®

3124 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 21 期 2014 年 11 月 海 藻 玉 壶 汤 中 海 藻 与 甘 草 不 同 比 例 配 伍 对 甲 状 腺 肿 大 模 型 大 鼠 药 效 及 其 机 制 探 讨 李 怡 文, 于 雪, 钟 赣 生 *, 柳 海 艳, 刘 云 翔, 高 源, 欧 丽 娜 北 京 中 医 药 大 学 基 础 医 学 院, 北 京 100029 摘 要 : 目 的 通 过 观 察 海 藻 与 甘 草 不 同 比 例 配 伍 的 海 藻 玉 壶 汤 对 丙 硫 氧 嘧 啶 造 成 的 甲 状 腺 肿 大 大 鼠 模 型 生 物 效 应 的 影 响, 筛 选 出 海 藻 与 甘 草 配 比 起 效 的 适 宜 条 件, 并 对 其 作 用 机 制 进 行 初 步 探 讨 方 法 将 海 藻 与 甘 草 按 照 2 因 素 7 水 平 的 均 匀 设 计 实 验 原 则 设 置 不 同 配 伍 比 例 的 海 藻 玉 壶 汤,Wistar 大 鼠 120 只, 随 机 分 为 10 组, 采 用 ig 丙 硫 氧 嘧 啶 14 d 复 制 动 物 模 型, 造 模 后 各 组 ig 给 药 28 d, 实 验 结 束 后 测 定 大 鼠 甲 状 腺 质 量, 测 定 血 清 中 三 碘 甲 腺 原 氨 酸 (T 3 ) 四 碘 甲 腺 原 氨 酸 (T 4 ) 促 甲 状 腺 激 素 (TSH) 等 甲 状 腺 激 素 水 平,RT-PCR 法 测 定 大 鼠 甲 状 腺 中 甲 状 腺 过 氧 化 物 酶 (TPO) 和 甲 状 腺 球 蛋 白 (Tg) 的 mrna 表 达 结 果 海 藻 玉 壶 汤 中 海 藻 与 甘 草 不 同 配 比 在 不 同 程 度 上 均 有 调 节 甲 状 腺 激 素 水 平 改 善 丙 硫 氧 嘧 啶 所 致 的 甲 状 腺 肿 大 作 用 与 模 型 组 比 较, 配 比 5 组 (0.135 8.32) 较 模 型 组 TPO mrna 的 表 达 显 著 升 高 海 藻 玉 壶 汤 配 比 1 组 (14.522 6.24) 5 组 6 组 (29.040 4.16) 的 Tg mrna 水 平 较 对 照 组 显 著 升 高 结 论 海 藻 玉 壶 汤 中 海 藻 与 甘 草 不 同 配 比 在 不 同 程 度 上 均 能 抑 制 丙 硫 氧 嘧 啶 所 导 致 的 甲 状 腺 肿 大, 以 配 比 1 组 3 组 (19.363 0.54) 6 组 表 现 最 为 明 显, 其 作 用 机 制 可 能 涉 及 刺 激 TPO 与 Tg 基 因 转 录 的 增 强 配 比 1 组 与 配 比 5 组 具 有 促 进 这 种 代 偿 增 强 的 作 用, 在 某 种 程 度 上 对 甲 状 腺 激 素 水 平 的 恢 复 起 到 积 极 的 作 用 关 键 词 : 海 藻 玉 壶 汤 ; 甲 状 腺 肿 大 ; 丙 硫 氧 嘧 啶 ; 甲 状 腺 激 素 ; 甲 状 腺 过 氧 化 物 酶 ; 甲 状 腺 球 蛋 白 中 图 分 类 号 :R285.51 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 :0253-2670(2014)21-3124 - 07 DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.21.016 Effect of different compatibility of Sargassum and Glycyrrhizae Radix in Haizao Yuhu Decoction on goiter model rats and its mechanism LI Yi-wen, YU Xue, ZHONG Gan-sheng, LIU Hai-yan, LIU Yun-xiang, GAO Yuan, OU Li-na College of Preclinical Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China Abstract: Objective To explore the mechanism and compensation proceeding of Haizao Yuhu Decoction (HYD) with different compatibility of Sargassum and Glycyrrhizae Radix in goiter model rats caused by propylthiouracil (PTU). Methods HYD with different compatibility of Sargassum and Glycyrrhizae Radix was set up according to the principle uniform design (two factors, seven level, and 120 Wistar rats were randomly divided into 10 groups. PTU was ig given to rats for 14 d to establish the goiter model, and then the rats were ig administered with HYD for 28 d. All animals were sacrificed after the last dosage, the thyroid weight and changes of thyroid hormone levels of triiodothyronine (T 3 ), thyroxine (T 4 ), and thyroid stimulating hormone (TSH) in serum were determined, and the mrna expression of thyroid peroxidase (TPO) and thyroglobulin (Tg) was detected by RT-PCR. Results HYD with different compatibility of Sargassum and Glycyrrhizae Radix could regulate thyroid hormone levels and inhibit thyroid enlargement induced by PTU in some degree. Compared with the model group, the TPO mrna expression of group 5 (0.135 8.32) was significantly increased, and groups 1 (14.522 6.24), 5, and 6 (29.040 4.16) could also increase the Tg mrna level significantly. Conclusion HYD with different compatibility could inhibit thyroid enlargement induced by PTU in some extent, the effects in groups 1 (14.522 6.24), 3 (19.363 0.54), and 6 (29.040 4.16) are the most obvious, and the mechanism may be related to the activation of gene transcription of TPO and Tg. The groups 1 and 5 could enhance the compensatory action to a certain degree. Key words: Haizao Yuhu Decoction; goiter; propylthiouracil; thyroid hormone; thyroid peroxidase; thyroglobulin 收 稿 日 期 :2014-01-23 基 金 项 目 : 国 家 重 点 基 础 研 究 发 展 计 划 ( 973 计 划 ) 项 目 (2011CB505300,2011CB505306) 作 者 简 介 : 李 怡 文 (1984 ), 女, 博 士 研 究 生, 研 究 方 向 为 中 药 药 性 理 论 Tel: (010)64287006 * 通 信 作 者 钟 赣 生 Tel: (010)64287006 E-mail: zhonggansheng@sohu.com E-mail: liyiwenjackie@sina.cn

中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 21 期 2014 年 11 月 3125 海 藻 与 甘 草 配 伍 属 中 药 十 八 反 配 伍 禁 忌 范 畴 作 为 中 药 配 伍 禁 忌 的 代 名 词, 十 八 反 从 金 元 时 期 沿 用 至 今 已 有 近 千 年 的 历 史 传 统 中 医 认 为 反 药 同 时 应 用 会 产 生 剧 烈 的 毒 副 作 用, 因 此 限 制 了 反 药 组 合 的 临 床 应 用, 然 而 从 诸 多 文 献 及 临 床 实 践 看, 持 不 同 意 见 者 亦 不 乏 其 人, 海 藻 和 甘 草 配 伍 屡 见 不 鲜 纵 观 古 代 医 籍, 同 用 海 藻 甘 草 的 方 剂 达 30 余 首 之 多, 如 孙 思 邈 备 急 千 金 要 方 之 大 补 气 方, 李 东 垣 兰 室 秘 藏 之 散 肿 溃 坚 汤, 王 肯 堂 证 治 准 绳 之 防 风 羌 活 汤, 陈 实 功 外 科 正 宗 之 海 藻 玉 壶 汤 通 气 散 坚 丸, 就 连 政 府 组 织 编 写 的 医 籍 中 也 有 此 类 方 剂, 如 太 平 圣 惠 方 之 内 消 昆 布 散, 圣 济 总 录 之 茯 苓 汤, 医 宗 金 鉴 之 消 核 散 等 从 现 代 临 床 应 用 角 度 看, 亦 有 海 藻 甘 草 配 伍 治 疗 内 分 泌 科 ( 甲 状 腺 ) 妇 科 男 科 皮 肤 科 等 多 种 疾 病 [1] 以 往 对 于 反 药 组 合 的 研 究, 多 是 考 察 了 海 藻 和 甘 草 在 生 理 状 态 下, 单 独 应 用 2 味 中 药 所 产 生 的 毒 性 [2] 然 而, 临 床 上 相 反 药 物 配 伍 使 用 多 于 特 定 的 病 理 条 件 下, 且 是 在 复 方 中 应 用 的 因 此, 本 课 题 组 以 明 代 外 科 正 宗 中 经 典 方 剂 海 藻 玉 壶 汤 为 切 入 点, 大 鼠 甲 状 腺 肿 大 病 理 模 型 为 载 体, 基 于 973 项 目 组 均 匀 设 计 要 求, 从 方 药 结 合 的 角 度, 探 讨 方 中 海 藻 与 甘 草 反 药 药 对 不 同 配 比 对 甲 状 腺 肿 大 大 鼠 模 型 的 生 物 学 效 应 的 影 响 通 过 放 射 免 疫 方 法 测 定 血 清 中 甲 状 腺 激 素 水 平 分 子 生 物 学 手 段 考 察 海 藻 甘 草 不 同 比 例 配 伍 治 疗 甲 状 腺 肿 大 的 作 用 机 制 本 实 验 主 要 针 对 海 藻 玉 壶 汤 的 消 瘿 散 结 作 用 以 及 甲 状 腺 肿 大 病 理 模 型 的 特 点, 从 甲 状 腺 模 型 激 素 水 平 和 分 子 生 物 学 水 平 考 察 其 药 效 并 对 其 机 制 进 行 初 步 探 讨 1 材 料 1.1 药 品 与 试 剂 生 甘 草 产 自 宁 夏 灵 武, 批 号 为 100710; 炙 甘 草 产 地 批 号 同 生 甘 草, 按 照 2010 版 中 国 药 典 炮 制 标 准, 由 北 京 中 医 药 大 学 中 药 学 院 炮 制 教 研 室 杨 蕾 副 教 授 指 导 完 成, 其 中 蜂 蜜 选 用 北 京 百 花 蜂 蜜, 批 号 为 20100802, 北 京 百 花 蜂 蜜 有 限 公 司 ; 海 藻 产 自 山 东 烟 台, 批 号 为 皖 Y20050202; 法 半 夏 产 自 贵 州 长 顺, 批 号 为 100701; 贝 母 产 自 浙 江 潘 安, 100701; 连 翘 产 自 山 西, 批 号 为 1104047; 川 芎 产 自 四 川, 批 号 为 1101017; 独 活 产 自 四 川, 批 号 为 1012001; 昆 布 产 自 沿 海, 批 号 为 1104062; 醋 青 皮 产 自 四 川, 批 号 为 1102015; 陈 皮 产 自 四 川, 批 号 为 1104063; 当 归 产 自 甘 肃, 批 号 为 1012052; 海 带 产 自 山 东 青 岛 ; 以 上 药 物 均 购 自 北 京 双 桥 燕 京 中 药 饮 片 厂, 经 北 京 中 医 药 大 学 基 础 医 学 院 李 伟 实 验 员 鉴 定 均 为 合 格 的 中 药 饮 片 由 于 法 半 夏 贝 母 连 翘 川 芎 独 活 昆 布 醋 青 皮 陈 皮 当 归 海 带 这 几 味 中 药 饮 片 在 中 国 药 典 2010 年 版 中 的 服 用 剂 量 范 围 不 尽 相 同, 因 此 本 实 验 选 取 其 剂 量 范 围 中 共 同 的 剂 量 9 g 为 入 药 剂 量 ( 成 人 70 kg/d), 按 动 物 体 表 系 数 算 法 得 大 鼠 给 药 的 等 效 剂 量 为 0.9 g/(kg d) 海 藻 与 甘 草 的 剂 量 按 实 验 设 计 设 置 不 同 的 配 比 各 药 材 按 比 例 组 方, 加 水 煎 煮 2 次, 配 制 成 海 藻 玉 壶 汤, 浓 缩 至 所 需 浓 度 丙 硫 氧 嘧 啶 片, 广 东 华 南 药 业 集 团 有 限 公 司, 批 号 1007041, 使 用 时 配 制 为 1 mg/ml 溶 液 ; 阳 性 药 为 优 甲 乐, 由 默 克 雪 兰 诺 有 限 公 司 提 供, 批 号 133117, 使 用 时 配 制 为 2 μg/ml 药 液 三 碘 甲 腺 原 氨 酸 (T 3 ), 批 号 20111125; 四 碘 甲 腺 原 胺 酸 (T 4 ), 批 号 20111128; 促 甲 状 腺 激 素 (TSH), 批 号 20111124; 血 清 游 离 三 碘 甲 腺 原 氨 酸 (FT 3 ), 批 号 20111123; 血 清 游 离 四 碘 甲 腺 原 氨 酸 (FT 4 ), 批 号 20111127; 促 甲 状 腺 激 素 释 放 激 素 (TRH), 批 号 20111221; 甲 状 腺 素 结 合 球 蛋 白 (TBG), 批 号 20111228; 甲 状 旁 腺 素 (PTH), 批 号 20111225; 以 上 试 剂 盒 均 由 北 京 利 德 曼 生 化 股 份 有 限 公 司 提 供 Trizol RNA 提 取 试 剂 (Invitrogen 公 司 ), M-MLV 逆 转 录 酶 dntp(10 mmol/l) Tag 酶 (Promega 公 司 ), 无 RNA 酶 水 (DEPC) 原 液 RNA 酶 抑 制 剂 (Amresco 公 司 ),Loading 缓 冲 液 (CWBIO 公 司 ), 琼 脂 糖 (Biowest agrose 产 品 ), Oligo(dT) (Amersham 公 司 ), 超 纯 水 (WelGENE 公 司 ), 以 上 试 剂 由 北 京 康 为 世 纪 生 物 科 技 有 限 公 司 提 供 异 丙 醇 ( 分 析 纯 ) 无 水 乙 醇 ( 分 析 纯 ) 氯 仿 ( 分 析 纯 ) 氯 化 钠 溶 液 均 由 北 京 化 学 试 剂 公 司 提 供 1.2 动 物 清 洁 级 Wistar 大 鼠 120 只, 雌 雄 各 半, 体 质 量 160~180 g, 由 北 京 维 通 利 华 实 验 动 物 技 术 有 限 公 司 提 供, 许 可 证 号 SCXK( 京 )2006-0009 1.3 仪 器 R 911 全 自 动 放 免 计 数 仪 ( 中 国 科 技 大 学 实 业 总 公 司 ),System electrophoresis Mupid(2plu 电 泳 槽 ( 日 本 TAKARA 公 司 ), 紫 外 分 光 光 度 计 ( 美

3126 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 21 期 2014 年 11 月 国 Spectronic Unicam 公 司 ), 漩 涡 混 合 器 Voltex Genie2( 美 国 SI 公 司 ), 高 速 冷 冻 离 心 机 ( 德 国 Sigma 公 司 ), 凝 胶 成 像 系 统 ( 美 国 Alpha Inn tech 公 司 ) 2 方 法 2.1 模 型 制 备 选 取 Wistar 大 鼠, 体 质 量 180~200 g,120 只, 雌 雄 各 半, 除 对 照 组 外, 其 余 各 组 ig 丙 硫 氧 嘧 啶 10 mg/kg, 每 天 1 次, 连 续 14 d 预 试 验 结 果 表 明 造 模 大 鼠 甲 状 腺 较 对 照 组 明 显 增 大 在 给 药 期 间, 为 了 稳 定 模 型, 每 隔 2 d 各 造 模 动 物 组 ig 丙 硫 氧 嘧 啶 10 mg/kg 2.2 海 藻 甘 草 配 比 剂 量 的 选 择 根 据 急 性 毒 性 实 验 结 果 [3], 生 甘 草 小 鼠 LD 50(19) 为 82.98 g/kg, 海 藻 的 LD 50 为 35.67 g/kg 中 国 药 典 2010 年 版 生 甘 草 临 床 用 量 为 1.5~10 g, 海 藻 剂 量 为 6~15 g, 确 定 给 药 的 剂 量 范 围 : 高 限 为 1/2 LD 50, 低 限 为 药 典 剂 量 的 低 限 按 动 物 体 表 系 数 算 法 得 大 鼠 给 药 的 等 效 剂 量, 海 藻 剂 量 0.54~12.49 g/kg, 生 甘 草 剂 量 0.135~29.040 g/kg 按 照 本 课 题 组 SOP 均 匀 设 计 法, 将 海 藻 和 生 甘 草 视 为 2 个 因 素, 每 个 因 素 分 为 7 水 平, 考 察 因 素 及 水 平 和 具 体 分 组 剂 量 见 表 1 表 1 U 7 (7 2 ) 不 同 配 比 及 剂 量 分 组 Table 1 U 7 (7 2 ) ratio of different dose groups 配 伍 组 编 号 生 甘 草 / (g kg 1 ) 海 藻 / (g kg 1 ) 配 比 1 14.522 6.24 配 比 2 9.681 12.49 配 比 3 19.363 0.54 配 比 4 4.841 2.08 配 比 5 0.135 8.32 配 比 6 29.040 4.16 配 比 7 24.200 10.40 2.3 分 组 给 药 将 大 鼠 按 体 质 量 随 机 分 为 对 照 组 模 型 组 阳 性 药 组 ( 优 甲 乐 ) 海 藻 甘 草 不 同 配 比 的 海 藻 玉 壶 汤 1~7 组, 共 计 10 组, 每 组 12 只 其 中 对 照 组 与 模 型 组 ig 给 予 生 理 盐 水, 其 余 各 给 药 组 ig 给 予 相 应 药 液, 给 药 体 积 1 ml/100 g, 各 组 于 造 模 后 连 续 给 药 28 d 每 周 称 体 质 量 1 次, 自 由 进 食 饮 水 2.4 样 本 采 集 与 处 理 末 次 给 药 后 1 h,10% 水 合 氯 醛 麻 醉, 大 鼠 腹 主 动 脉 取 血, 雄 性 大 鼠 约 8 ml, 雌 性 大 鼠 约 6 ml, 4,3 000 r/min, 离 心 15 min, 留 取 上 清, 分 装, 70 冰 箱 保 存, 待 检 相 关 指 标 ; 腹 主 动 脉 取 血 后, 迅 速 剥 离 气 管, 快 速 取 双 侧 甲 状 腺, 选 取 右 侧 甲 状 腺 置 于 冻 存 管 中, 液 氮 冻 存 2.5 指 标 检 测 2.5.1 血 液 指 标 检 测 取 冻 存 血 清, 按 T 3 T 4 TSH FT 3 FT 4 TRH TBG PTH 试 剂 盒 说 明 书 方 法, 检 测 各 项 指 标 2.5.2 RT-PCR 法 检 测 甲 状 腺 组 织 甲 状 腺 球 蛋 白 (Tg) 甲 状 腺 过 氧 化 物 酶 (TPO)mRNA 表 达 取 甲 状 腺 组 织, 样 本 总 RNA 的 提 取 按 说 明 书 进 行 操 作, 采 用 紫 外 分 光 光 度 法 对 提 取 的 RNA 进 行 定 量 每 个 样 本 中 取 总 RNA 1 μl, 按 照 逆 转 录 试 剂 盒 说 明 书 进 行 操 作 将 RNA 逆 转 录 成 cdna 按 试 剂 盒 说 明, 在 超 净 台 中, 取 3 μg 总 RNA 样 品 为 模 板, Oligo(DT)2 μl 作 为 引 物, 使 用 1 μl M-MLV 逆 转 录 酶,RNA 酶 抑 制 剂 1 μl,dntp 2 μl,5 逆 转 录 酶 缓 冲 液 4 μl, 配 制 反 应 体 系 为 20 μl PCR 反 应 体 系 :10 缓 冲 液 2 μl,taq 酶 0.5 μl,dntp 1 μl,tpo(tg) 上 下 游 引 物 各 0.5 μl, 上 下 游 引 物 各 0.5 μl,cdna 样 本 2.0 μl, 总 反 应 体 系 为 20 μl PCR 的 循 环 条 件 :94 预 变 性 3 min,94 30 s,53 30 s,72 1 min,72 中 延 伸 8 min TPO Tg 及 上 下 游 引 物 序 列 及 退 火 温 度 见 表 2 表 2 TPO Tg 及 上 下 游 引 物 序 列 片 段 长 度 及 退 火 温 度 Table 2 Primer sequences, segment sizes, and annealing temperature of TPO, Tg, and 产 物 长 退 火 温 名 称 序 列 (5 3 ) 度 / bp 度 / TPO 正 向 :CTCCACGGATGCACTATCAG 180 65 反 向 :TTCTACCGA CGGAGGACAGA Tg 正 向 :GTGAACGCCTCTGTGACAGA 280 62 反 向 :ACGAAACCTGAGGACCGTCT 正 向 :TTCACCACCATGGAGAAGGC 430 62 反 向 :ACTGTACGGCGGACCTCTTT 取 PCR 反 应 液 5 μl 进 行 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳, 进 行 0.8% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳, 取 各 个 RNA 样 品 5 μl, 加 入 6 Lording 缓 冲 液 1 μl, 混 匀, 将 所 有 液 体 加 入 凝 胶 加 样 孔 中 以 100 bp DNA Ladder marker 作 为 参 照,80 V 电 压 下 电 泳 25 min 应 用 BIO

中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 21 期 2014 年 11 月 3127 IMAGING SYSTEM(Gene Snap) 照 像,Gene Tools 收 集 数 据, 以 作 为 内 标, 以 目 的 基 因 / 的 值 为 目 的 基 因 相 对 表 达 值 2.6 统 计 分 析 采 用 SPSS 13 软 件 包 进 行 分 析, 数 据 均 用 x ± s 表 示, 组 间 比 较 采 用 单 因 素 ANOVA( 方 差 分 析 ) 进 行 显 著 性 检 验 3 结 果 3.1 对 甲 状 腺 肿 大 模 型 大 鼠 甲 状 腺 激 素 水 平 的 影 响 就 甲 状 腺 质 量 而 言, 模 型 组 甲 状 腺 系 数 较 对 照 组 显 著 增 加 (P<0.05), 阳 性 药 组 及 配 比 2 4 5 7 组 大 鼠 的 甲 状 腺 系 数 较 模 型 组 显 著 降 低 (P< 0.05), 表 明 配 比 2 4 5 7 组 与 阳 性 药 组 具 有 明 显 恢 复 甲 状 腺 肿 大 的 作 用 与 对 照 组 相 比, 模 型 组 大 鼠 血 清 激 素 水 平 T 3 T 4 未 出 现 降 低 反 而 有 一 定 的 升 高, 究 其 原 因 可 能 与 模 型 复 制 方 法 有 关 总 体 观 察 激 素 水 平 相 关 指 标, 海 藻 玉 壶 汤 配 比 1 4 组 具 有 回 调 这 种 反 跳 引 起 的 T 3 T 4 水 平 增 高 的 作 用, 并 对 大 鼠 血 清 中 TSH 水 平 的 升 高 有 一 定 的 抑 制 作 用, 在 某 种 程 度 上 对 丙 硫 氧 嘧 啶 引 起 的 血 清 中 甲 状 腺 激 素 水 平 失 调 具 有 一 定 的 恢 复 作 用 具 体 结 果 见 表 3 4 3.2 对 甲 状 腺 肿 大 大 鼠 模 型 甲 状 腺 组 织 TPO 和 Tg mrna 表 达 的 影 响 实 验 结 果 表 明, 配 比 1 5 组 TPO mrna 的 表 达 较 对 照 组 显 著 上 升, 具 有 统 计 学 意 义 (P<0.05), 其 他 各 个 给 药 组 都 有 升 高 的 趋 势, 但 无 显 著 性 差 异 ; 与 模 型 组 比 较, 配 比 5 组 TPO mrna 的 表 达 表 3 甘 草 海 藻 不 同 配 比 海 藻 玉 壶 汤 对 甲 状 腺 肿 大 模 型 大 鼠 血 清 中 T 3 T 4 FT 3 FT 4 水 平 的 影 响 ( x± Table 3 Effects of HYD with different compatibility of Sargassum and Glycyrrhizae Radix on levels of T 3, T 4, FT 3, and FT 4 in serum of goiter rats ( x± 组 别 动 物 / 只 甲 状 腺 系 数 T 3 / (ng ml 1 ) T 4 / (ng ml 1 ) FT 3 / (pg ml 1 ) FT 4 / (pg ml 1 ) 对 照 10 0.033±0.012 0.87±0.23 74.64± 8.63 5.69±1.15 14.84±1.28 模 型 11 0.042±0.008 # 1.31±0.23 # 80.85± 9.13 6.34±1.39 15.06±1.97 阳 性 药 12 0.033±0.008 * 0.97±0.20 * 92.11± 5.93 #* 6.19±1.37 18.93±0.53 #* 配 比 1 12 0.035±0.008 1.25±0.31 # 76.44± 8.70 7.42±1.62 # 13.39±2.21 #* 配 比 2 11 0.034±0.007 * 1.56±0.06 #* 86.93± 9.77 8.71±1.21 #* 14.72±2.28 配 比 3 12 0.035±0.012 1.23±0.35 # 75.71±12.91 7.13±2.11 # 14.40±2.26 配 比 4 12 0.032±0.005 * 1.26±0.26 # 68.68± 6.89 * 7.42±1.65 13.36±1.01 #* 配 比 5 12 0.031±0.005 * 1.24±0.24 # 71.21±10.63 * 7.53±1.81 # 12.89±1.45 #* 配 比 6 11 0.038±0.008 1.14±0.16 # 65.34±13.58 #* 7.03±1.31 # 13.22±0.97 #* 配 比 7 9 0.034±0.009 * 1.22±0.25 # 69.66± 8.15 #* 6.65±1.48 13.29±0.72 #* 与 对 照 组 比 较 : # P<0.05; 与 模 型 组 比 较 : * P<0.05, 下 同 # P < 0.05 vs control group; * P < 0.05 vs model group, same as below 表 4 甘 草 海 藻 不 同 配 比 海 藻 玉 壶 汤 对 甲 状 腺 肿 大 模 型 大 鼠 血 清 中 TSH TRH TBG PTH 水 平 的 影 响 ( x± Table 4 Effects of HYD with different compatibility of Sargassum and Glycyrrhizae Radix on levels of TSH, TRH, TBG, and PTH in serum of goiter rats ( x± 组 别 动 物 / 只 TSH / (μu ml 1 ) TRH / (pg ml 1 ) TBG / (ng ml 1 ) PTH / (ng ml 1 ) 对 照 10 4.02±0.69 17.95±0.71 10.50±1.26 71.81±13.48 模 型 11 4.81±0.62 # 18.52±0.89 11.72±1.33 # 65.98± 9.38 阳 性 药 12 4.79±0.77 # 18.84±1.18 # 11.31±1.53 78.32±18.68 * 配 比 1 12 4.31±0.53 18.16±0.99 11.13±1.35 93.25±13.07 #* 配 比 2 11 4.70±0.61 # 18.65±1.06 11.77±1.26 # 71.47± 8.58 配 比 3 12 5.35±0.98 #* 19.13±0.88 # 11.58±1.20 # 90.32±10.98 #* 配 比 4 12 4.73±0.89 # 18.49±0.86 10.64±0.85 * 84.99±10.16 #* 配 比 5 12 4.46±0.57 18.34±0.79 11.41±1.24 80.83±10.47 * 配 比 6 11 5.12±0.79 # 18.99±0.87 # 11.38±1.23 93.35± 5.73 #* 配 比 7 9 5.01±1.01 # 18.55±1.30 11.18±0.83 101.94± 7.34 #*

3128 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 21 期 2014 年 11 月 显 著 升 高 (P<0.05) 配 比 1 5 6 组 的 Tg mrna 水 平 较 对 照 组 显 著 升 高 (P<0.05), 其 余 给 药 各 组 都 有 升 高 的 趋 势, 但 无 显 著 性 差 异 ; 与 模 型 组 比 较, 除 阳 性 药 组 Tg mrna 水 平 较 模 型 组 有 降 低 趋 势 外, 其 余 各 组 较 模 型 组 Tg mrna 的 表 达 无 显 著 性 差 异, 结 果 见 表 5 电 泳 结 果 见 图 1 2 4 讨 论 丙 硫 氧 嘧 啶 导 致 的 甲 状 腺 功 能 减 退, 其 主 要 表 现 为 甲 状 腺 激 素 合 成 分 泌 或 生 物 效 应 不 足 等 方 面 碘 是 机 体 必 要 的 微 量 元 素, 是 甲 状 腺 合 成 甲 状 腺 素 的 基 本 物 质 基 础 [4] 当 机 体 对 碘 的 合 成 功 能 减 退 时, 机 体 即 会 出 现 以 碘 摄 入 不 足 为 表 现 的 甲 状 腺 激 素 合 成 不 足 的 病 理 表 现 甲 状 腺 功 能 减 退 动 物 模 型 复 制 是 以 T 3 T 4 显 著 降 低,TSH 显 著 升 高 为 成 功 标 志 [5] 而 本 实 验 中 出 现 的 现 象 为 TSH 显 著 升 高, 但 T 3 水 平 亦 显 著 升 高, 表 5 甘 草 与 海 藻 不 同 配 比 海 藻 玉 壶 汤 对 甲 状 腺 肿 大 模 型 大 鼠 甲 状 腺 组 织 TPO 和 Tg mrna 表 达 的 影 响 ( x± Table 5 Effects of HYD with different compatibility of Sargassum and Glycyrrhizae Radix on subtype mrna expression of TPO and Tg ( x± 组 别 TPO/ Tg/ 对 照 0.596±0.121 (n=7) 0.825±0.259 (n=7) 模 型 0.656±0.144 (n=8) 1.063±0.341 (n=8) 阳 性 药 0.631±0.122 (n=8) 0.960±0.393 (n=8) 配 比 1 0.789±0.123 # (n=8) 1.245±0.302 # (n=8) 配 比 2 0.737±0.226 (n=7) 1.150±0.402 (n=7) 配 比 3 0.737±0.132 (n=8) 1.085±0.363 (n=8) 配 比 4 0.706±0.170 (n=7) 1.071±0.220 (n=7) 配 比 5 0.862±0.229 #* (n=8) 1.206±0.236 # (n=6) 配 比 6 0.745±0.171 (n=7) 1.201±0.269 # (n=6) 配 比 7 0.657±0.194 (n=6) 1.044±0.327 (n=6) TPO 对 照 模 型 阳 性 药 配 比 1 配 比 2 TPO 配 比 3 配 比 4 配 比 5 配 比 6 配 比 7 图 1 各 组 大 鼠 甲 状 腺 组 织 TPO mrna 表 达 电 泳 结 果 Fig. 1 Electrophoresis results of TPO mrna expression of thyroid tissue of rats in each group Tg 对 照 模 型 阳 性 药 配 比 1 配 比 2 Tg 配 比 3 配 比 4 配 比 5 配 比 6 配 比 7 图 2 各 组 大 鼠 甲 状 腺 组 织 Tg mrna 表 达 电 泳 结 果 Fig. 2 Electrophoresis results of Tg mrna expression of thyroid tissue of rats in each group 究 其 原 因 可 能 与 造 模 方 式 有 关 本 实 验 采 取 造 模 2 周 后, 在 给 药 28 d 期 间, 每 隔 2 d ig 给 予 丙 硫 氧 嘧 啶 稳 定 模 型, 可 能 是 由 于 没 有 连 续 给 药 的 原 因, 或 给 药 间 隔 时 间 稍 长 等 原 因 使 T 3 T 4 代 偿 性 增 高, 需 在 后 续 实 验 中 改 进 造 模 方 法 后 再 对 实 验 结 果 加 以 验 证 亚 临 床 甲 状 腺 功 能 减 退 症 简 称 亚 临 床 甲 减, 又 称 轻 度 甲 状 腺 功 能 衰 竭 (mildthyridfailure,mtf), 其 表 现 是 以 TSH 水 平 升 高 和 血 清 T 4 水 平 正 常 为 特 征 的 甲 状 腺 疾 病 垂 体 分 泌 TSH 受 2 方 面 的 影 响, 其 一 为 下 丘 脑 分 泌 的 促 甲 状 腺 激 素 释 放 激 素 (TRH) 的 促 进 性 影 响, 其 二 受 到 T 3 T 4 反 馈 性 的 抑 制 性 影 响, 二 者 互 相 拮 抗, 它 们 组 成 下 丘 脑 - 腺 垂 体 - 甲 状 腺 轴 正 常 情 况 下, 机 体 下 丘 脑 分 泌 的 TRH 量 与 腺 垂 体 甲 状 腺 轴 的 反 馈 调 节 密 切 相 关 TRH 分 泌 增 多, 则 血 中 T 3 T 4 水 平 较 高, 当 血 中 T 3 T 4 超 过 一 定 水 平 后 就 会 反 馈 性 地 抑 制 腺 垂 体 分 泌 TSH, 从 而 降 低 垂 体 对 TRH 的 敏 感 性, 保 持 血 中 T 3 T 4 水 平 相 对 恒 定 本 实 验 中 模 型 组 及 给 药 组 大 鼠 血 清 中 TRH 的

中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 21 期 2014 年 11 月 3129 量 均 较 对 照 组 升 高, 其 进 而 促 进 垂 体 分 泌 相 应 的 TSH, 从 数 值 上 看 TRH 的 升 高 与 TSH 的 升 高 幅 度 基 本 平 行, 但 TSH 的 升 高 未 受 到 T 3 的 反 馈 性 抑 制, 其 原 因 可 能 与 反 馈 机 制 尚 未 启 动, 大 鼠 血 清 中 TSH 水 平 下 降 较 慢, 从 而 使 T 3 处 于 较 高 的 水 平 此 外 还 有 文 献 表 明, 碘 缺 乏 时, 甲 状 腺 内 甲 状 腺 激 素 合 成 前 体 一 碘 酪 氨 酸 (MIT) 二 碘 酪 氨 酸 (DIT) 合 成 明 显 减 少, 同 时 甲 状 腺 I 型 脱 碘 酶 (Dl)mRNA 表 达 有 所 增 高, 活 性 增 强, 其 作 用 为 促 进 T 4 转 变 为 T 3, 因 此 甲 状 腺 组 织 内 T 3 T 4 水 平 均 明 显 下 降 在 机 体 碘 供 应 不 足 的 条 件 下 优 先 合 成 T 3 以 满 足 大 多 数 组 织 代 谢 的 需 要, 避 免 周 围 组 织 甲 减 的 发 生 此 为 一 种 经 济 有 效 的 代 偿 机 制 在 碘 缺 乏 早 期,T 3 及 FT 3 会 呈 代 偿 性 增 高, 但 长 期 处 于 碘 缺 乏 状 态 则 使 机 体 失 去 代 偿 能 力, 机 体 会 呈 现 出 明 显 甲 减 症 状 [6] 推 测 在 实 验 期 间, 由 于 间 断 性 ig 丙 硫 氧 嘧 啶, 造 成 碘 缺 乏 症 早 期 症 状, 进 而 出 现 T 3 与 TSH 同 时 升 高 的 现 象 后 续 实 验 过 程 中 将 考 虑 在 给 药 期 间 连 续 补 充 丙 硫 氧 嘧 啶 以 稳 定 模 型 的 方 法 进 行 实 验 甲 状 腺 滤 泡 细 胞 的 功 能 在 于 合 成 对 人 体 代 谢 极 为 重 要 的 甲 状 腺 激 素 该 过 程 需 要 碘 Tg TPO H 2 O 2 等 4 种 重 要 成 分 并 依 赖 TSH-cAMP 系 统 的 调 节 由 此 可 见,Tg 和 TPO 是 甲 状 腺 激 素 合 成 过 程 中 2 个 至 关 重 要 的 因 素 TPO 在 碘 氧 化 铬 氨 酸 碘 化 以 及 碘 化 铬 氨 酸 偶 联 至 甲 状 腺 球 蛋 白 上 等 甲 状 腺 激 素 合 成 过 程 中 起 重 要 的 催 化 作 用 对 于 丙 硫 氧 嘧 啶 引 起 甲 状 腺 激 素 水 平 的 下 降, 国 内 外 学 者 通 常 认 为 与 其 抑 制 TPO 的 活 性 有 关 [7-8], 也 有 学 者 认 为 其 过 程 还 涉 及 到 丙 硫 氧 嘧 啶 对 Tg 合 成 的 抑 制, 与 丙 硫 氧 嘧 啶 造 成 甲 状 腺 滤 泡 细 胞 粗 面 内 质 网 损 伤 有 关 [9-10] 丙 硫 氧 嘧 啶 引 起 的 甲 减 导 致 TSH 反 馈 性 升 高, 又 可 通 过 信 号 转 导 途 径 促 进 TPO Tg 等 基 因 的 转 录 而 具 有 代 偿 意 义 [11] 本 研 究 结 果 表 明, 模 型 组 及 给 药 各 组 的 TPO mrna 均 高 于 对 照 组, 且 配 比 1 5 组 显 著 高 于 对 照 组 (P<0.05) 由 此 可 见, 丙 硫 氧 嘧 啶 对 TPO 的 抑 制 不 是 发 生 在 转 录 阶 段 相 反,TPO 在 转 录 水 平 的 表 达 增 高, 对 于 丙 硫 氧 嘧 啶 导 致 的 甲 减 具 有 一 定 的 代 偿 意 义 如 果 这 一 代 偿 机 制 足 够 充 分 的 话, 血 清 甲 状 腺 激 素 水 平 将 会 趋 于 正 常 [12] 结 合 血 清 甲 状 腺 激 素 结 果 可 以 看 到, 血 清 中 T 3 T 4 的 量 较 对 照 组 升 高, 但 血 清 中 TSH 的 量 并 未 有 所 降 低, 依 然 位 于 高 位 上 述 研 究 提 示, 本 实 验 中 丙 硫 氧 嘧 啶 所 致 的 TPO 转 录 增 强, 可 能 与 TSH 的 反 馈 性 升 高 有 关, TPO 转 录 增 强 所 起 到 的 代 偿 作 用 并 不 充 分 海 藻 玉 壶 汤 配 比 1 5 组 使 这 种 代 偿 作 用 增 强, 提 示 激 素 合 成 功 能 增 强, 这 是 甲 状 腺 对 缺 碘 的 代 偿 性 适 应, 这 种 代 偿 作 用 与 海 藻 玉 壶 汤 中 海 藻 和 甘 草 的 比 例 暂 无 明 显 的 线 性 关 系 有 文 献 表 明,TSH 的 升 高, 可 以 刺 激 Tg 的 转 录, 从 本 实 验 结 果 来 看, 与 文 献 报 道 基 本 一 致,Tg 的 转 录 水 平 未 受 到 丙 硫 氧 嘧 啶 的 抑 制, 配 比 1 5 6 组 具 有 促 进 Tg 转 录 的 作 用, 在 某 种 程 度 上 具 有 恢 复 甲 状 腺 激 素 达 到 正 常 水 平 的 作 用 综 上 所 述, 通 过 丙 硫 氧 嘧 啶 致 甲 状 腺 肿 大 动 物 模 型 研 究, 除 了 通 常 认 为 的 抑 制 TPO 的 活 性, 还 可 能 涉 及 Tg 在 转 录 和 翻 译 水 平 的 抑 制 TSH 水 平 增 高 对 TPO 基 因 的 转 录 刺 激 作 用 不 能 起 到 充 分 的 代 偿 作 用, 海 藻 玉 壶 汤 的 配 比 1 5 组 具 有 促 进 这 种 代 偿 增 强 的 作 用, 在 某 种 程 度 上 对 甲 状 腺 激 素 水 平 的 恢 复 起 到 积 极 的 作 用, 但 还 需 结 合 甲 状 腺 激 素 合 成 相 关 基 因, 如 钠 碘 转 运 体 (NIS) Dl 表 达 的 变 化 进 行 了 深 入 分 析 此 外, 实 验 结 果 并 未 显 示 出 由 于 海 藻 甘 草 配 伍 比 例 的 改 变 使 相 关 基 因 TPO Tg mrna 表 达 发 生 改 变 的 线 性 关 系 有 文 献 表 明, 非 富 碘 中 药 复 方 对 于 大 鼠 甲 状 腺 功 能 与 形 态 的 改 变 亦 有 一 定 疗 效, 这 就 说 明 富 碘 中 药 复 方 不 单 纯 靠 含 碘 的 成 分 发 挥 作 用, 在 复 方 中, 各 药 物 之 间 亦 有 相 互 作 用, 既 有 协 同 作 用, 也 有 拮 抗 作 用 [13] 因 此, 在 今 后 的 实 验 研 究 中, 可 以 考 虑 去 除 相 应 的 富 碘 中 药, 进 行 海 藻 玉 壶 汤 的 拆 方 研 究, 以 期 为 阐 明 海 藻 玉 壶 汤 对 甲 减 大 鼠 甲 状 腺 功 能 恢 复 的 调 控 机 制 提 供 实 验 依 据 参 考 文 献 [1] 李 怡 文, 钟 赣 生, 王 茜, 等. 含 反 药 配 伍 的 海 藻 玉 壶 汤 临 床 应 用 分 析 [J]. 南 京 中 医 药 大 学 学 报, 2011, 27(4): 317-321. [2] 丁 选 胜, 李 欧, 阚 毓 铭. 海 藻 甘 草 及 其 不 同 比 例 配 伍 后 的 水 提 取 物 的 肝 毒 性 研 究 - 对 离 体 大 鼠 肝 灌 流 液 中 AST ALT 的 影 响 [J]. 南 京 中 医 药 大 学 学 报, 2003, 19(1): 28-31. [3] 李 怡 文, 钟 赣 生, 柳 海 艳, 等. 海 藻 甘 草 配 伍 组 合 及 其 复 方 海 藻 玉 壶 汤 的 急 性 毒 性 实 验 比 较 研 究 [J]. 科 技 导 报, 2012(34): 18-23. [4] 郭 若 霖, 左 爱 军, 赵 学 勤, 等. 缺 碘 对 发 育 期 大 鼠 甲 状 腺 激 素 水 平 的 影 响 [J]. 中 国 地 方 病 学 杂 志, 2003, 22(3): 280-281.

3130 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 21 期 2014 年 11 月 [5] Baksi S N. Effect of propylthiouracil-induced hypothyroidism on serum levels of luteinizing hormone and follicle-stimulating hormone in the rat [J]. J Endocriol, 1973, 59: 655-656. [6] 陈 祖 培, 阎 玉 芹, 项 建 梅, 等. 碘 缺 乏 和 碘 过 量 大 鼠 动 物 模 型 的 复 制 及 其 碘 代 谢 的 对 比 观 察 [J]. 中 国 地 方 病 学 杂 志, 2005, 24(3): 242-244. [7] Degroot L J, Niepomniszcze H. Biosynthesis of thyroid hormone: basic and clinical aspects [J]. Metabolism, 1977, 26(6): 665-718. [8] Vickers A E, Heale J, Sinclair J R, et al. Thyroid organotypic rat and human cultures used to investigate drug effects on thyroid function, hormone synthesis and release pathways [J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2012, 260(1): 81-88. [9] 孙 丁, 王 津 涛, 潘 红 梅, 等. 甲 状 腺 素 干 扰 物 对 甲 状 腺 滤 泡 细 胞 分 泌 甲 状 腺 球 蛋 白 的 影 响 [J]. 环 境 与 健 康 杂 志, 2003, 20(4): 210-212. [10] 商 维 维, 罗 建, 程 薇 波, 等. PTU 对 大 鼠 甲 状 腺 TPO Tg mrna 表 达 的 影 响 [J]. 四 川 大 学 学 报 : 医 学 版, 2010, 41(3): 428-431. [11] Braverman L E, Ut iger R D. Werner and Ingbar s the thyroid. A Fundamental and Clinical Text [M]. The 8th ed. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins, 2000. [12] McClain R M. Mechanistic consideration for the relevance of animal data on thyroid neoplasia to human risk assessment [J]. Mutat Res, 1995, 333(1): 131-148. [13] 时 杨, 高 天 舒, 杨 柳. 富 碘 中 药 复 方 对 甲 亢 大 鼠 甲 状 腺 功 能 和 形 态 的 影 响 [J]. 辽 宁 中 医 药 大 学 学 报, 2009, 11(9): 186-188.