱 氨 酸 0.5g, 胰 化 酪 蛋 白 20g, 氯 化 钠 5g, 亚 硫 酸 钠 0.3g, 琼 脂 3.5g, 酚 红 g, 蒸 馏 水 1L 将 上 述 成 分 ( 酚 红 除 外 ) 混 合 溶 解, 调 ph 至 7.2, 加 入 酚 红 指 示 剂 分 装 试 管,115 灭 菌 15min 用 于 测 定 糖 发 酵 时, 按 需 要 加 入 各 种 糖 溶 液, 将 待 检 标 本 直 接 种 于 培 养 基 管 内, 置 35 孵 箱,18~24h 观 察 结 果 培 养 基 由 红 色 变 为 黄 色 为 阳 性, 不 变 色 为 阴 性 第 三 节 保 存 和 增 菌 培 养 基 一 菌 种 保 存 培 养 基 蛋 白 胨 10g, 牛 肉 膏 5g, 氯 化 钠 3g, 磷 酸 氢 二 钠 2g, 琼 脂 粉 4.5g, 蒸 馏 水 1L 将 上 述 成 分 混 合 于 水 中, 加 热 溶 解, 调 ph 至 7.4~7.6, 分 装 试 管 2/3 左 右 高 度,121 高 压 灭 菌 15min, 成 为 半 固 体 培 养 基, 备 用

5 培 养 基 呈 淡 黄 色 半 固 体 状 大 肠 埃 希 菌 (ATCC 25922) 生 长 良 好, 动 力 阳 性 ; 福 氏 志 贺 菌 (ATCC 12022) 生 长 良 好, 动 力 阴 性 ; 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (ATCC 25923) 生 长 良 好, 动 力 阴 性 二 增 菌 培 养 基 1. 葡 萄 糖 肉 汤 用 于 血 液 增 菌 蛋 白 胨 ( 或 月 示 胨 )10g, 氯 化 钠 5g, 肉 浸 液 ( 或 心 浸 液 )1L, 葡 萄 糖 3g, 枸 橼 酸 钠 3g,5g/L 对 氨 基 苯 甲 酸 水 溶 液 10ml,1mol/L 硫 酸 镁 溶 液 20ml, 青 霉 素 酶 1000 U 将 蛋 白 胨 氯 化 钠 混 合 于 肉 浸 液 中 加 热 溶 解, 再 加 入 葡 萄 糖 枸 橼 酸 钠 对 氨 苯 甲 酸 及 硫 酸 镁, 继 续 煮 沸 5min, 并 补 足 失 水, 调 整 ph 至 7.8 过 滤 分 装, 每 瓶 50ml, 高 压 灭 菌 min 后, 每 瓶 加 入 青 霉 素 酶 50 U, 经 无 菌 试 验 合 格 后, 冷 却 备 用 将 采 取 的 血 液 标 本, 以 无 菌 手 续 注 入 培 养 瓶 中 ( 血 液 1ml, 培 养 液 10ml), 置 35 培 养 箱 内, 每 天 1 次 取 出 观 察 结 果 如 有 细 菌 生 长, 可 出 现 数 种 不 同 的 表 现, 应 随 时 作 分 离 培 养, 可 选 用 血 琼 脂 伊 红 美 蓝 琼 脂 及 巧 克 力 琼 脂 平 板 等 无 细 菌 生 长 表 现 的 培 养 瓶, 需 连 续 观 察 7d, 仍 无 细 菌 生 长 方 可 弃 去 在 观 察 的 过 程 中, 至 少 应 作 两 次 分 离 培 养 ⑴ 枸 橼 酸 钠 为 抗 凝 剂, 可 使 血 液 加 入 培 养 基 中 不 凝 固 ⑵ 对 氨 基 苯 甲 酸 主 要 中 和 血 液 中 磺 胺 类 药 物 的 抑 菌 作 用 ⑶ 硫 酸 镁 主 要 抑 制 血 液 中 存 在 的 四 环 素 金 霉 素 新 霉 素 多 粘 菌 素 及 链 霉 素 的 抑 菌 作 用 ⑷ 本 培 养 基 近 年 来 有 许 多 改 良 配 方, 如 加 入 0.3%~0.5% 酵 母 浸 膏 以 增 加 营 养 ; 加 0.2% 核 酸 刺 激 细 菌 生 长 ; 加 0.1% 粘 液 素 能 被 覆 于 细 菌 的 表 面, 保 护 细 菌 免 受 抗 体 破 坏 ; 加 入 聚 茴 香 脑 磺 酸 钠 (SPS) 能 中 和 补 体 的 抗 药 作 用 从 而 提 高 检 出 率 2. 血 液 增 菌 培 养 基 血 液 和 骨 髓 液 病 原 菌 的 增 菌 培 养 蛋 白 胨 10g, 氯 化 钠 5g, 牛 肉 膏 3g, 葡 萄 糖 1g, 酵 母 膏 粉 3g, 枸 橼 酸 钠 3g, 磷 酸 氢 二 钾 2g,5g/L 对 氨 基 苯 甲 酸 溶 液 5ml,1mol/L 硫 酸 镁 溶 液 20ml, 4g/L 酚 红 溶 液 6ml, 青 霉 素 酶 50 U, 聚 茴 香 脑 磺 酸 钠 (SPS) 0.3g, 蒸 馏 水 1L 将 上 述 成 分 ( 除 酚 红 指 示 剂 青 霉 素 酶 外 ) 混 合 加 热 溶 解, 校 正 ph 至 7.4, 再 加 酚 红, 过 滤 分 装 每 瓶 30~ 50ml, 经 121 灭 菌 15min 和 35 24h 无 菌 试 验 备 用 临 用 时 每 瓶 加 入 1.5~2.5 U 青 霉 素 酶 伤 寒 沙 门 菌 ATCC 白 色 念 珠 菌 ATCC 化 脓 性 链 球 菌 ATCC 肺 炎 链 球 菌 ATCC 6305 金 黄 色 葡 萄 菌 ATCC 铜 绿 假 单 胞 菌 ATCC 均 生 长 良 好

6 3. 亚 硒 酸 盐 增 菌 培 养 基 沙 门 菌 增 菌 培 养 蛋 白 胨 5g, 乳 糖 4g, 磷 酸 氢 二 钠 4.5g, 磷 酸 二 氢 钠 5.5g, 亚 硒 酸 氢 钠 4g, 蒸 馏 水 1L 先 将 亚 硒 酸 盐 加 到 200ml 蒸 馏 水 中, 充 分 摇 匀 溶 解 其 它 成 分 称 量 混 合, 加 入 蒸 馏 水 800ml, 加 热 溶 解, 待 冷 却 后 两 液 混 合, 充 分 摇 匀, 校 正 ph 7.0~7.1( 通 过 调 整 磷 酸 盐 缓 冲 对 的 比 例 来 校 正 ph 值 ) 最 后 分 装 于 mm 的 试 管 内, 每 管 10ml 置 水 浴 隔 水 煮 沸 10~15min, 立 即 冷 却, 置 4 冰 箱 保 存 备 用 取 新 鲜 标 本 1g 或 棉 拭 子 采 样 直 接 种 于 该 培 养 管 内 摇 动 后 置 35 培 养 过 夜 如 发 现 均 匀 混 浊, 管 底 有 红 色 沉 淀 物, 表 示 细 菌 生 长 然 后 取 培 养 物 分 离 在 选 择 性 培 养 基 上, 如 SS 琼 脂 麦 康 凯 琼 脂 平 板 等, 进 行 培 养 培 养 基 应 呈 淡 黄 色 或 无 色, 透 明 无 沉 淀 物 增 菌 灵 敏 度 : 伤 寒 沙 门 菌 , 鼠 伤 寒 及 副 伤 寒 沙 门 菌 保 存,1 周 内 用 完 ⑴ 亚 硒 酸 盐, 包 括 亚 硒 酸 钠 亚 硒 酸 氢 钠 均 可 使 用, 但 以 亚 硒 酸 氢 钠 效 果 为 好 ⑵ 磷 酸 盐 缓 冲 对 中, 两 者 的 用 量 比 例 与 亚 硒 酸 盐 及 蛋 白 胨 的 品 种 有 关 制 备 前 应 进 行 调 试, 其 总 量 为 10g/L ⑶ 在 制 备 过 程 中, 亚 硒 酸 盐 不 能 直 接 加 热 隔 水 煮 沸 时 间 亦 不 能 超 过 规 定 时 间, 否 则 亚 硒 酸 盐 会 变 质, 生 成 红 色 沉 淀 物 ⑷ 培 养 基 应 呈 淡 黄 色, 有 红 色 沉 淀 物 出 现 时 不 可 再 用 4.SS 增 菌 液 用 于 沙 门 志 贺 菌 的 增 菌 月 示 胨 2g, 蛋 白 胨 8g, 牛 肉 膏 3.5g, 酵 母 膏 2g, 葡 萄 糖 2g, 枸 橼 酸 铁 10g, 硫 代 硫 酸 钠 10g, 亚 硫 酸 钠 0.7g, 胆 盐 5.5g, 磷 酸 氢 二 钠 4g, 磷 酸 二 氢 钾 0.1g, 去 氧 胆 酸 钠 ( 进 口 ) 1.5g, 煌 绿 0.005g, 蒸 馏 水 1L 将 上 述 成 分 加 热 溶 于 水 中, 调 ph 至 7.1, 分 装 试 管 (15 150mm), 每 管 5~7ml, 隔 水 煮 沸 5min 备 用 取 粪 便 标 本 1g 直 接 种 于 增 菌 液 内,35 16~18h 培 养, 取 出 转 种 于 分 离 培 养 基 即 可 培 养 基 应 呈 淡 黄 色 或 略 呈 淡 绿 色 伤 寒 沙 门 菌 ATCC 福 氏 志 贺 菌 ATCC 生 长 良 好 ; 大 肠 埃 希 菌 ATCC 生 长 抑 制 ⑴ 切 勿 高 压, 隔 水 煮 沸 时 间 不 超 过 5min

7 ⑵ 煌 绿 用 量 应 根 据 不 同 产 品 批 号 酌 情 增 减 5. 碱 性 蛋 白 胨 水 霍 乱 弧 菌 增 菌 培 养 蛋 白 胨 20g, 氯 化 钠 5g, 蒸 馏 水 100ml 将 上 述 成 分 溶 解 于 水 中, 校 正 ph 至 8.6, 分 装 于 试 管 8~10ml, 经 121 灭 菌 15min 备 用 将 待 检 标 本 接 种 到 碱 性 胨 水 中, 置 35 培 养 6~8h, 霍 乱 弧 菌 呈 均 匀 混 浊 生 长, 表 面 有 菌 膜 出 现 取 表 面 菌 液 一 白 金 环 移 种 到 碱 性 琼 脂 庆 大 琼 脂 或 TCBS 琼 脂 平 板 上 必 要 时 做 第 二 次 增 菌 有 条 件 的 实 验 室 可 用 标 准 菌 株, 一 般 临 床 实 验 室 可 用 非 01 群 弧 菌, 培 养 后 生 长 良 好 者 方 可 使 用 霍 乱 弧 菌 E1-Tor 生 物 型 和 副 溶 血 弧 菌 生 长 良 好 (6h); 大 肠 埃 希 菌 ATCC 不 生 长 (6h) 置 4 冰 箱,2 周 内 用 完 若 在 每 升 碱 性 胨 水 中 加 入 1% 亚 碲 酸 钾 溶 液 0.5~1.0 ml, 则 成 为 亚 碲 酸 钾 碱 性 胨 水, 其 增 菌 效 果 更 为 理 想 第 四 节 分 离 培 养 基 一 革 兰 阳 性 杆 菌 分 离 培 养 基 1. 罗 - 琴 改 良 培 养 基 用 于 结 核 分 枝 杆 菌 培 养 磷 酸 二 氢 钾 2.4g, 硫 酸 镁 0.24g, 枸 橼 酸 镁 ( 或 枸 橼 酸 钠 ) 0.6g, 天 门 冬 素 3.6g, 甘 油 12ml, 蒸 馏 水 600ml, 马 铃 薯 淀 粉 30g, 新 鲜 鸡 卵 液 1L,2% 孔 雀 绿 水 溶 液 20ml 先 将 磷 酸 盐 硫 酸 镁 枸 橼 酸 镁 天 门 冬 素 及 甘 油, 加 热 溶 解 于 600ml 蒸 馏 水 中 再 添 放 马 铃 薯 粉, 边 放 边 搅, 并 继 续 置 沸 水 中 加 热 30min, 待 冷 却 至 60 左 右 时, 加 入 鸡 卵 液 1L 及 孔 雀 绿 溶 液 20ml, 充 分 混 匀 后, 用 无 菌 操 作 分 装 于 灭 菌 试 管, 每 支 5~6ml, 塞 紧 橡 皮 塞 ( 最 好 是 翻 口 塞 ), 置 于 血 清 凝 固 器 内 制 成 斜 面, 经 85 1h 间 歇 灭 菌 2 次 ( 或 高 压 灭 菌 min), 待 凝 固 后 经 无 菌 试 验,4 冷 藏 备 用 取 晨 咳 痰 或 其 它 体 液 标 本, 经 消 化 处 理 和 离 心 沉 淀 的 浓 缩 液 0.1ml( 约 2 滴 ) 滴 种 于 培 养 基 的 斜 面 上, 尽 量 摇 晃, 置 35 5%~10% 二 氧 化 碳 温 箱 内 培 养 1~4 周, 观 察 结 果 凡 在 1 周 内 发 现 生 长 的 菌 落, 一 般 不 可 能 是 结 核 分 枝 杆 菌 ; 在 2 周 后 生 长 的 菌 落, 奶 油 状, 略 呈 黄 色, 粗 糙 突 起, 不 透 明, 即 取 菌 进 行 涂 片 染 色 镜 检 及 鉴 定 用 结 核 分 枝 杆 菌 菌 株 作 阳 性 培 养 试 验 置 4 冰 箱 内 2~4 周 有 效

8 ⑴ 本 培 养 基 由 Lowenstein-Jenden 设 计 的 基 础 上 改 良 (2) 本 培 养 基 ph 约 为 6.0 左 右, 一 般 无 须 校 正 (3) 间 歇 灭 菌 的 温 度 不 宜 超 过 血 清 斜 面 培 养 基 ( 吕 氏 血 清 斜 面 ) 用 于 白 喉 棒 状 杆 菌 培 养 1% 葡 萄 糖 肉 汤 (ph 7.6)100ml, 无 菌 动 物 血 清 ( 牛 羊 猪 兔 ) 300ml 将 上 述 成 分 混 合 后, 分 装 于 试 管 内, 每 管 约 4~5ml 斜 插 在 血 清 凝 固 器 内 ( 或 蒸 笼 ) 加 热 80~85 30min, 使 血 清 凝 固 成 斜 面, 冷 却 后 放 4 冰 箱 内 取 出 后 采 用 间 歇 灭 菌 法,85 灭 菌 30min, 连 续 3 天, 经 无 菌 试 验 证 明 无 杂 菌 生 长 即 可 应 用 将 喉 拭 子 直 接 接 种 于 上 述 斜 面 上, 置 35 培 养 16~24h 白 喉 杆 菌 在 上 述 培 养 基 上, 菌 落 呈 圆 形, 表 面 光 滑 完 整,9g/L 氯 化 钠 溶 液 中 易 乳 化, 用 阿 尔 培 脱 染 色, 两 极 异 染 颗 粒 明 显 ⑴ 所 用 血 清 不 能 含 有 防 腐 剂 ⑵ 该 培 养 基 不 能 高 热 灭 菌, 以 防 破 坏 其 中 营 养 成 分 ⑶ 配 制 时 所 有 器 皿 棉 塞 等 均 应 高 压 灭 菌 3. 亚 碲 酸 钾 血 琼 脂 用 于 分 离 白 喉 杆 菌 蛋 白 胨 10g, 氯 化 钠 5g, 牛 肉 浸 膏 3g, 葡 萄 糖 2g, 胱 氨 酸 0.05g,1% 亚 碲 酸 钾 45ml, 脱 纤 维 羊 血 100ml, 琼 脂 2g, 蒸 馏 水 900ml 先 将 蛋 白 胨 氯 化 钠 牛 肉 浸 膏 葡 萄 糖 和 胱 氨 酸 加 水 加 热 溶 解, 调 ph 至 7.6, 加 入 琼 脂, 高 压 灭 菌 min 备 用 待 冷 至 50 左 右, 用 无 菌 操 作 加 入 已 灭 菌 的 亚 碲 酸 钾 溶 液 及 羊 血, 混 匀 倾 注 平 板 将 标 本 直 接 接 种 于 亚 碲 酸 钾 平 板 上 置 35 孵 箱, 经 24~48h 培 养, 观 察 结 果 白 喉 杆 菌 能 使 亚 碲 酸 钾 还 原 成 金 属 碲 而 形 成 黑 色 和 灰 黑 色 的 菌 落 二 革 兰 阴 性 杆 菌 分 离 培 养 基 ( 一 ) 弧 菌 分 离 培 养 基 1. 碱 性 琼 脂 用 于 霍 乱 弧 菌 分 离 培 养 蛋 白 胨 10g, 氯 化 钠 5g, 牛 肉 膏 3g, 脂 20g, 蒸 馏 水 1L

9 将 前 4 种 成 分 混 合 于 水 中, 加 热 溶 解, 校 正 ph 至 8.4, 分 装 后 121 灭 菌 15min, 倾 注 平 板 凡 急 性 患 有 水 样 便 标 本 做 增 菌 培 养 的 同 时, 应 直 接 取 标 本 接 种 到 碱 性 琼 脂 平 板 或 亚 碲 酸 钾 琼 脂 平 板 上 置 35 培 养 12~16h, 观 察 结 果 霍 乱 弧 菌 生 长 较 快, 菌 落 大 而 扁 平, 呈 青 灰 色, 半 透 明, 光 滑 湿 润 在 亚 碲 酸 钾 琼 脂 上 菌 落 呈 灰 黑 色 各 实 验 室 凡 自 配 培 养 基 或 商 品 培 养 基, 在 使 用 前 可 用 标 准 菌 株 生 长 对 照, 临 床 实 验 室 可 送 防 疫 部 门 所 设 立 的 专 门 检 验 机 构 进 行 目 的 菌 监 测, 质 量 可 靠 者 方 可 使 用 EL-Tor 弧 菌 生 长 良 好 ; 大 肠 埃 希 菌 ATCC 生 长 抑 制 置 4 冰 箱,1 周 内 用 完 2. 碱 性 胆 盐 琼 脂 用 于 霍 乱 弧 菌 分 离 培 养 蛋 白 胨 10g, 牛 肉 膏 5g, 氯 化 纳 5g~10g, 琼 脂 20g, 胆 盐 ( 牛 猪 )2.5g, 蒸 馏 水 1L 将 上 述 成 分 称 量 混 合 于 水 中 加 热 溶 解, 校 正 ph 至 8.4, 分 装 121 灭 菌 15min, 倾 注 平 板 取 粪 便 标 本 或 增 菌 培 养 物 1 接 种 环 接 种 平 板, 置 35 温 箱 培 养 16~18h 霍 乱 弧 菌 迅 速 生 长, 其 它 细 菌 生 长 较 缓 慢 在 16~18h 后, 霍 乱 弧 菌 的 菌 落, 直 径 可 达 2mm 左 右, 呈 扁 平, 青 灰 色, 半 透 明, 光 滑 湿 润, 易 挑 起 其 它 细 菌 菌 落 小 而 凸 起, 不 透 明, 或 有 色 素 同 碱 性 琼 脂 置 冰 箱,1 周 内 用 完 3. 庆 大 霉 素 琼 脂 用 于 霍 乱 弧 菌 分 离 培 养 蛋 白 胨 10g, 牛 肉 浸 膏 3g, 氯 化 钠 5g, 枸 橼 酸 钠 10g, 无 水 亚 硫 酸 钠 3g, 蔗 糖 ( 或 白 糖 )10g, 琼 脂 15~20g, 庆 大 霉 素 多 粘 菌 素 B 双 抗 液 2ml, 蒸 馏 水 1L 将 上 述 成 分 ( 除 双 抗 液 外 ) 称 量 混 合 于 水 中, 加 热 溶 解, 校 正 ph 至 8.4, 分 装 灭 菌 min, 待 冷 却 至 50 后, 每 100ml 内 加 双 抗 液 0.2ml, 另 加 5g/L 亚 碲 酸 钾 溶 液 0.1ml, 再 倾 注 平 板 最 后 每 毫 升 培 养 基 内 含 有 庆 大 霉 素 0.5 U, 多 粘 菌 素 B6 U 将 粪 便 标 本 或 增 菌 培 养 物 划 线 接 种 到 该 平 板 上, 置 35 培 养 16~18h

10 由 于 该 培 养 基 抑 制 性 强, 其 它 非 弧 菌 科 细 菌 被 抑 制, 而 霍 乱 弧 菌 生 长 迅 速,16h 菌 落 可 达 2mm, 菌 落 青 灰 色, 半 透 明, 扁 平, 光 滑 湿 润 若 培 养 时 间 长, 菌 落 略 黄 色 隆 起, 中 心 厚 而 不 透 明 霍 乱 弧 菌 ( 小 川 稻 叶 ) 生 长 良 好, 培 养 18~24h 菌 落 直 径 2.5~3.0mm; 大 肠 埃 希 菌 和 变 形 杆 菌 生 长 抑 制 置 4 冰 箱 内,1 周 内 用 完 ⑴ 该 培 养 基 国 内 有 商 品 出 售, 多 数 产 品 已 加 入 庆 大 霉 素, 使 用 时, 应 详 阅 说 明 书 ⑵ 双 抗 液 配 制 :98ml 灭 菌 蒸 馏 水 中 加 庆 大 霉 素 ( U/ml)1ml, 多 粘 菌 B 或 抗 敌 E( U/ml)1ml 4 冰 箱 保 存,1 月 用 完 4. 四 号 琼 脂 用 于 霍 乱 弧 菌 分 离 培 养 蛋 白 胨 10g, 氯 化 钠 5g, 牛 肉 浸 膏 3g, 亚 硫 酸 钠 ( 无 水 )3g, 枸 橼 酸 钠 10g, 猪 胆 汁 粉 5g, 十 二 烷 硫 酸 钠 20g, 利 凡 诺 ( 雷 佛 奴 尔 )3g, 琼 脂 粉 12g, 庆 大 霉 素 亚 碲 酸 钾 混 合 液 1ml, 蒸 馏 水 1L 将 前 8 种 成 分 放 入 玻 璃 或 搪 瓷 容 器 内 ( 严 禁 用 铝 制 容 器 等 金 属 容 器 ), 加 入 蒸 馏 水, 加 热 溶 解 混 合 后, 调 整 至 ph8.0, 然 后 按 1.2% 加 入 琼 脂, 煮 沸 至 琼 脂 溶 化 后, 冷 至 60 左 右, 按 每 100ml 琼 脂 加 入 庆 大 霉 素 亚 碲 酸 钾 混 合 液 (1ml U 庆 大 霉 素 加 79ml 蒸 馏 水 混 合 后, 加 入 0.8g 亚 碲 酸 钾 溶 解 混 合 即 成, 每 毫 升 含 500 U 庆 大 霉 素 和 10g/L 亚 碲 酸 钾 )0.1ml, 摇 匀, 倾 注 平 板 取 待 检 标 本 划 线 接 种 平 板, 置 35 培 养 过 夜 8h 后 即 可 初 步 观 察 结 果 24h 培 养 后, 霍 乱 弧 菌 呈 中 心 黑 色 较 大 而 扁 平 的 菌 落 配 成 的 培 养 基 呈 亮 黄 色 透 明 ;EL-Tor 弧 菌 稻 叶 型 生 长 良 好 ;EL-Tor 弧 菌 小 川 型 生 长 良 好 ; 大 肠 埃 希 菌 ATCC25922 抑 制 生 长 ⑴ 庆 大 和 亚 碲 酸 钾 混 合 液 应 新 鲜 配 制 并 置 冰 箱 保 存 ⑵ 雷 佛 奴 尔 应 避 光 保 存, 而 且 每 批 均 应 预 试 后 方 可 使 用 成 品 培 养 基 应 避 光 保 存 ( 二 ) 肠 杆 菌 分 离 培 养 基 1. 中 国 蓝 琼 脂 分 离 肠 道 菌 的 弱 选 择 性 培 养 基 肉 膏 汤 琼 脂 (ph7.4)1l,10g/l 中 国 蓝 溶 液 ( 灭 菌 )10ml, 乳 糖 10g,10g/L 蔷 薇 红 酸 乙 醇 溶 液 10ml 取 乳 糖 10g 置 于 已 灭 菌 的 肉 膏 汤 琼 脂 瓶 内, 加 热 溶 解 琼 脂 并 混 匀 待 冷 却 至 50 左 右, 加 入 中 国 蓝 蔷 薇 红 酸 乙 醇 溶 液 混 匀, 立 即 倾 注 平 板, 凝 固 后 备 用

11 将 标 本 接 种 平 板, 置 35 18~24h 分 解 乳 糖 产 酸 的 细 菌, 其 菌 落 呈 蓝 色 ; 不 分 解 乳 糖 的 细 菌, 菌 落 为 淡 红 色 的 透 明 菌 落 大 肠 埃 希 菌 ATCC 菌 落 呈 蓝 色 ; 痢 疾 志 贺 菌 Ⅰ 型 ATCC 和 鼠 伤 寒 沙 门 菌 ATCC 菌 落 呈 淡 红 色 4 冰 箱 保 存,1 周 内 用 完 (1) 中 国 蓝 溶 液 需 煮 沸 或 115 灭 菌 15min 后 应 用 蔷 薇 红 酸 乙 醇 溶 液 无 需 灭 菌, 但 加 热 时 应 避 开 火 焰 (2) 蔷 薇 红 酸 能 抑 制 革 兰 阳 性 细 菌 生 长, 但 对 大 肠 埃 希 菌 没 有 抑 制 作 用, 标 本 接 种 量 不 宜 太 多 (3) 此 培 养 基 ph 7.4, 应 呈 淡 红 色 若 过 碱 呈 鲜 红 色, 过 酸 则 呈 蓝 色, 均 不 适 用 2. 木 糖 赖 氨 酸 去 氧 胆 酸 盐 (XLD) 培 养 基 为 肠 道 菌 选 择 性 培 养 基 酵 母 浸 膏 3g,L- 赖 氨 酸 5g, 氯 化 钠 5g,D- 木 糖 3.75g, 乳 糖 7.5g, 蔗 糖 7.5g, 去 氧 胆 酸 钠 2.5g, 硫 代 硫 酸 钠 6.8g, 枸 橼 酸 铁 铵 0.8g, 琼 脂 13.5g,1% 酚 红 溶 液 8ml, 蒸 馏 水 1L 将 上 述 成 分 ( 酚 红 除 外 ) 混 合, 加 热 溶 解, 校 正 ph 至 7.2, 再 加 入 酚 红 溶 液 混 匀 121 高 压 灭 菌 15min, 倾 注 平 板 备 用 将 标 本 划 线 接 种 平 板, 置 35 培 养 18~24h 大 肠 埃 希 菌 肠 杆 菌 属 克 雷 伯 菌 属 枸 橼 酸 杆 菌 属 细 菌 可 形 成 黄 色 不 透 明 菌 落 ; 大 多 数 沙 门 菌 属 细 菌 因 不 利 用 糖 类, 为 半 透 明 红 色 或 无 色 菌 落 大 肠 埃 希 菌 呈 黄 色 菌 落 ; 宋 内 志 贺 菌 呈 无 色 菌 落 ; 伤 寒 沙 门 菌 呈 红 色 菌 落 有 黑 心 ; 金 黄 色 葡 萄 球 菌 抑 制 生 长 贮 存 于 4 有 效 期 5 天 3.SS 琼 脂 沙 门 菌 属 和 志 贺 菌 属 (Salmonella-Shigella) 的 分 离 培 养 月 示 胨 5g, 牛 肉 膏 5g, 乳 糖 10g, 琼 脂 15~20g, 胆 盐 (No.3)3.5g, 枸 橼 酸 钠 8.5g, 硫 代 硫 酸 钠 8.5g, 枸 橼 酸 铁 1g,1% 中 性 红 溶 液 2.5ml,0.1% 煌 绿 溶 液 0.33ml, 蒸 馏 水 1L 将 上 述 成 分 ( 除 中 性 红 煌 绿 外 ) 混 合 于 水 中, 加 热 煮 沸 溶 解, 校 正 ph 至 7.0~7.1, 然 后 加 入 中 性 红 和 煌 绿 溶 液, 充 分 混 匀 冷 却 至 50 时 倾 注 平 板

12 将 标 本 接 种 平 板, 置 35 培 养 18~24h 沙 门 菌 属 菌 落 呈 无 色 半 透 明, 产 生 硫 化 氢 者 菌 落 中 心 呈 黑 色 ; 志 贺 菌 属 的 菌 落 呈 无 色 半 透 明 ; 大 肠 菌 属 呈 红 色 浑 浊 ; 宋 内 志 贺 菌 能 延 缓 发 酵 乳 糖, 培 养 24h 后 可 以 出 现 红 色 菌 落 肠 道 致 病 菌 的 菌 落 直 径 均 可 达 1.5mm 以 上 大 肠 埃 希 菌 菌 落 呈 红 色 ; 痢 疾 志 贺 Ⅰ 型 福 氏 志 贺 菌 和 伤 寒 沙 门 菌 生 长 良 好, 菌 落 无 色 ; 肠 炎 或 猪 霍 乱 沙 门 菌 菌 落 呈 黑 色 ; 粪 肠 球 菌 金 黄 色 葡 萄 球 菌 不 生 长 避 光,3 天 内 用 完 煌 绿 要 新 配, 中 性 红 要 优 质 4. 麦 康 凯 琼 脂 麦 康 凯 琼 脂 (Maconkey agar) 用 于 肠 道 致 病 菌 的 分 离 培 养 和 非 发 酵 细 菌 鉴 别 蛋 白 胨 20g, 氯 化 钠 5g, 胆 盐 ( 猪 牛 羊 )5g, 乳 糖 10g, 琼 脂 15~20g,1% 中 性 红 溶 液 5ml, 蒸 馏 水 1L 将 上 述 成 分 ( 除 中 性 红 外 ) 称 量 加 入 水 中, 加 热 溶 解, 校 正 ph 至 7.2, 加 入 中 性 红 溶 液, 分 装 灭 菌 min, 冷 却 至 50 左 右 时 倾 注 平 板 取 标 本 或 增 菌 培 养 物 接 种 平 板, 置 35 培 养 18~24h 不 发 酵 乳 糖 的 肠 道 细 菌 呈 无 色 菌 落, 直 径 约 2.0mm 左 右, 光 滑 半 透 明 大 肠 埃 希 菌 菌 落 呈 桃 红 色 ; 痢 疾 志 贺 菌 菌 落 呈 无 色 ; 伤 寒 沙 门 菌 菌 落 无 色 ; 金 黄 色 葡 萄 球 菌 不 生 长 置 4 冰 箱 ( 避 光 ),1 周 内 用 完 非 发 酵 细 菌 在 该 平 板 上 是 否 生 长, 是 临 床 鉴 定 某 些 非 发 酵 细 菌 的 指 标 之 一 5. 伊 红 美 蓝 琼 脂 用 于 肠 道 致 病 菌 及 大 肠 菌 群 分 离 培 养 蛋 白 胨 10g, 乳 糖 10g, 磷 酸 氢 二 钾 2g,20g/L 伊 红 Y 溶 液 20ml,6.5g/L 美 蓝 溶 液 10ml, 琼 脂 17g, 蒸 馏 水 1L 将 蛋 白 胨 磷 酸 盐 琼 脂 称 量 混 合 于 水 中, 并 加 热 煮 沸 溶 解, 校 正 ph 至 7.1, 分 装 121 灭 菌 15min 备 用 临 用 时 加 热 溶 化 琼 脂 加 入 乳 糖, 冷 至 50~55 时 加 入 伊 红 和 美 蓝 溶 液, 摇 匀 倾 注 平 板 取 粪 便 标 本 或 增 菌 培 养 物 接 种 平 板, 置 35 培 养 18~24h 根 据 检 验 目 的 不 同, 挑 取 无 色 菌 落 或 挑 选 紫 红 色 及 有 金 属 光 泽 的 菌 落 转 种 克 氏 双 糖 或 三 糖 铁 琼 脂 进 行 鉴 定

13 大 肠 埃 希 菌 菌 落 呈 紫 红 色, 有 时 有 金 属 光 泽, 直 径 >2.3mm; 伤 寒 沙 门 菌 菌 落 呈 灰 白 色, 直 径 >1.8mm; 金 黄 色 葡 萄 球 菌 不 生 长 置 4 冰 箱,1 周 内 用 完 6. 克 氏 双 糖 铁 琼 脂 克 氏 双 糖 铁 琼 脂 (Kliger iron agar) 用 于 肠 杆 菌 科 细 菌 的 初 步 鉴 定 蛋 白 胨 20g, 牛 肉 膏 3g, 酵 母 膏 3g, 乳 糖 10g, 葡 萄 糖 1g, 氯 化 钠 50g, 枸 橼 酸 铁 铵 0.5g, 硫 代 硫 酸 钠 0.5g,0.2% 酚 红 溶 液 5ml, 琼 脂 12ml, 蒸 馏 水 1L 将 前 8 种 成 分 称 量 混 合 于 水 中, 加 热 溶 解, 校 正 ph 至 7.5, 再 加 入 琼 脂 和 酚 红 溶 液, 煮 沸 溶 解 分 装 试 管, 每 管 4ml, 经 115 灭 菌 20min, 立 即 制 成 高 层 斜 面, 待 凝 固 后 经 无 菌 试 验 备 用 取 待 检 菌 纯 培 养 物, 用 接 种 针 作 底 层 穿 刺 和 斜 面 划 线 接 种, 置 35 培 养 18~24h, 观 察 结 果 斜 面 变 黄, 底 层 变 黄, 产 气 者 或 不 产 气 者 多 属 大 肠 埃 希 菌 群 及 发 酵 乳 糖 的 菌 株 斜 面 变 红, 底 层 变 黄, 为 不 发 酵 乳 糖 菌 株 产 硫 化 氢 菌 株 可 使 底 层 或 全 管 产 生 黑 色 反 应 奇 异 变 形 杆 菌 K/A 硫 化 氢 阳 性 ; 大 肠 埃 希 菌 A/A; 志 贺 痢 疾 杆 菌 K/A; 伤 寒 沙 门 菌 K/A 硫 化 氢 阳 性 ; 铜 绿 假 单 胞 菌 K/K 置 4 冰 箱,2 周 内 用 完 该 培 养 基 ph 值 尤 为 重 要,pH7.5 时 使 用 效 果 最 佳 7. 三 糖 铁 琼 脂 用 于 肠 杆 菌 科 细 菌 初 步 生 化 鉴 定 蛋 白 胨 15g, 月 示 胨 5g, 牛 肉 膏 3g, 酵 母 膏 3g, 乳 糖 10g, 蔗 糖 10g, 葡 萄 糖 1g, 氯 化 钠 5g 硫 酸 亚 铁 2g/L, 硫 代 硫 酸 钠 0.3g,0.2% 酚 红 溶 液 5ml, 琼 脂 12g, 蒸 馏 水 1L 将 前 10 种 成 分 称 量 混 合 于 水 中, 加 热 溶 解 后 校 正 ph 至 7.4, 再 加 琼 脂 及 酚 红 溶 液, 加 热 煮 沸 溶 解 分 装 试 管, 每 管 4ml, 经 115 灭 菌 20min, 立 即 置 高 层 斜 面, 待 凝 固 后, 经 无 菌 试 验 备 用 取 待 检 菌 纯 培 养 物, 用 接 种 针 作 底 层 穿 刺 和 斜 面 划 线 接 种, 置 35 培 养 18~24h 观 察 结 果 发 酵 乳 糖 或 蔗 糖 的 菌 可 使 斜 面 及 底 层 均 变 黄 色 不 发 酵 乳 糖 和 蔗 糖 的 细 菌 仅 发 酵 葡 萄 糖 时 使 底 层 变 黄, 斜 面 变 红 产 生 硫 化 氢 的 菌 株 可 使 底 层 或 整 个 培 养 基 呈 黑 色 分 解 乳 糖 或 蔗 糖 后 产 气 时 有 些 菌 株 还 能 使 培 养 基 断 裂 伤 寒 沙 门 菌 K/A, 硫 化 氢 阳 性 ; 副 伤 寒 沙 门 菌 K/A, 硫 化 氢 阳 性 ; 痢 疾 志 贺 菌 K/A; 大 肠 埃 希 菌 A/A; 普 通 变 形 杆 菌 A/A, 硫 化 氢 阳 性 ; 铜 绿 假 单 胞 菌 K/K

14 置 4 冰 箱,2 周 内 用 完 该 培 养 基 ph 7.5 时 使 用 效 果 最 佳 8. 山 梨 醇 麦 康 凯 琼 脂 用 于 致 病 性 侵 袭 性 和 产 毒 性 大 肠 埃 希 菌 分 离 培 养 蛋 白 胨 5g, 月 示 胨 3g, 氯 化 钠 5g, 胆 盐 ( 猪 牛 羊 )5g, 山 梨 醇 10g, 琼 脂 粉 12g,0.1g/L 结 晶 紫 溶 液 1ml,5g/L 中 性 红 溶 液 5ml, 蒸 馏 水 1L 将 前 4 种 成 分 混 合 于 水 中, 加 热 溶 解, 校 正 ph 至 7.2, 再 加 入 琼 脂 粉 加 热 煮 沸 溶 解 分 装 三 角 烧 瓶 100ml 经 min 灭 菌 备 用 临 用 时, 加 热 溶 解, 再 加 山 梨 醇 结 晶 紫 及 中 性 红 溶 液, 摇 匀 倾 注 平 板 将 标 本 或 增 菌 液 接 种 平 板, 置 35 培 养 18~24h 与 麦 康 凯 琼 脂 不 同 之 处 是 挑 取 致 病 性 大 肠 埃 希 菌 菌 落 时, 以 无 色 菌 落 为 主, 同 时 兼 取 红 色 菌 落, 如 EPEC 迟 缓 分 解 山 梨 醇, 菌 落 呈 红 色 EHEC O157:H7 菌 落 无 色 参 照 麦 康 凯 琼 脂 置 4 冰 箱,1 周 内 用 完 ( 三 ) 非 发 酵 细 菌 用 培 养 基 1. 金 氏 培 养 基 ( 甲 ) 金 氏 培 养 基 (Kings Medium) 用 于 检 测 假 单 胞 菌 产 生 的 青 脓 素 蛋 白 胨 20g, 无 水 氯 化 镁 1.4g, 无 水 硫 酸 钾 10g, 琼 脂 15g, 甘 油 10ml, 蒸 馏 水 1L 将 上 述 成 分 加 热 溶 解, 调 ph 至 7.2, 分 装 试 管,118~121 灭 菌 15min, 制 成 斜 面 和 高 层 备 用 取 待 检 菌 划 种 于 上 述 斜 面 上,35 培 养 过 夜 观 察 斜 面 上 产 色 素 情 况 2. 氧 化 - 发 酵 试 验 培 养 基 用 于 检 测 细 菌 代 谢 类 型 (1)Hugh-Leifson 培 养 基 ( 革 兰 阴 性 杆 菌 用 ): 蛋 白 胨 2g, 葡 萄 糖 10g, 磷 酸 氢 二 钾 0.3g, 氯 化 钠 5g, 溴 麝 香 草 酚 蓝 (BTB)0.03g, 琼 脂 2.5g, 蒸 馏 水 1L (2) 葡 萄 球 菌 O/F( 葡 萄 球 菌 和 微 球 菌 鉴 别 用 ): 胰 蛋 白 胨 10g, 酵 母 浸 膏 10g, 琼 脂 20g, 溴 甲 酚 紫 0.001g, 蒸 馏 水 1L, 葡 萄 糖 10g 将 上 述 成 分 混 合 加 热 溶 解, 调 ph 至 7.1, 分 装 于 试 管 中, 每 支 试 管 5ml, 高 压 灭 菌 min, 使 成 琼 脂 高 层, 备 用

15 从 斜 面 上 挑 取 少 许 培 养 物, 同 时 穿 刺 接 种 两 支 培 养 基, 其 中 一 支 接 种 后, 滴 加 液 体 石 蜡 于 培 养 基 表 面, 高 度 约 1cm 置 35 孵 箱 培 养 24~48h 培 养 基 变 黄 表 示 细 菌 分 解 葡 萄 糖 而 产 酸, 颜 色 不 变 为 不 分 解 葡 萄 糖 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ATCC 大 肠 埃 希 菌 ATCC 发 酵 型 ; 铜 绿 假 单 胞 菌 ATCC 氧 化 型 ; 易 变 微 球 菌 粪 产 碱 杆 菌 不 利 用 (1) 有 些 细 菌 不 能 在 上 述 培 养 基 上 生 长, 需 在 该 培 养 基 中 加 入 2% 血 清 或 10g/L 酵 母 浸 膏, 重 做 试 验 (2) 指 示 剂 不 能 用 乙 醇 配 制, 因 有 些 细 菌 可 使 乙 醇 产 酸, 导 致 发 酵 或 氧 化 反 应 影 响 结 果 判 断 ( 四 ) 其 它 革 兰 阴 性 杆 菌 用 培 养 基 1. 军 团 菌 培 养 基 缓 冲 活 性 炭 酵 母 琼 脂 培 养 基 (BCYE) 用 于 嗜 肺 军 团 菌 的 分 离 培 养 酵 母 浸 液 10g, 活 性 (NoritSG)2g,L- 半 胱 氨 酸 盐 酸 盐 0.4g, 可 溶 性 焦 磷 酸 铁 盐 0.25g, 琼 脂 17g,N-2- 乙 酰 氨 基 - 乙 氨 基 乙 醇 磺 酸 (ACES)10g, 蒸 馏 水 80ml 上 述 成 分 除 半 胱 氨 酸 及 焦 磷 酸 铁 外, 其 余 成 分 混 合 加 热 溶 解, 经 min 灭 菌, 放 水 浴 中 冷 却 到 50 另 外 分 别 配 新 鲜 L- 半 胱 氨 酸 溶 液 (10ml 蒸 馏 水 中 含 0.4g) 及 焦 磷 酸 铁 溶 液 (10ml 含 0.25g), 分 别 过 滤 除 菌, 再 加 入 已 灭 菌 琼 脂 中, 加 入 1mol/L 氢 氧 化 钾 溶 液 4~5ml 使 培 养 基 的 最 终 ph 为 6.9~7.0, 可 用 1mol/L 盐 酸 溶 液 校 正, 倾 注 平 板, 冷 却 后 置 4 冰 箱 备 用, 亦 可 制 成 斜 面, 用 于 保 存 菌 种 该 培 养 基 为 黑 色 液 体 标 本 可 直 接 接 种 培 养 基, 肺 肝 脾 等 固 体 标 本 须 制 成 100g/L 悬 液 后 再 接 种 培 养 基, 接 种 后 的 培 养 基 置 35 需 氧 环 境 培 养, 培 养 箱 需 保 持 一 定 的 湿 度 每 天 用 解 剖 镜 检 查 平 板 培 养 物, 用 略 大 于 10 0 角 的 斜 射 光 源 照 明 在 BCYE 平 板 上, 培 养 4~5 天, 菌 落 直 径 约 1~2mm, 并 出 现 亮 蓝 和 切 削 玻 璃 样 的 构 造 ; 继 续 培 养 后 菌 落 增 大 呈 黄 绿 色, 较 光 滑 在 室 温 暗 室 中 可 保 存 1 周 2. 弯 曲 菌 选 择 性 培 养 基 (1)Skirrow s 培 养 基 用 于 空 弯 及 幽 门 螺 杆 菌 分 离 培 养 蛋 白 胨 5g, 胰 蛋 白 胨 5g, 酵 母 膏 5g, 氯 化 钠 5g, 琼 脂 粉 12g, 万 古 霉 素 10ml, 多 粘 菌 素 B 2500U,TMP 5mg, 脱 纤 维 羊 血 70ml, 蒸 馏 水 930ml 除 血 和 抗 生 素 外, 其 余 成 分 混 合 于 水 中, 加 热 溶 解, 调 ph 至 7.2,121 灭 菌 15min 待 冷 至 50 时 加 入 羊 血 7ml 和 多 抗 液 0.5ml, 摇 匀, 倾 注 无 菌 平 板

16 将 标 本 接 种 平 板, 置 25 或 43 微 需 氧 环 境 中 培 养 48h, 菌 落 直 径 达 1~2mm, 为 不 溶 血 的 菌 落 大 肠 埃 希 菌 ATCC 和 粪 肠 球 菌 ATCC 不 生 长 ; 空 肠 弯 曲 菌 胎 儿 亚 种 ATCC 生 长 良 好 1) 多 抗 液 的 配 制 :1 乳 酸 62mg( 约 2 滴 ) 加 入 100ml 灭 菌 水 中, 然 后 加 入 TMP100 mg, 混 合 加 热 100 灭 菌 2 取 1 液 5ml, 再 加 万 古 霉 素 100mg 和 多 粘 菌 素 B 0.38mg, 摇 匀 后 即 可 2) 弯 曲 菌 属 系 微 需 氧 菌, 培 养 时 可 提 供 5% 氧 气 及 10% 二 氧 化 碳 高 浓 度 氧 不 利 于 细 菌 生 长, 尤 其 是 幽 门 螺 杆 菌 因 此 标 本 采 集 后, 应 尽 快 接 种 培 养, 或 置 运 送 培 养 基 中 运 送 3) 弯 曲 菌 运 送 可 用 布 氏 菌 汤 培 养 基 ⑵ Campy-BAP 培 养 基 用 于 分 离 培 养 弯 曲 菌 蛋 白 胨 10g, 胰 胨 10g, 葡 萄 糖 10g, 酵 母 浸 膏 3g, 氯 化 钠 5g, 重 亚 硫 酸 钠 0.1g, 蒸 馏 水 900ml, 脱 纤 维 羊 血 100ml, 万 古 霉 素 10mg, 多 粘 菌 素 B U,TMP 5mg, 两 性 霉 素 B 2mg 将 上 述 成 分 ( 除 羊 血 和 抗 菌 补 充 剂 外 ), 加 入 900ml 蒸 馏 水, 加 热 溶 解, 调 ph 至 7.2 后 分 装,121 灭 菌 15min, 加 入 羊 血 和 抗 菌 药 物 添 加 剂, 充 分 混 匀 后 倾 注 于 无 菌 平 皿 内 取 标 本 接 种 于 平 板, 置 25 或 43 微 需 氧 环 境 中 培 养 48h, 菌 落 直 径 达 1~2 mm, 不 溶 血 大 肠 埃 希 菌 ATCC 不 生 长 ; 粪 肠 球 菌 ATCC 不 生 长 ; 空 肠 弯 曲 菌 胎 儿 亚 种 ATCC 生 长 良 好 第 五 节 生 化 试 验 培 养 基 一 糖 发 酵 试 验 培 养 基 1. 糖 醇 发 酵 试 验 培 养 基 检 查 细 菌 对 不 同 糖 ( 醇 ) 类 的 发 酵 能 力, 达 到 鉴 定 细 菌 的 目 的 蛋 白 胨 10g, 牛 肉 膏 3g, 氯 化 钠 5g, 安 德 烈 (Andrade) 指 示 剂 10ml, 蒸 馏 水 1L, 各 种 糖 ( 醇 ) 类 5~10g 将 上 述 成 分 混 合 后, 加 热 溶 解 矫 正 ph 至 7.2 根 据 需 要, 分 别 再 加 相 应 的 糖 和 醇 分 装 于 13mm 100mm 的 试 管, 每 管 约 3ml,115 灭 菌 15min 如 需 观 察 产 气, 可 在 试 管 内 加 小 倒 管 1 只 将 分 离 的 纯 菌 接 种 到 糖 ( 醇 ) 发 酵 管 中, 置 35 培 养 18~24h 接 种 菌 若 能 分 解 培 养 基 中 的 糖 ( 醇 ) 类 而 生 成 酸, 使 指 示 剂 呈 酸 性 反 应, 若 产 生 气 体, 则 可 使 液 体 培 养 基 中 的 倒 管 (Durham 管 ) 内 出 现 气 泡 ; 若 接 种 菌 不 分 解 糖 ( 醇 ) 则 无 反 应 2. 血 清 菊 糖 试 验 培 养 基

17 用 于 肺 炎 链 球 菌 与 其 它 链 球 菌 鉴 别 血 清 ( 兔 血 清 或 牛 血 清 )25ml,1g/L 酚 红 溶 液 2ml, 菊 糖 1g, 蒸 馏 水 75ml 先 取 血 清 25ml 蒸 馏 水 75ml 混 合, 置 阿 诺 灭 菌 器 内 加 热 15min, 以 破 坏 血 清 内 的 淀 粉 酶 调 ph 至 7.4, 然 后 加 入 菊 糖 1.0g 1g/L 酚 红 溶 液 2ml 摇 匀 分 装 于 13mm 100mm 的 试 管, 每 管 2ml 用 间 歇 灭 菌 法 灭 菌, 每 天 1 次, 连 续 3 天, 每 次 20min 将 被 检 菌 接 种 培 养 基, 置 35 培 养 18~24h 分 解 菊 糖 的 菌 株 使 培 养 基 变 黄 ; 不 分 解 菊 糖 的 菌 株, 培 养 基 不 变 色 肺 炎 链 球 菌 ATCC 阳 性 ; 化 脓 性 链 球 菌 ATCC 阴 性 3. 胆 汁 七 叶 苷 试 验 培 养 基 蛋 白 胨 5g, 牛 肉 浸 膏 3g, 牛 胆 汁 40g, 七 叶 苷 1g, 枸 橼 酸 铁 0.5g, 琼 脂 15g, 蒸 馏 水 1L 将 上 述 成 分 混 合 加 热 溶 解, 调 ph 至 7.2, 分 装 试 管,115 灭 菌 15min 将 待 测 菌 种 接 种 到 七 叶 苷 培 养 基 的 斜 面 上, 置 35 孵 育 18~24h, 观 察 结 果 培 养 基 变 为 黑 色 或 棕 色 者 为 阳 性 ; 不 变 色 者 为 阴 性 粪 肠 球 菌 ATCC 阳 性 ; 化 脓 性 链 球 菌 ATCC 阴 性 置 4 冰 箱,2 周 内 用 完 二 酶 类 测 定 培 养 基 和 试 剂 1. 氨 基 酸 脱 羧 酶 试 验 培 养 基 检 查 细 菌 使 氨 基 酸 脱 羧 基 形 成 胺 使 培 养 基 变 碱 的 能 力 常 用 的 氨 基 酸 有 赖 氨 酸 鸟 氨 酸 和 精 氨 酸 蛋 白 胨 5g, 牛 肉 浸 膏 5g, 溴 甲 酚 紫 0.1g, 甲 酚 红 0.005g, 吡 多 醛 (VB6)0.005g, 葡 萄 糖 0.5g, 蒸 馏 水 1L 加 热 慢 慢 溶 解, 按 10g/L 浓 度 加 入 所 需 要 的 氨 基 酸, 调 ph 至 6.0, 呈 深 亮 紫 色 分 装 每 支 2ml, 同 时 配 对 照 管 ( 不 加 氨 基 酸 ), 高 压 灭 菌 min, 冷 却 后 4 冷 藏 备 用 将 试 验 菌 接 种 培 养 基, 同 时 接 种 对 照 管 1 支 并 用 灭 菌 的 液 体 石 蜡 覆 盖, 置 35 培 养 18~24h 阳 性 菌 初 期 由 于 细 菌 发 酵 葡 萄 糖 产 酸 呈 黄 色, 若 继 续 孵 育, 氨 基 酸 经 脱 羧 产 生 胺 类 使 培 养 基 变 碱, 指 示 剂 改 变 颜 色, 呈 紫 色 或 紫 红 色 阴 性 呈 黄 色 或 不 变 色 赖 氨 酸 脱 羧 酶 : 迟 缓 爱 德 华 菌 阳 性, 弗 劳 地 枸 橼 酸 菌 阴 性 ; 鸟 氨 酸 脱 羧 酶 : 产 气 肠 杆 菌 阳 性, 弗 劳 地 枸 橼 酸 菌 阴 性 ; 精 氨 酸 脱 羧 酶 : 鼠 伤 寒 沙 门 菌 阳 性, 普 通 变 形 杆 菌 阴 性 2. 耐 热 DNA 酶 培 养 基

18 用 于 检 测 细 菌 所 产 生 的 耐 热 脱 氧 核 糖 核 酸 酶 胰 蛋 白 胨 1.5g, 植 物 蛋 白 胨 0.5g, 氯 化 钠 0.5g,DNA 2g/L, 琼 脂 1.5g, 蒸 馏 水 100ml,2g/L 甲 苯 胺 蓝 溶 液 0.25ml 将 前 6 种 成 分 徐 徐 加 热 溶 解 后, 调 ph 至 7.4, 加 入 甲 苯 胺 蓝 溶 液, 分 装 试 管, 121 灭 菌 15min 后 备 用 上 述 琼 脂 倾 注 于 载 玻 片 上, 凝 固 后, 打 孔, 孔 径 2cm, 孔 内 加 入 经 min 隔 水 加 热 处 理 后 的 肉 汤 培 养 物 将 载 玻 片 孵 育 于 35 湿 盒 内 4h, 取 出 观 察 结 果 阳 性 反 应 在 孔 周 围 出 现 不 小 于 4mm 直 径 粉 红 色 圈, 阴 性 反 应 培 养 基 的 颜 色 无 改 变 金 黄 色 葡 萄 球 ATCC 阳 性 ; 表 皮 葡 萄 球 菌 ATCC 阴 性 3.DNA 酶 试 验 培 养 基 供 细 菌 DNA 酶 测 定 用 DNA 2g, 胰 酪 胨 15g, 大 豆 胨 5g, 氯 化 钠 5g, 琼 脂 20g, 蒸 馏 水 1L 将 5 种 成 分 混 合 于 蒸 馏 水 中, 加 热 溶 解, 校 正 ph 至 7.2~7.4, 分 装 三 角 烧 瓶, 经 115 灭 菌 15min, 倾 注 灭 菌 平 皿,4 冷 藏 备 用 将 待 检 菌 作 点 状 穿 种 在 平 板 上, 置 35 培 养 24h 待 细 菌 生 长 成 集 落 菌 苔 后, 在 其 菌 苔 上 及 周 围 滴 加 0.1mol/L 盐 酸 溶 液 数 毫 升, 待 片 刻 后, 如 待 检 菌 DNA 酶 阳 性, 可 在 菌 苔 的 周 围 出 现 明 显 的 透 明 圈 ; 而 阴 性 者 则 无 透 明 圈 出 现 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ATCC 和 粘 质 沙 雷 菌 ATCC 274 阳 性 ; 表 皮 葡 萄 球 菌 ATCC 和 大 肠 埃 希 菌 ATCC 阴 性 置 4 冰 箱 1 周 内 用 完 4. 氧 化 酶 试 验 区 别 假 单 胞 菌 与 氧 化 酶 阴 性 的 肠 杆 菌 科 细 菌 盐 酸 二 甲 基 对 苯 二 胺 ( 或 四 甲 基 对 苯 二 胺 )0.1g 加 蒸 馏 水 10ml 取 白 色 洁 净 滤 纸 一 角, 沾 取 试 验 菌 落 少 许, 加 试 剂 一 滴 阳 性 者 立 即 显 粉 红 色, 并 于 5~10s 内 呈 现 深 紫 色 反 应 若 用 四 甲 基 对 苯 二 胺 则 阳 性 为 蓝 色 铜 绿 假 单 胞 菌 ATCC 阳 性 ; 大 肠 埃 希 菌 ATCC25922 阴 性

19 置 棕 色 瓶 内 可 用 一 周,4 冰 箱 保 存, 或 分 装 于 棕 色 瓶 内 密 封 5. 尿 素 酶 试 验 培 养 基 用 于 细 菌 尿 素 酶 测 定 蛋 白 胨 1g, 葡 萄 糖 1g, 氯 化 钠 5g, 磷 酸 二 氢 钾 2g,4g/L 酚 红 溶 液 3ml, 琼 脂 18~20g,200/L 尿 素 溶 液 100ml, 蒸 馏 水 1L 将 前 5 种 成 分 混 合 于 蒸 馏 水 中, 加 热 溶 解, 校 正 ph 至 7.0, 然 后 加 入 酚 红 溶 液, 分 装 每 瓶 100ml, 经 121 灭 菌 15min 备 用 临 用 时, 加 热 溶 解, 冷 却 至 55 左 右, 加 入 无 菌 的 尿 素 溶 液 10ml, 摇 匀 立 即 无 菌 分 装 于 灭 菌 试 管, 每 支 2ml, 并 置 成 斜 面 经 无 菌 试 验 后 备 用 取 培 养 物 接 种 斜 面,35 孵 育 24h 尿 素 酶 阳 性 者 斜 面 变 红 色, 阴 性 者 颜 色 无 变 化 普 通 变 形 杆 菌 ATCC 13315(8h) 整 个 培 养 基 变 红 肺 炎 克 雷 伯 菌 ATCC 仅 斜 面 变 红 (24h); 大 肠 埃 希 菌 ATCC 为 阴 性 (24h) 置 4 冰 箱,2 周 内 用 完 6. 磷 酸 酶 试 验 培 养 基 测 定 细 菌 产 生 磷 酸 酶 的 能 力 用 于 区 别 葡 萄 球 菌 有 无 致 病 性, 致 病 性 葡 萄 球 菌 呈 阳 性 还 有 助 于 克 雷 伯 菌 属 与 肠 杆 菌 属 的 鉴 定 含 磷 酸 酚 酞 的 营 养 琼 脂 培 养 基 将 上 述 琼 脂 加 热 溶 化, 待 冷 却 至 45 时, 加 入 滤 过 除 菌 的 10g/L 磷 酸 酚 酞 溶 液 1ml, 摇 匀 后 倾 注 平 板 接 种 待 测 菌 株,35 培 养 18~24h 在 平 皿 盖 上 滴 加 浓 氨 水 1 滴, 熏 蒸 片 刻 如 有 酚 酞 释 出, 菌 落 即 变 为 粉 红 色 为 阳 性 ; 不 变 色 为 阴 性 ⑴ 亦 可 用 液 体 法 进 行 试 验 : 经 培 养 后 在 培 养 基 内 滴 加 氢 氧 化 钠 溶 液, 观 察 结 果, 显 红 色 为 阳 性 ⑵ 以 上 为 酸 性 磷 酸 酶 的 试 验 方 法 如 果 作 碱 性 磷 酸 酶 试 验, 可 将 磷 酸 对 硝 基 酚 加 入 ph mol/L 的 甘 氨 酸 氢 氧 化 钠 缓 冲 液 内 观 察 结 果 时 不 必 另 行 加 碱 ⑶ 酚 酞 指 示 剂 产 生 的 颜 色 随 其 ph 而 变 化, 试 剂 的 量 要 准 确, 太 少 或 太 多 的 碱 均 可 引 起 假 阳 性 或 假 阴 性 结 果 7. 马 尿 酸 盐 试 验 培 养 基 测 定 细 菌 水 解 马 尿 酸 钠 能 力 该 培 养 基 常 用 方 法 有 2 种 ⑴ 三 氯 化 铁 法

20 马 尿 酸 钠 1g, 肉 汤 100ml 三 氯 化 铁 试 剂 : 三 氯 化 铁 12g 溶 于 2 % 盐 酸 100ml 中 将 马 尿 酸 钠 和 肉 汤 (ph 7.8) 加 热 溶 解 后 分 装 于 试 管 中, 每 管 4ml, 121 灭 菌 15min 冷 却 后 用 玻 璃 蜡 笔 记 录 培 养 基 液 面, 置 冰 箱 中 备 用 取 纯 菌 接 种 培 养 基,35 培 养 48h, 观 察 培 养 基 液 面 如 液 面 下 降 时 以 蒸 馏 水 补 充 之 离 心 沉 淀, 取 上 清 液 0.8ml 加 入 三 氯 化 铁 试 剂 0.2ml, 立 即 混 匀 经 10~30min 观 察 结 果, 出 现 稳 定 沉 淀 物 为 阳 性 反 之 为 阴 性 2. 茚 三 酮 法 : 甘 氨 酸 在 茚 三 酮 的 作 用 下, 经 氧 化 脱 氨 基 反 应, 生 成 氨 二 氧 化 碳 和 相 应 的 醛 而 茚 三 酮 则 生 成 还 原 型 茚 三 酮 反 应 过 程 中 形 成 的 氨 和 还 原 型 茚 三 酮, 与 残 留 的 茚 三 酮 起 反 应, 形 成 紫 色 化 合 物 8. 触 酶 试 验 培 养 基 用 于 链 球 菌 及 革 兰 阳 性 球 菌 初 步 分 群 ⑴ 玻 片 法 : 取 18~24h 培 养 物, 置 于 清 洁 玻 片 上, 加 1 滴 3% 过 氧 化 氢 溶 液, 如 产 生 大 量 气 泡 为 阳 性 ⑵ 试 管 法 : 取 琼 脂 斜 面 ( 不 含 血 液 的 )18~24h 培 养 物, 接 种 于 试 管 内, 加 入 3% 过 氧 化 氢 溶 液 1ml, 如 产 生 大 量 气 泡 为 阳 性 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ATCC 阳 性 ; 无 乳 链 球 菌 ATCC 阴 性 9.ß- 半 乳 糖 苷 (ONPG) 试 验 培 养 基 用 于 乳 糖 迟 缓 发 酵 菌 和 不 发 酵 菌 的 鉴 别 试 剂 甲 为 0.01mol/L ph7.0 磷 酸 氢 二 钠 缓 冲 液 100m1; 试 剂 乙 为 蛋 白 胨 3g, 氯 化 钠 1.5g, 蒸 馏 水 300m1,pH7.0 将 试 剂 甲 乙 分 别 置 121 灭 菌 15min, 冷 至 40~50 左 右, 试 剂 乙 加 入 0NPG 0.6g, 置 56 水 浴 中 加 热 溶 解, 无 菌 过 滤, 将 过 滤 液 与 试 剂 甲 液 合 并 分 装 试 管, 每 管 2m1, 做 无 菌 试 验 后 备 用 将 标 本 接 种 培 养 基,35 培 养 4~18h 培 养 基 呈 黄 色 者 为 阳 性, 不 变 黄 色 为 阴 性 大 肠 埃 希 菌 ATCC 阳 性 ; 普 通 变 形 杆 菌 ATCC l3315 阴 性 ONPG 溶 液 不 稳 定, 若 培 养 基 呈 黄 色 即 不 可 使 用 10. 苯 丙 氨 酸 试 验 培 养 基

21 苯 丙 氨 酸 脱 氨 酶 是 变 形 杆 菌 属 普 罗 威 登 斯 菌 属 和 摩 根 菌 属 所 特 有, 可 与 肠 杆 菌 科 及 其 它 细 菌 区 别 也 有 助 于 种 的 鉴 别, 如 苯 丙 酮 酸 莫 拉 菌 呈 阳 性, 其 它 莫 拉 菌 属 的 菌 种 呈 阴 性 DL- 苯 丙 氨 酸 2g, 氯 化 钠 5g, 酵 母 浸 膏 3g, 磷 酸 氢 二 钠 1g, 琼 脂 12g, 蒸 馏 水 1L 除 琼 脂 外 其 它 的 成 分 加 热 溶 解, 调 ph 至 7.3, 再 加 入 琼 脂 溶 解 后, 分 装, 每 管 约 4m1, 高 压 灭 菌 min, 置 成 斜 面, 凝 固 后 4 冰 箱 保 存, 备 用 取 18~24h 培 养 物, 大 量 接 种 于 培 养 基,35 孵 育 18~24h 后 在 培 养 试 管 中 加 入 100g/L 三 氯 化 铁 试 剂 4~5 滴, 转 动 使 试 剂 布 满 斜 面, 阳 性 者 呈 绿 色, 阴 性 者 呈 黄 色 普 通 变 形 杆 菌 ATCC l3315 阳 性 ; 大 肠 埃 希 菌 ATCC 阴 性 置 4 冰 箱 保 存,2 周 内 用 完 试 剂 可 保 存 3 月 (1) 苯 丙 氨 酸 试 验 须 在 加 入 三 氯 化 铁 试 剂 后 立 即 观 察, 因 绿 色 易 很 快 褪 去, 无 论 阳 性 或 阴 性 结 果 都 必 须 在 5min 内 作 出 判 断 (2) 将 斜 面 试 管 转 动, 让 三 氯 化 铁 试 剂 流 动, 可 使 反 应 较 快 颜 色 亦 较 明 显 11. 淀 粉 培 养 基 用 于 链 球 菌 和 白 喉 棒 状 杆 菌 的 分 型 鉴 定 蛋 白 胨 5g, 牛 肉 浸 膏 3g, 琼 脂 ( 肉 场 培 养 基 中 不 加 )20g, 氯 化 钠 5g, 蒸 馏 水 1L, 可 溶 性 淀 粉 20g, 小 牛 血 清 50ml 准 确 称 量 前 4 种 成 分 加 入 500ml 蒸 馏 水, 缓 慢 加 热 溶 解 制 成 基 础 培 养 基 再 将 20g 淀 粉 溶 于 250m1 蒸 馏 水 中 天 然 淀 粉 微 溶 于 水, 并 不 耐 热, 切 勿 煮 沸 过 度, 防 止 淀 粉 水 解 将 上 述 两 种 溶 液 合 并 混 匀, 补 足 水 至 ll, 调 ph 至 7.2,121 灭 菌 15min, 倾 注 平 板 备 用 附 :Lugol 碘 液 配 制 ⑴ 贮 存 液 : 将 碘 化 钾 10g 溶 于 100m1 蒸 馏 水 中, 缓 慢 加 入 5g 结 晶 碘 不 断 研 磨 振 荡 直 至 溶 解, 装 入 棕 色 瓶 中 ⑵ 应 用 液 : 用 蒸 馏 水 将 贮 存 液 1 5 稀 释, 分 装 于 棕 色 瓶 中, 每 隔 1 月 需 新 配 制 1 次, 溶 液 呈 深 黄 色 取 18~24h 纯 培 养 物 接 种 琼 脂 平 板, 一 般 可 接 种 几 个 培 养 物 置 35 孵 育 18~24h 或 者 直 至 出 现 足 够 的 生 长 物 将 Lugol 碘 液 直 接 加 到 孵 育 过 的 平 板 上, 培 养 基 呈 深 蓝 色, 菌 落 周 围 有 透 明 圈 为 阳 性, 菌 落 周 围 无 透 明 圈 为 阴 性 无 乳 链 球 菌 阳 性 ; 产 气 肠 杆 菌 阴 性

22 置 4 冰 箱 保 存,2 周 内 用 完 碘 液 易 于 褪 色, 使 用 前 应 进 行 质 量 控 制 ⑴ 倾 注 好 的 淀 粉 琼 脂 平 板 不 宜 放 冰 箱 中 保 存, 培 养 基 会 变 为 不 透 明, 可 影 响 结 果 判 断 建 议 将 培 养 基 置 螺 旋 帽 的 试 管 中 保 存, 临 用 时 加 热 溶 解 倾 注 平 板, 冷 却 后 使 用 ⑵ 淀 粉 酶 在 ph 低 于 4.5 时 不 稳 定 ⑶ 配 制 时, 避 免 过 热, 否 则 淀 粉 颗 粒 自 动 分 解 导 致 假 阳 性 结 果 ⑷ 培 养 时 间 应 不 少 于 36h 三 碳 源 和 氮 源 利 用 试 验 培 养 基 1. 粘 液 酸 利 用 试 验 培 养 基 用 于 无 动 力 不 产 气 不 发 酵 乳 糖 的 大 肠 埃 希 菌 与 志 贺 菌 属 的 鉴 别 前 者 多 数 为 阳 性, 后 者 均 为 阴 性 蛋 白 胨 10g, 粘 液 酸 10g, 蒸 馏 水 1L,2g/L 溴 麝 香 草 酚 蓝 溶 液 12ml 将 上 述 成 分 混 合 溶 解, 校 正 ph 为 7.4 分 装 试 管, 每 管 约 3~4m1, 经 121 灭 菌 15min,4 冷 存 备 用 取 试 验 菌 株 18~24h 肉 汤 培 养 物 1 环 接 种 培 养 基 35 孵 育 l~2 周, 每 天 观 察 结 果 培 养 基 呈 黄 色 为 阳 性, 表 明 细 菌 能 利 用 粘 液 酸 盐 ; 若 培 养 基 不 变 色 则 为 阴 性 大 肠 埃 希 菌 ATCC 阳 性 ; 痢 疾 志 贺 I 型 ATCC l3313 阴 性 2. 丙 二 酸 盐 试 验 培 养 基 主 要 用 于 下 述 菌 属 的 鉴 定 : 阳 性 菌 有 粪 产 碱 杆 菌 亚 利 桑 那 菌 克 雷 伯 菌 ; 阴 性 菌 有 不 动 杆 菌 属 沙 门 菌 属 放 线 菌 属 ; 特 别 是 枸 橼 酸 杆 菌, 用 于 属 内 种 的 鉴 定 如 弗 劳 地 异 型 枸 橼 酸 杆 菌 呈 阳 性, 而 丙 二 酸 盐 阴 性 枸 椽 酸 杆 菌 呈 阴 性 酵 母 浸 膏 1g, 硫 酸 铵 2g, 磷 酸 氢 二 钾 0.6g, 磷 酸 二 氢 钾 0.4g, 氯 化 钠 2g, 丙 二 酸 钠 3g, 葡 萄 糖 0.25g, 溴 麝 香 草 酚 蓝 0.025g, 蒸 馏 水 1L 将 上 述 成 分 溶 解 后 调 ph 至 6.7, 分 装 小 试 管, 每 管 3m1, 121 灭 菌 15min, 冷 却 后 置 冰 箱 保 存 取 纯 培 养 物 接 种 培 养 基 中,35 孵 育 24~48h 培 养 基 由 绿 色 变 蓝 色 为 阳 性, 培 养 基 为 绿 色 或 黄 色 ( 仅 葡 萄 糖 发 酵 产 酸 ) 为 阴 性 应 观 察 48h 方 可 报 告 肺 炎 克 雷 伯 菌 ATCC 阳 性 ; 丙 二 酸 盐 阴 性 杆 菌 阴 性 置 4 冰 箱,1 周 内 用 完 3. 醋 酸 盐 试 验 培 养 基

23 用 于 肠 杆 菌 科 的 鉴 定 醋 酸 盐 2g, 氯 化 钠 5g, 硫 酸 镁 2g/L, 磷 酸 氢 铵 1g, 磷 酸 氢 二 钾 1g, 琼 脂 20g, 蒸 馏 水 1L 将 上 述 成 分 加 热 溶 解, 校 正 ph 至 6.8, 然 后 加 2g/L 溴 麝 香 草 酚 蓝 溶 液 12ml,121 灭 菌 15min, 制 成 斜 面 备 用 将 试 验 菌 接 种 到 斜 面 上,35 培 养 7d, 每 天 观 察 1 次 培 养 基 由 绿 色 变 为 蓝 色 为 阳 性 大 肠 埃 希 菌 (ATCC 25922) 阳 性 ; 宋 内 氏 志 贺 菌 (ATCC ll060) 阴 性 置 4 冰 箱,2 周 内 用 完 ⑴ 试 验 菌 株 要 新 鲜 ⑵ 阴 性 菌 要 观 察 至 第 7 天, 方 可 报 告 4. 葡 萄 糖 酸 盐 试 验 培 养 基 帮 助 属 间 鉴 别 种 间 鉴 别 和 沙 雷 菌 属 菌 种 的 鉴 定 蛋 白 胨 1.5g, 磷 酸 氢 二 钾 1g, 酵 母 浸 膏 1g, 葡 萄 糖 酸 钾 40g, 或 葡 萄 糖 酸 钠 37.25g, 蒸 馏 水 1L 将 上 述 成 分 加 热 溶 解, 调 ph 至 7.0, 然 后 分 装 试 管, 每 管 2m1, 115 灭 菌 15min, 冷 却 备 用 取 待 检 菌 大 量 接 种 培 养 基,35 培 养 24~48h, 加 斑 氏 试 剂 1ml, 充 分 混 匀, 隔 水 加 热 煮 沸 10min, 观 察 结 果 产 生 黄 橙 色 沉 淀 为 阳 性, 蓝 色 沉 淀 为 阴 性 肺 炎 克 雷 伯 菌 ATCC 阳 性 ; 大 肠 埃 希 菌 ATCC 阴 性 5. 枸 橼 酸 盐 试 验 培 养 基 鉴 定 细 菌 对 枸 橼 酸 盐 及 无 机 铵 的 利 用 能 力 [ 配 法 1(Simmons)] 硫 酸 镁 0.2g, 磷 酸 二 氢 铵 1g, 磷 酸 氢 二 钾 1g, 枸 橼 酸 钠 5g, 琼 脂 20g, 氯 化 钠 5g,2g/L 溴 麝 香 草 酚 蓝 溶 液 40m1, 蒸 馏 水 1L(pH 6.8) [ 配 法 2(Christensen)] 枸 橼 酸 钠 3g, 葡 萄 糖 0.2g, 酵 母 浸 膏 0.5g, 盐 酸 半 胱 氨 酸 0.1g, 枸 橼 酸 铁 铵 0.4g, 磷 酸 氢 二 钾 1g, 硫 代 硫 酸 钠 0.08g, 氯 化 钠 5g, 酚 红 0.012g, 琼 脂 5g, 蒸 馏 水 ll(ph6.9) 先 将 盐 类 溶 解 于 水 内, 调 整 ph, 再 加 入 琼 脂, 加 热 溶 化 后, 加 入 指 示 剂, 混 合 均 匀 后 分 装 试 管, 高 压 灭 菌 min, 放 成 斜 面 将 待 检 菌 浓 密 地 划 线 接 种 在 上 述 斜 面 上, 于 35 培 养 1~4 天, 逐 日 观 察 结 果

24 Simmons( 西 蒙 ) 枸 橼 酸 盐 培 养 基 斜 面 上 有 细 菌 生 长, 培 养 基 由 绿 变 成 蓝 色 为 阳 性, 无 细 菌 生 长, 颜 色 不 变 蓝 色 为 阴 性 ;Christinsen( 柯 氏 ) 枸 橼 酸 盐 培 养 基 斜 面 呈 红 色 为 阳 性, 颜 色 不 变 为 阴 性 置 4 冰 箱,2 周 内 用 完 肺 炎 克 雷 伯 菌 阳 性 ; 大 肠 埃 希 菌 ATCC 阴 性 ⑴ 当 挑 取 同 一 培 养 物 接 种 一 组 生 化 试 验 管 时, 在 接 种 枸 椽 酸 盐 培 养 基 前, 接 种 针 或 环 要 用 火 焰 灭 菌, 或 先 接 种 枸 橼 酸 盐 培 养 基 因 培 养 基 上 若 存 在 葡 萄 糖 或 其 它 营 养 物 质 可 导 致 假 阳 性 ⑵ 接 种 时 菌 量 应 适 宜, 过 少 可 导 致 假 阴 性 结 果, 接 种 物 过 量 可 导 致 假 阳 性 结 果 ⑶ 通 常 培 养 24h 观 察 结 果, 但 有 些 枸 橼 酸 盐 阳 性 的 细 菌 则 需 孵 育 48h 以 上, 才 能 使 培 养 基 的 ph 变 化 6. 碳 源 利 用 试 验 培 养 基 测 定 细 菌 利 用 碳 源 的 能 力 磷 酸 氢 二 铵 0.5g, 磷 酸 二 氢 钾 1.3g, 磷 酸 氢 二 钠 3.2g, 硫 酸 钠 0.8g, 硝 酸 钠 1g, 待 测 物 质 2~10g, 蒸 馏 水 1L 将 各 成 分 溶 于 水 中, 校 正 ph 7.2, 分 装,116 灭 菌 15min 将 待 试 菌 制 成 低 浓 度 的 9g/L 氯 化 钠 溶 液 菌 悬 液, 接 种 培 养 基, 于 适 当 的 温 度 下 培 养 24~48h 若 有 细 菌 生 长 即 为 阳 性, 反 之 为 阴 性 菌 液 不 可 太 浓, 否 则 结 果 不 易 观 察 应 设 已 知 菌 阴 性 阳 性 对 照 可 用 多 种 细 菌 试 验 同 一 含 碳 化 合 物, 亦 可 用 多 种 含 碳 化 合 物 试 验 同 一 种 细 菌 ⑴ 使 用 的 含 碳 化 合 物 主 要 为 各 种 糖 类 和 有 机 酸 类 ⑵ 不 能 用 一 支 培 养 管 做 多 项 试 验 四 其 它 生 化 试 验 培 养 基 1. 硝 酸 盐 还 原 试 验 培 养 基 肠 杆 菌 科 细 菌 均 能 还 原 硝 酸 盐 为 亚 硝 酸 盐, 如 铜 绿 假 单 胞 菌 能 还 原 硝 酸 盐 并 可 产 生 氮 气 等, 而 有 些 细 菌 则 无 此 特 性, 故 可 以 此 鉴 别 蛋 白 胨 10g, 硝 酸 钾 ( 分 析 纯 )2g, 蒸 馏 水 1L 上 述 成 分 混 合 后, 加 热 溶 解, 校 正 ph 至 7.4 分 装 试 管 每 管 约 4m1,121 灭 菌 15min 后 备 用 附 : 试 剂 配 制 甲 液 : 对 氨 基 苯 磺 酸 0.8g,5mol/L 冰 醋 酸 100ml

25 乙 液 :ɑ- 萘 胺 0.5g,5mol/L 冰 醋 酸 溶 液 100m1 将 试 验 菌 接 种 培 养 基, 经 35 培 养 l~4 天, 每 天 吸 取 培 养 液 1ml, 加 入 液 甲 乙 试 剂 各 2 滴, 阳 性 者 立 刻 或 数 秒 钟 内 显 红 棕 色, 阴 性 则 不 变 色 大 肠 埃 希 茵 ATCC25922 阳 性 ; 硝 酸 盐 阴 性 不 动 杆 菌 ATCC15038 阴 性 ⑴ 因 亚 硝 酸 盐 在 自 然 界 中 分 布 很 广, 制 备 此 培 养 基 时 所 用 器 皿 均 要 清 洗 干 净 ⑵ 硝 酸 盐 试 验 很 敏 感, 未 接 种 的 硝 酸 盐 培 养 基 应 以 试 剂 进 行 检 查, 确 定 培 养 基 中 是 否 存 在 亚 硝 酸 盐, 从 而 排 除 假 阳 性 结 果 ⑶ 本 试 验 在 判 定 结 果 时, 必 须 在 加 试 剂 后 立 即 观 察, 否 则 可 因 培 养 液 迅 速 褪 色 而 影 响 判 定 ⑷ 沙 门 菌 属 假 单 胞 菌 属 的 某 些 菌 株, 不 但 能 还 原 硝 酸 盐 为 亚 硝 酸 盐, 而 且 还 能 使 亚 硝 酸 盐 继 续 分 解, 生 成 氨 和 氮 导 致 假 阴 性 结 果 ⑸ 若 加 入 硝 酸 盐 试 剂 不 出 现 红 色, 需 检 查 硝 酸 盐 是 否 被 还 原 可 于 原 试 管 内 再 加 入 少 许 锌 粉, 如 出 现 红 色 证 明 产 生 芳 基 肼, 表 示 硝 酸 盐 仍 然 存 在 ; 如 仍 不 产 生 红 色, 表 示 硝 酸 盐 已 被 还 原 为 氨 和 氮 亦 可 在 培 养 基 内 加 1 只 小 倒 管, 若 有 气 泡 产 生, 表 示 有 氮 气 生 成 可 以 排 除 假 阴 性 2. 亚 硝 酸 盐 还 原 试 验 培 养 基 测 定 细 菌 还 原 亚 硝 酸 盐 的 能 力 [ 配 方 ] 蛋 白 胨 10g, 亚 硝 酸 钾 2g, 酵 母 浸 膏 3g, 蒸 馏 水 1L. 将 上 述 成 分 混 合 后, 加 热 溶 解, 调 ph 至 7.0 分 装 试 管 每 管 约 4ml, 加 入 小 倒 管 1 只,121 灭 菌 15min 后 备 用 将 试 验 菌 接 种 于 亚 硝 酸 盐 培 养 基 中,35 培 养 24~48h 24h 观 察 倒 管 中 有 无 气 泡 出 现, 若 有 气 泡 则 为 阳 性, 无 气 泡 为 阴 性 48h 培 养 物 检 测 亚 硝 酸 盐 存 在 与 否 方 法 是 在 培 养 物 内 加 入 硝 酸 盐 还 原 试 剂 甲 乙 液 各 0.5m1, 如 无 红 色 出 现 为 阳 性, 说 明 亚 硝 酸 盐 已 被 还 原 ; 反 之 为 阴 性, 说 明 培 养 基 中 尚 有 亚 硝 酸 盐 存 在 铜 绿 假 单 胞 菌 ATCC 阳 性 ; 硝 酸 盐 阴 性 不 动 杆 菌 ATCC l5038 阴 性 [ 注 意 事 项 ] ⑴ 因 亚 硝 酸 盐 在 自 然 界 中 分 布 很 广, 故 在 制 备 此 培 养 基 时 所 用 器 皿 均 要 清 洗 干 净 ⑵ 未 接 种 的 亚 硝 酸 盐 培 养 基 应 以 硝 酸 盐 试 剂 进 行 检 查, 出 现 红 色 反 应 方 可 使 用 3.40% 胆 汁 肉 汤 培 养 基 用 于 链 球 菌 属 的 鉴 别

26 蛋 白 胨 10g, 氯 化 钠 5g, 牛 肉 浸 膏 5g, 新 鲜 胆 汁 ( 猪 牛 )400m1, 蒸 馏 水 600m1 先 将 蛋 白 胨 牛 肉 膏 氯 化 钠 加 热 溶 于 蒸 馏 水 中, 调 ph 至 7.6, 加 入 胆 汁 混 匀 后, 分 装 试 管, 每 管 3m1, 置 115 灭 菌 20min, 冷 藏 备 用 取 新 鲜 猪 ( 牛 ) 胆 若 干 只, 取 胆 汁 用 沙 布 过 滤, 装 于 瓶 中 115 灭 菌 20min, 冷 却 后 置 4 冰 箱 内, 次 日 取 出 吸 取 上 清 液 备 用 取 待 检 标 本 接 种 肉 汤, 置 35 培 养 24~48h, 观 察 有 无 细 菌 生 长 阳 性 菌 呈 颗 粒 状 生 长, 上 液 澄 清, 管 底 有 沉 淀 ; 阴 性 菌 则 不 生 长 粪 肠 球 菌 ATCC 阳 性 ; 化 脓 链 球 菌 ATCC l9615 阴 性 若 为 初 次 观 察 或 培 养 基 本 身 不 易 观 察, 可 转 种 血 琼 脂 平 板 4.CAMP 试 验 培 养 基 检 查 细 菌 产 生 和 合 成 CAMP 因 子 的 能 力 同 血 琼 脂 平 板 在 血 琼 脂 平 板 上, 先 以 金 黄 色 葡 萄 球 菌 划 一 横 线 接 种, 再 将 被 检 的 ß 群 链 球 菌 与 上 述 划 线 作 垂 直 划 线 接 种, 两 者 不 能 相 交, 相 距 0.5~1.0 cm, 于 35 培 养 18~24h 在 两 种 细 菌 划 线 之 交 接 处 出 现 箭 头 形 透 明 溶 血 区 为 阳 性 ; 无 箭 头 状 溶 血 区 为 阴 性 无 乳 链 球 菌 ATCC l3813 阳 性 ; 粪 肠 球 菌 ATCC 阴 性 ⑴ CAMP 为 Christic,Atkins,Munch-Petersen 四 人 名 ⑵ 每 批 要 用 A D 群 链 球 菌 作 阴 性 对 照, 用 B 群 链 球 菌 作 阳 性 对 照 ⑶ 用 无 菌 9g/L 氯 化 钠 溶 液 洗 涤 3 次 的 羊 红 细 胞, 制 成 5% 含 量 的 羊 血 琼 脂 平 板 效 果 较 好 (4) 用 葡 萄 球 菌 ß- 溶 血 素 滤 液 做 成 纸 条 进 行 试 验 效 果 亦 较 佳 4. 硫 化 氢 试 验 培 养 基 观 察 细 菌 产 生 硫 化 氢 的 作 用 检 测 硫 化 氢 产 物 有 很 多 方 法, 以 醋 酸 铅 法 最 为 敏 感 其 适 用 于 肠 杆 菌 科 以 外 的 细 菌 所 产 生 的 少 量 硫 化 氢 的 检 测 ; 而 硫 酸 亚 铁 法, 为 检 查 硫 化 氢 的 常 规 培 养 基 现 将 两 培 养 基 分 述 如 下 : ⑴ 醋 酸 铅 培 养 基 蛋 白 胨 10g, 胱 氨 酸 0.1g, 硫 酸 钠 0.1g, 蒸 馏 水 1L 将 上 述 成 分 加 热 溶 解, 调 整 ph 为 7.0~7.4, 分 装 试 管, 每 管 液 体 高 度 为 4~5cm,115 灭 菌 20min 将 滤 纸 剪 成 0.1~1.0 cm 宽 的 纸 条, 用 50 ~100g/L 醋 酸 铅 溶 液 浸 透 烘 干, 置 于 皿 内 备 用

27 将 培 养 物 接 种 上 述 培 养 基 中, 挂 上 纸 条 经 35 孵 育 24h 纸 条 变 黑 为 阳 性, 无 变 化 为 阴 性 ⑵ 硫 酸 亚 铁 琼 脂 牛 肉 膏 3g, 酵 母 浸 膏 3g, 蛋 白 胨 10g, 硫 酸 亚 铁 O.2g, 氯 化 钠 5g, 硫 代 硫 酸 钠 0.3g, 琼 脂 12g, 蒸 馏 水 ll 将 上 述 成 分 加 热 溶 解, 分 装 试 管, 每 管 3m1,115 灭 菌 20min, 备 用 将 试 验 菌 株 穿 刺 接 种 到 培 养 基 中, 经 35 培 养 24h 后, 观 察 结 果 培 养 基 呈 黑 色 为 阳 性, 不 变 黑 色 为 阴 性 鼠 伤 寒 沙 门 菌 ATCC l3311 阳 性 ; 宋 内 志 贺 菌 ATCC ll060 阴 性 置 4 冰 箱,2 周 内 用 完 5. 奥 普 托 欣 敏 感 试 验 纸 片 (Optochin sensitivity test) 测 定 细 菌 对 化 学 药 品 奥 普 托 欣 敏 感 性 奥 普 托 欣 (Optochin, 乙 基 氢 化 羟 基 奎 宁,ethylhydrocupreine hydrochloride)10mg 溶 于 10m1 蒸 馏 水 中, 取 1m1, 加 入 200 片 直 径 6mm 的 灭 菌 纸 片 中, 使 其 充 分 吸 收, 于 37 烘 干 备 用 每 片 含 Optochin 5μg 或 将 宽 8mm 的 滤 纸 条 浸 于 1:4 000 的 Optochin 水 溶 液 中, 取 出 烘 干 备 用 将 被 检 菌 的 肉 汤 培 养 物 用 无 菌 棉 棒 均 匀 涂 布 于 血 琼 脂 平 板 上, 取 optochin 纸 片 贴 于 平 板 上,35~37 培 养 18~24h 抑 菌 圈 在 18mm 以 上 为 敏 感, 无 抑 菌 圈 或 抑 菌 圈 <10mm 为 耐 药 肺 炎 链 球 菌 (ATCC l0015) 阳 性 ; 化 脓 性 链 球 菌 (ATCC l9615) 阴 性 如 果 分 离 物 生 长 稀 少, 则 很 难 正 确 判 定 结 果 其 判 定 敏 感 的 最 低 标 准 为 抑 菌 环 直 径 15~16mm 或 更 大 ; 若 <15mm, 应 加 做 胆 汁 溶 解 试 验 来 确 定 6. O/129 试 验 纸 片 用 于 弧 菌 属 的 鉴 定 O/129 50mg 溶 于 50ml 无 水 乙 醇 中, 取 1ml 加 入 100 片 直 径 6mm 的 无 菌 滤 纸 片 中, 吸 收 后 于 37 烘 干 备 用 每 片 滤 纸 含 O/129 10μg 将 待 检 菌 的 肉 汤 涂 布 于 碱 性 琼 脂 平 板, 取 O/129 纸 片 贴 于 平 板 上,35 培 养 18~24h 平 板 出 现 抑 菌 圈 为 阳 性, 无 抑 菌 圈 为 阴 性

28 创 伤 弧 菌 阳 性 ; 亲 水 气 单 胞 菌 阴 性 7.pH9.6 肉 汤 培 养 基 用 于 鉴 定 链 球 菌 ph9.6 的 肉 汤 100m1, 葡 萄 糖 2g/L 将 普 通 肉 汤 调 整 ph9.6, 加 入 葡 萄 糖 溶 解 后, 分 装 试 管, 每 管 2~3m1, 121 灭 菌 15min, 备 用 将 待 检 菌 接 种 培 养 基, 置 35 培 养 18~24h 培 养 基 有 混 浊 物 为 阳 性 粪 肠 球 菌 ATCC 阳 性 ; 化 脓 性 链 球 菌 ATCC l0389 阴 性 4 冰 箱 保 存,2 周 内 用 完 8. 氰 化 钾 试 验 培 养 基 主 要 用 于 属 间 的 鉴 别, 生 长 有 : 弗 氏 枸 橼 酸 杆 菌 克 雷 伯 菌 - 肠 杆 菌 菌 群 铜 绿 假 单 胞 菌 ; 不 生 长 : 沙 门 菌 - 亚 利 桑 那 菌 群 大 肠 埃 希 菌 粪 产 碱 杆 菌 蛋 白 胨 10g, 氯 化 钠 5g, 磷 酸 二 氢 钾 0.225g, 磷 酸 氢 二 钠 4.5g, 蒸 馏 水 ll 将 上 述 成 分 加 热 溶 解 在 三 角 烧 瓶 中, 121 灭 菌 15min, 临 用 时 加 入 50g/L 氰 化 钾 溶 液 1.5m1 混 匀, 分 装 于 无 菌 试 管 中, 一 份 不 加 氰 化 钾 作 对 照 取 纯 培 养 物 接 种 两 管,1 支 氰 化 钾 实 验 管,1 支 对 照 管, 置 35 培 养 24~72h 阳 性 结 果 为 实 验 管 混 浊, 对 照 管 混 浊 ; 阴 性 结 果 ( 敏 感 ) 为 实 验 管 清 晰 ( 不 生 长 ), 对 照 管 混 浊 ( 生 长 ) 铜 绿 假 单 胞 菌 ATCC 生 长 ; 福 氏 志 贺 菌 不 生 长 置 冰 箱 内,1 周 用 完 ⑴ 氰 化 钾 抑 菌 能 力 与 接 种 菌 量 及 培 养 基 成 分 有 很 大 关 系, 所 以 在 试 验 时 接 种 菌 量 不 宜 过 多 ⑵ 氰 化 钾 剧 毒, 使 用 时 注 意 安 全 氰 化 钾 培 养 基 废 弃 前 ( 无 论 是 否 用 过 ), 应 作 无 害 化 处 理 : 向 每 管 加 400 g/l 氢 氧 化 钾 溶 液 0.1m1 和 米 粒 大 的 硫 酸 亚 铁 结 晶 9. 葡 萄 糖 蛋 白 胨 水 培 养 基 ⑴ 帮 助 肠 杆 菌 属 与 大 肠 埃 希 菌 属, 葡 萄 球 菌 属 与 微 球 菌 属 的 属 间 鉴 别 ; (2) 帮 助 肺 炎 克 雷 伯 菌 产 酸 克 雷 伯 菌 臭 鼻 克 雷 伯 菌 鼻 硬 结 克 雷 伯 菌 间 的 菌 种 鉴 别 ; (3) 帮 助 蜂 房 哈 夫 尼 亚 菌 与 小 肠 结 肠 炎 耶 尔 森 菌 的 菌 种 鉴 定 (4) 用 于 VP 试 验

29 多 价 蛋 白 胨 7g, 葡 萄 糖 5g, 磷 酸 氢 二 钾 5g, 蒸 馏 水 1L 将 上 述 成 分 混 合 溶 解 后, 调 ph 至 7.2, 分 装 小 试 管, 121 灭 菌 15min. 置 4 冰 箱 中 保 存 备 用 取 18~24h 培 养 物 小 量 接 种,35 孵 育 24~48h, 有 时 可 能 延 长 数 天 有 些 细 菌, 特 别 是 哈 夫 尼 亚 菌, 在 35 孵 育 时 VP 试 验 结 果 不 稳 定, 但 在 25~30 下 则 呈 阳 性 若 怀 疑 为 哈 夫 尼 亚 菌 时, 可 重 复 VP 试 验 并 在 25 孵 育 观 察 方 法 : (1) 奥 梅 拉 (O-Meara) 法 试 剂 : 氢 氧 化 钾 40g 肌 酐 0.3g 蒸 馏 水 100m1 首 先 将 氢 氧 化 钾 溶 解 然 后 加 肌 酐 保 存 3~4 周 观 察 时 按 培 养 基 试 剂 10:1 比 例 滴 加 试 剂, 混 合, 置 37 4h 或 48 2h, 充 分 振 摇, 变 红 色 为 阳 性 (2) 贝 立 脱 (Barritt) 法 试 剂 甲 液 : 60g/L 甲 - 萘 酚 乙 醇 溶 液 ; 乙 液 :400g/L 氢 氧 化 钾 溶 液 观 察 时 按 每 2m1 培 养 物 加 甲 液 lml, 乙 液 0.4ml 混 合, 置 35 15~30min 出 现 红 色 为 阳 性, 若 无 红 色, 应 置 35 4h 后 再 判 定, 本 法 较 奥 氏 法 敏 感 大 肠 埃 希 菌 ATCC 阴 性 ; 阴 沟 肠 杆 菌 阳 性 培 养 基 置 4 冰 箱,2 周 内 用 完 试 剂 易 失 效, 应 用 前 应 进 行 质 量 控 制 ⑴ 加 入 O-Meara 试 剂 后 要 充 分 混 合, 促 使 乙 酰 甲 基 甲 醇 氧 化, 使 反 应 易 于 进 行 ⑵ 试 剂 必 须 用 已 知 阳 性 和 阴 性 的 标 准 菌 株 进 行 对 照 检 查 ⑶ 试 剂 中 加 入 400 g/l 氢 氧 化 钾 是 为 了 吸 收 二 氧 化 碳 加 入 量 少 于 0.2m1, 且 次 序 不 能 颠 倒 ⑷ 贝 立 脱 方 法 是 相 当 敏 感 的, 它 可 检 出 以 前 认 为 VP 试 验 阴 性 的 某 些 细 菌 ⑸ 许 多 实 验 室 工 作 人 员 有 一 个 错 误 的 印 象, 即 VP 试 验 阳 性 菌 MR 试 验 自 然 是 阴 性, 或 反 之 亦 然 实 际 上, 肠 杆 菌 科 的 大 多 数 细 菌 产 生 相 反 的 反 应 ( 由 于 乙 酰 甲 基 甲 醇 形 成 碱 性 增 加 导 致 MR 阴 性 和 VP 阳 性 ) 某 些 细 菌 如 蜂 房 哈 夫 尼 亚 菌 ( 哈 夫 尼 肠 杆 菌 37 下 孵 育 和 奇 异 变 形 杆 菌 可 产 生 MR 和 VP 同 时 阳 性 反 应, 后 者 常 延 迟 出 现 ⑹ α- 萘 酚 乙 醇 溶 液 易 失 效, 试 剂 放 室 温 暗 处 可 保 存 1 月 氢 氧 化 钾 溶 液 可 长 期 保 存 国 内 多 采 用 贝 立 脱 法 10. 甲 基 红 试 验 培 养 基 检 查 细 菌 发 酵 葡 萄 糖 产 酸 的 能 力 ; 用 于 鉴 别 某 些 细 菌, 如 大 肠 埃 希 菌 ( 阳 性 ) 产 气 杆 菌 ( 阴 性 ) 阴 沟 杆 菌 ( 阴 性 ), 克 雷 伯 菌 属 一 般 为 阴 性, 耶 尔 森 茵 属 阳 性, 其 它 革 兰 阴 性 非 肠 道 杆 菌 阴 性, 单 核 李 斯 特 菌 阳 性

30 ⑴ 葡 萄 糖 蛋 白 胨 水 培 养 基 ( 见 前 ) ⑵ 试 剂 : 甲 基 红 0.1g,95% 乙 醇 300m1, 蒸 馏 水 200m1 大 肠 埃 希 菌 ATCC 阳 性 ; 产 气 肠 杆 菌 阴 性 ⑴ 试 剂 和 培 养 基 在 应 用 前 要 用 已 知 阳 性 菌 ( 如 大 肠 埃 希 菌 ) 和 已 知 阴 性 菌 ( 如 克 雷 伯 菌 ) 做 对 照 试 验 ⑵ MR 试 验 的 正 确 性 取 决 于 足 够 的 孵 育 时 间, 接 种 细 菌 后 至 少 要 孵 育 24h 通 常 每 毫 升 培 养 物 滴 加 1 滴 指 示 剂 置 4 冰 箱, 培 养 基 2 周 内 用 完 甲 基 红 试 剂 置 密 闭 的 棕 色 瓶 内, 可 使 用 3 月 11. 蛋 白 胨 水 培 养 基 用 于 细 菌 靛 基 质 试 验 蛋 白 胨 ( 或 胰 蛋 白 胨 )20g, 氯 化 钠 5g, 蒸 馏 水 1L 将 上 述 成 分 溶 于 水 中, 校 正 ph 至 7.2, 分 装 试 管, 每 管 2~3m1, 置 121 灭 菌 15min 备 用 附 : 试 剂 配 制 ⑴ 靛 基 质 柯 氏 试 剂 : 对 二 甲 氨 基 苯 甲 醛 5g 溶 于 异 戊 醇 75ml 中, 待 冷 却 后 慢 慢 加 入 浓 盐 酸 25ml ⑵ 欧 氏 试 剂 : 对 二 甲 氨 基 苯 甲 醛 1g 溶 于 95% 乙 醇 95ml 中, 溶 解 后 慢 慢 加 入 浓 盐 酸 20m1 (3) 色 氨 酸 滴 板 法 试 剂 : L- 色 氨 酸 0.1g 溶 于 100ml(pH 6.8)0.01mol/L 磷 酸 盐 缓 冲 液 中 将 待 检 菌 接 种 培 养 基, 经 35 培 养 18~24h, 在 培 养 物 液 面, 徐 徐 加 入 靛 基 质 试 剂 数 滴, 阳 性 者 立 即 出 现 玫 瑰 红 色, 阴 性 者 呈 黄 色 大 肠 埃 希 菌 ATCC25922 阳 性 ; 肺 炎 克 雷 伯 菌 阴 性 置 4 冰 箱, 使 用 期 2 周 ⑴ 靛 基 质 试 验 方 法 还 有 试 纸 悬 挂 法, 色 氨 酸 滴 板 法 及 斑 点 法, 请 参 阅 有 关 资 料 ⑵ 选 用 的 蛋 白 胨 一 定 要 含 有 丰 富 的 色 氨 酸, 否 则 不 能 应 用 ⑶ 国 内 多 采 用 柯 氏 试 剂 第 六 节 抗 菌 药 物 敏 感 试 验 培 养 基 抗 菌 药 物 敏 感 试 验 用 于 测 定 抗 菌 药 物 或 其 它 抗 微 生 物 制 剂 在 体 外 抑 制 细 菌 生 长 的 能 力 有 琼 脂 扩 散 法 和 稀 释 法 两 种

31 WHO 推 荐 改 良 Kirby-Bauer 法 抗 菌 药 物 敏 感 试 验, 其 技 术 简 单, 可 重 复 性 好, 且 特 别 适 合 快 速 生 长 的 致 病 菌 但 其 不 适 用 于 肺 炎 链 球 菌 流 感 嗜 血 杆 菌 和 奈 瑟 菌 的 抗 菌 药 物 敏 感 试 验, 这 些 的 细 菌 须 在 常 规 的 抗 菌 药 物 敏 感 试 验 培 养 基 内 补 充 特 殊 的 营 养 成 分 一 M-H 琼 脂 培 养 基 Kirby-Bauer 法 抗 菌 药 敏 试 验 指 定 使 用 本 培 养 基 M-H 琼 脂 (Muller-Hinton 琼 脂, 水 解 酪 蛋 白 琼 脂 ) 加 5 % 羊 血 制 成 血 琼 脂 平 板 或 制 成 巧 克 力 琼 脂 平 板 用 于 检 测 肺 炎 链 球 菌 和 流 感 嗜 血 杆 菌 牛 肉 浸 出 物 1L, 水 解 酪 蛋 白 17.5g, 可 溶 性 淀 粉 1.5g, 琼 脂 17g 将 上 述 各 成 分 混 合, 静 置 10min, 待 可 溶 物 完 全 溶 解 后,121 高 压 15min 灭 菌 冷 至 50 左 右, 吸 取 25m1 培 养 基 注 入 直 径 90mm 的 平 皿 内, 制 成 厚 度 为 4mm 的 琼 脂 平 板 用 质 控 菌 株 测 定 药 物 的 抑 菌 环 与 NCCLS 的 标 准 参 比 判 断 培 养 基 的 质 量 常 用 的 标 准 菌 株 有 : 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ATCC 25923; 大 肠 埃 希 菌 ATCC 25922; 铜 绿 假 单 胞 菌 ATCC 27853; 粪 肠 球 菌 ATCC 或 33186; 肺 炎 链 球 菌 ATCC 6305; 流 感 嗜 血 杆 菌 ATCC l0211 琼 脂 平 板 应 新 鲜 使 用, 4 冰 箱 保 存,1 周 内 用 完 ⑴ 质 量 控 制 标 准 参 见 NCCLS 纸 片 法 药 敏 试 验 操 作 标 准 ⑵ 在 M-H 琼 脂 培 养 基 添 加 5 % 脱 纤 维 羊 血, 即 可 用 于 肺 炎 链 球 菌 的 抗 菌 药 物 敏 感 试 验 ⑶ 在 M-H 琼 脂 培 养 基 上, 补 充 辅 酶 Ⅰ15mg/ml, 牛 血 红 蛋 白 15mg/m1, 酵 母 浸 膏 5mg/m1, 胸 腺 嘧 啶 脱 氧 核 苷 磷 酸 化 酶 0.2 U/m1, 可 用 于 流 感 嗜 血 杆 菌 的 抗 菌 药 物 敏 感 试 验 (4) NCCLS 推 荐 淋 病 奈 瑟 菌 用 GC 琼 脂 平 板, 添 加 生 长 补 充 剂 生 长 补 充 剂 由 下 列 试 剂 组 成 : 每 100ml 水 中 含 有 1.1mg 胱 氨 酸,0.03g 鸟 嘌 呤,3mg 硫 胺,13mg 对 - 氨 基 苯 甲 酸, 0.01g 维 生 素 B12, 0.1g 羧 化 辅 酶,0.25g 辅 酶 Ⅰ,1mg 嘌 呤 腺,10mg L- 谷 氨 酰 胺,100mg 葡 萄 糖,0.02g 硝 酸 铁 二 M-H 肉 汤 培 养 基 用 于 稀 释 法 细 菌 药 物 敏 感 试 验 (MIC 和 MBC 测 定 ) 牛 肉 浸 汤 600m1, 水 解 酪 蛋 白 17.5g, 可 溶 性 淀 粉 1.5g, 蒸 馏 水 400ml 将 上 述 成 分 混 合 加 热 溶 解, 校 正 ph 至 7.3±0.1,121 灭 菌 15min 备 用 如 试 验 菌 对 营 养 要 求 较 高, 临 用 前 按 0.5% 比 例 加 入 羊 血 质 控 菌 株 同 M-H 琼 脂 培 养 基, 凡 自 配 或 购 置 商 品 培 养 基 均 需 用 质 控 菌 株 和 药 物 标 准 品 进 行 测 试, 结 果 符 合 方 可 使 用 置 4 冰 箱 2 周 内 用 完

32 NCCLS 推 荐 使 用 含 阳 离 子 M-H 培 养 基, 即 在 M-H 液 体 培 养 基 中 含 有 钙 离 子 10 ~25mg/L, 镁 离 子 10 ~25mg/L 配 法 如 下 : 氯 化 钙 3.68g 溶 于 100ml 蒸 馏 水 中, 即 为 含 钙 离 子 10mg/ml 贮 存 液 氯 化 镁 8.36g, 溶 于 100ml 蒸 馏 水 中, 即 为 含 镁 离 子 10mg/ml 贮 存 液 第 七 节 L 型 细 菌 培 养 基 一 L 型 细 菌 增 菌 培 养 基 ( 一 ) 高 渗 液 体 L 型 细 菌 菌 增 菌 培 养 基 可 用 作 基 础 培 养 也 用 于 血 液 骨 髓 胸 水 等 标 本 进 行 L 型 细 菌 增 菌 培 养 1. 高 渗 盐 液 体 增 菌 培 氧 基 新 鲜 牛 肉 500g, 蛋 白 胨 10g, 氯 化 钠 40g, 蒸 馏 水 1L 将 新 鲜 牛 肉 去 除 脂 肪 筋 膜, 切 成 小 块 后 用 绞 肉 机 绞 碎, 称 取 500g 加 水 1L 混 合 后 置 冰 箱 浸 泡 过 夜 ; 将 肉 浸 液 煮 沸 30min, 然 后 用 麻 布 或 绒 布 挤 压 过 滤 ; 加 入 蛋 白 胨 氯 化 钠 后 加 热 溶 解, 并 补 足 因 蒸 发 而 失 去 的 水 分, 调 整 ph 至 7.4~7.6; 用 滤 纸 过 滤 后 分 装 小 瓶,121 灭 菌 15~20min 2. 高 渗 糖 液 体 增 菌 培 养 基 用 于 血 液 骨 髓 胸 水 等 标 本 的 L 型 细 菌 增 菌 培 养 新 鲜 牛 肉 500g, 蛋 白 胨 10g, 氯 化 钠 30g, 蔗 糖 150g, 蒸 馏 水 1L 同 上 述 高 渗 盐 培 养 基, 唯 高 压 蒸 汽 灭 菌 时 采 用 min, 以 免 蔗 糖 分 解 取 血 液 5ml 及 其 它 标 本 直 接 种 于 高 盐 高 渗 糖 液 体 培 养 基, 置 35 培 养 l~7 天, 每 天 观 察 细 菌 生 长 情 况 在 上 述 增 菌 培 养 基 上, L 型 细 菌 呈 颗 粒 状 生 长, 颗 粒 可 粘 附 于 管 壁 或 沉 淀 于 管 底 金 黄 色 葡 萄 球 菌 L 型 生 长 良 好 ( 二 )L 型 增 菌 培 养 基 用 于 血 液 脑 脊 液 等 体 液 标 本 中 L 型 细 菌 的 增 殖 培 养 ⑴ 牛 肉 浸 液 1L, 氯 化 钠 30~40g, 蛋 白 胨 ( 优 质 )20g. ⑵ 牛 肉 浸 液 1L, 氯 化 钠 30g, 蔗 糖 150g, 蛋 白 胨 20g 将 各 成 分 称 量 混 合 加 热 溶 解 后, 校 正 ph 至 7.4~7.6, 分 装 培 养 瓶, 每 瓶 15m1,121 灭 菌 15min 备 用

33 用 无 菌 操 作 采 集 标 本, 立 即 接 种 于 L 型 细 菌 液 体 培 养 基 和 常 规 血 液 增 菌 培 养 基 内, 标 本 与 培 养 基 之 比 为 1..10, 置 35 培 养 3~7 天, 逐 日 观 察 如 发 现 培 养 液 产 生 混 浊 溶 血 絮 状 沉 淀 或 瓶 壁 上 附 有 粘 性 颗 粒 等 细 菌 生 长 现 象, 立 即 分 离 至 L 型 细 菌 分 离 平 板 上 进 行 鉴 定 用 L 型 细 菌 做 生 长 试 验, 培 养 24~72h, 生 长 良 好 置 4 冰 箱 内 使 用 l~2 周 二 L 型 细 菌 分 离 琼 脂 培 养 基 用 于 常 见 L 型 细 菌 的 分 离 培 养 1.Kaqan 分 离 平 板 牛 肉 浸 液 800m1, 氯 化 钠 50g, 蛋 白 胨 (OXoid)20g, 琼 脂 粉 (Oxoid)8g, 血 浆 ( 人 马 羊 )200m1 将 前 四 种 成 分 称 量 混 合 加 热 溶 解, 校 正 ph 至 7.5±0.1, 分 装 每 瓶 80m1,121 灭 菌 15min 冷 藏 备 用 临 用 时 加 热 溶 解 后, 冷 却 至 56 加 入 血 浆 20ml 摇 匀 倾 注 平 板 放 在 密 封 塑 料 袋 中, 置 4 冰 箱 备 用 血 浆 要 预 先 灭 菌 处 理, 并 经 56 水 浴 灭 活 30min 2. 蚌 埠 85-7 分 离 平 板 牛 肉 浸 液 1L, 氯 化 钠 40g, 蛋 白 胨 30g, 明 胶 ( 生 物 试 剂 )30g, 琼 脂 粉 5~8g 将 上 述 成 分 混 合, 加 热 溶 解, 校 正 ph 至 7.4~7.6, 分 装 后, 经 121 灭 菌 15min 后 倾 注 平 板, 置 4 冰 箱 备 用 将 血 脑 脊 液 尿 等 标 本 或 增 菌 培 养 物 滴 种 于 平 板 约 0.1m1, 用 L 型 玻 棒 均 匀 涂 开, 置 35 温 箱 内 启 盖 片 刻, 除 去 平 板 表 面 水 分 在 平 板 的 边 端 贴 一 片 专 用 诱 导 纸 片 覆 盖 后 置 % 二 氧 化 碳 环 境 下 3~5 天, 逐 日 观 察 如 有 可 疑 L 型 菌 落, 用 低 倍 镜 检 查 在 诱 导 区 与 非 诱 导 区 同 时 见 到 L 型 菌 落 说 明 标 本 内 确 有 L 型 细 菌 存 在 ; 若 诱 导 区 存 在 L 型 菌 落, 而 非 诱 导 区 无, 则 提 示 标 本 内 有 L 型 细 菌 变 异 的 趋 向 ⑴ 细 菌 诱 导 试 验, 在 该 平 板 上 能 诱 导 金 黄 色 葡 萄 球 菌 CowengⅠ 标 准 菌 株 出 现 L 型 菌 落 和 G 型 菌 落 ⑵ 用 L 型 菌 落 作 10-7 稀 释, 取 0.1ml 接 种, 经 培 养 获 得 单 个 菌 落 和 纯 培 养 置 4 冰 箱 内,2 周 用 完 第 八 节 钩 端 螺 旋 体 支 原 体 和 衣 原 体 培 养 基 一 钩 端 螺 旋 体 培 养 基 柯 少 夫 (Korthof) 培 养 基 用 于 钩 端 螺 旋 体 增 殖

34 蛋 白 胨 400mg, 氯 化 钠 700mg, 碳 酸 氢 钠 10mg, 氯 化 钾 20mg, 氯 化 钙 20mg, 磷 酸 二 氢 钾 120mg, 磷 酸 氢 二 钠 440mg, 蒸 馏 水 500ml, 无 菌 兔 血 清 ( 灭 活 ) 8~10ml 将 各 成 分 溶 于 蒸 馏 水 内 煮 沸 20min, 以 滤 纸 滤, 调 至 ph 为 7.2, 分 装 烧 瓶 内, 每 瓶 100ml,12l 灭 菌 20min; 无 菌 采 取 兔 心 血 分 离 血 清, 置 56 水 浴 箱 中 30min 以 破 坏 补 体 ; 上 述 蛋 白 胨 盐 溶 液 每 100ml 中 加 入 无 菌 兔 血 清 8~10m1; 混 合 后, 用 无 菌 分 装 中 号 试 管 中, 每 管 5m1; 置 56 水 浴 箱 30min;37 温 箱 中 孵 育 2 天, 剔 去 污 染 者 ⑴ 为 防 止 污 染, 每 100m1 培 养 基 可 加 50mg 磺 胺 嘧 啶 钠 ⑵ 为 了 促 进 钩 端 螺 旋 体 生 长, 可 于 该 培 养 基 中 加 入 维 生 素 B12 及 烟 酸 ( 各 1mg/100m1), 并 将 兔 血 清 量 自 8 % 减 至 5 %, 培 养 基 中 不 加 氯 化 钙,( 因 氯 化 钙 对 生 长 无 作 用, 且 常 形 成 沉 淀 物 ), 再 以 100 加 热 30min 用 此 法 制 得 培 养 基 清 晰, 无 任 何 沉 淀 二 支 原 体 培 养 基 % PPLO 琼 脂 培 养 基 分 离 支 原 体 牛 心 ( 去 脂 绞 碎 )250g, 氯 化 钠 5g, 胰 蛋 白 酶 ( 不 含 乳 糖 )2.5g, 蛋 白 胨 10g, 酵 母 浸 膏 1g, 琼 脂 粉 14g, 蒸 馏 水 1L ⑴ 牛 心 消 化 液 配 制 : 取 去 脂 绞 碎 牛 心 250g, 氯 化 钠 5g 及 蒸 馏 水 900m1 混 合 ; 另 取 胰 蛋 白 酶 2.5g, 溶 解 于 100ml 5g/L 氯 化 钠 溶 液 中, 然 后 与 上 述 牛 心 消 化 液 混 合, 放 置 50~60 水 温 箱 内 消 化 2h, 中 间 不 断 搅 拌, 消 化 后 用 两 层 纱 布 过 滤, 滤 液 煮 沸 5min, 用 滤 纸 过 滤 后, 补 足 水 分 至 原 量, 然 后 加 酵 母 浸 膏 1g, 混 匀, 冷 却 后 调 ph 至 8.0, 分 装 后 121 灭 菌 15min 备 用 ⑵ 支 原 体 基 础 琼 脂 : 取 上 述 牛 心 消 化 液 ( 已 加 氯 化 钠 )ll, 加 蛋 白 胨 10g 和 琼 脂 粉 14g, 混 合 后, 加 热 溶 解, 调 ph 至 7.8~8.0, 再 加 热 煮 沸, 用 脱 脂 棉 或 绒 布 过 滤, 过 滤 后 分 装 于 圆 瓶 中, 每 瓶 70m1,121 灭 菌 15min, 备 用 ⑶ 250g/L 鲜 酵 母 液 制 备 : 食 用 鲜 酵 母 块 250g, 加 蒸 馏 水 1L, 混 合 后, 煮 沸 2min, 用 滤 纸 过 滤, 滤 后 置 4 冰 箱 中 过 夜, 使 之 沉 淀, 次 日 吸 取 上 清 液, 用 150g/L 氢 氧 化 钠 溶 液 调 ph 至 8.0, 再 煮 沸 1 次, 冷 却 后,3000r /min 离 心 45min, 吸 取 上 清 液, 分 装 于 瓶 中,121 灭 菌 15min, 放 4 冰 箱 中 备 用, 可 保 存 3 月 ⑷ 倾 注 平 板 : 溶 解 基 础 琼 脂, 冷 却 至 80 左 右, 每 瓶 (70ml) 内 立 即 加 预 温 在 37 培 养 箱 内 的 无 菌 马 血 清 或 小 牛 血 清 20m1,250g/L 鲜 酵 母 浸 出 液 10ml,10g/L 乙 酸 铊 溶 液 2.5m1, 青 霉 素 G 钾 盐 溶 液 (20 万 U/m1)0.5m1 和 两 性 霉 素 B 溶 液 (5mg/ml)0.1m1; 充 分 混 匀 后 倾 注 9cm 平 板, 经 37 培 养 过 夜, 无 菌 试 验 阴 性 者, 存 放 4 冰 箱 备 用 ⑴ 乙 酸 铊 是 极 毒 药 品, 须 特 别 注 意 安 全 操 作 ⑵ 支 原 体 美 蓝 琼 脂 平 皿 为 分 离 肺 炎 支 原 体 的 选 择 性 平 皿, 口 腔 唾 液 分 泌 物 中 的 其 它 支 原 体 均 被 抑 制 生 长, 肺 炎 支 原 体 生 长 为 桑 椹 状 无 色 的 菌 落

35 ⑶ 支 原 体 传 代 移 种 用 0.1% 半 固 体 琼 脂, 配 制 时 除 用 0.1% 琼 脂 粉 外, 其 它 成 分 与 支 原 体 基 础 培 养 基 相 同, 但 不 加 两 性 霉 素, 此 半 固 体 琼 脂 分 装 在 试 管 内 灭 菌 备 用 传 代 时 将 平 皿 上 已 选 定 的 支 原 体 菌 落 用 无 菌 刀 片 切 下 一 小 块, 直 接 移 种 于 半 固 体 管 中, 置 适 当 的 气 体 环 境 中, 培 养 3~5 天 后, 可 在 琼 脂 小 块 出 现 小 岛 状 絮 片 生 长 物, 或 呈 颗 粒 状, 即 次 代 支 原 体 ⑷ 支 原 体 传 代 用 液 体 培 养 基 : 其 成 分 与 上 述 支 原 体 半 固 体 琼 脂 相 同, 不 加 琼 脂 粉 和 两 性 霉 素 B 2. 肺 炎 支 原 体 分 离 用 双 相 培 养 基 用 于 喉 拭 标 本 直 接 分 离 肺 炎 支 原 体 ⑴ 底 层 琼 脂 斜 面 : 其 成 分 与 上 述 支 原 体 半 固 体 琼 脂 相 同, 不 加 两 性 霉 素 B 无 菌 分 装 于 经 灭 菌 的 链 霉 素 空 瓶 中, 每 瓶 3m1, 置 成 斜 面, 此 为 底 层 ⑵ 液 体 培 养 基 : 其 成 分 与 上 述 支 原 体 传 代 用 液 体 培 养 基 相 同 但 在 未 高 压 灭 菌 前, 再 加 入 葡 萄 糖 1g, 美 蓝 0.001g( 即 10g/L 美 蓝 溶 液 0.1ml),1g/L 酚 红 溶 液 2m1,115 灭 菌 15min, 冷 却 后, 再 加 入 辅 助 成 分 和 防 止 杂 菌 生 长 的 成 分 然 后, 在 上 述 底 层 琼 脂 斜 面 上, 每 瓶 再 加 入 液 体 培 养 基 3~5m1, 瓶 塞 用 煮 沸 灭 菌 的 后 口 橡 皮 塞 经 37 培 养 过 夜, 无 菌 试 验 阴 性 者, 存 放 4 冰 箱 中 备 用, 可 保 存 1 月 已 接 种 的 双 相 培 养 管, 培 养 37 普 通 环 境 2~4 周, 观 察 结 果, 阳 性 生 长 见 双 相 管 由 淡 紫 色 变 成 绿 色, 再 转 变 为 黄 色, 因 肺 炎 支 原 体 发 酵 葡 萄 糖, 还 原 美 蓝 取 阳 性 管 用 分 离 支 原 体 固 体 平 皿 分 离 菌 落, 平 血 放 入 含 95 % 氮 气 和 5 % 二 氧 化 碳 环 境 中, 或 放 入 含 5% 二 氧 化 碳 环 境 中 培 养 2~4 周, 阳 性 平 皿 可 见 菌 落 生 长 三 衣 原 体 培 养 基 - 鸡 胚 培 养 基 培 养 增 殖 和 分 离 鹦 鹉 热 性 病 淋 巴 肉 芽 肿 和 沙 眼 等 衣 原 体 7 日 龄 鸡 胚 3~5 只 精 选 产 后 10 天 内 并 10 左 右 保 存 的 受 精 鸡 卵 孵 育, 置 38~39 相 对 湿 度 40%~60% 的 孵 卵 箱 中 孵 育,4 天 后 用 检 卵 灯 检 视 发 育 情 况, 挑 出 未 受 精 及 死 亡 者 生 活 鸡 胚 检 视 时 可 见 清 晰 血 管 小 团 或 花 纹, 其 中 有 鸡 胚 暗 影, 稍 大 者 并 见 胚 动 等 将 感 染 材 料 研 磨 合 并, 加 含 抗 菌 药 物 的 肉 汤 制 成 l0%~20% 的 悬 液, 室 温 中 置 1h 后, 接 种 鸡 胚 卵 黄 囊 0.25m1, 每 份 标 本 接 种 3~4 只 鸡 胚, 置 35 培 养, 每 日 观 察 1 次 3 天 以 后 死 亡 的 鸡 胚 收 获 其 卵 黄 囊, 先 做 涂 片 染 色, 检 选 疑 似 或 阳 性 材 料 再 行 传 代, 直 到 含 有 丰 盛 衣 原 体 ⑴ 如 感 染 后 13 天 鸡 胚 仍 然 存 活, 再 行 盲 目 传 代 先 将 鸡 胚 在 4 冰 箱 中 放 几 小 时, 然 后 解 剖 黄 囊, 研 碎 后 制 成 悬 液, 低 速 离 心, 取 上 清 液 接 种 鸡 胚 如 连 续 3 代 阴 性, 为 阴 性 结 果 ⑵ 待 检 标 本 于 室 温 不 宜 久 置, 如 1h 内 不 能 接 种, 可 放 普 通 冰 箱 中 ; 如 放 置 -70 低 温 中, 则 可 保 存 较 长 时 间 第 九 节 真 菌 培 养 基