中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 2013, 38(9) http://www.csumed.org; http://xbyx.xysm.net 869 ARTICLES 论著 DOI:10.3969/j.issn.1672-7347.2013.09.001 http://xbyx.xysm.net/xbwk/fileup/pdf/201309869.pdf 肝癌相关基因的分子克隆和可变剪切分析 刘艳红, 赵艳洁, 房淑娟, 李跃辉, 李官成 ( 中南大学肿瘤研究所, 卫生部癌变原理重点实验室, 教育部癌变与侵袭原理重点实验室, 长沙 410078) [ 摘要 ] 目的 : 获取肝癌相关基因 (hepatoma associated gene,hta) 的 mrna 分子全长序列并对其可变剪接进行分析, 检测其转录本在各肝癌细胞系中的表达, 为进一步研究该基因在肝癌发生 发展中的作用奠定基础 方法 : 用 3'RACE 和 5'RACE 方法扩增 HTA 基因的全长序列并对其序列信息和可变剪接进行扩增和测序分析, 用 Northern 印迹检测该基因转录本在不同肝癌和正常肝细胞系中的表达 结果 :HTA 基因全长序列为 1414 bp, 经分析该序列包含 3 个外显子, 2 个内含子, 其中 2 号内含子在可变剪接中被作为外显子表达 Northern 印迹显示 HTA 基因 1.7 kb 转录本和 1.4 kb 转录本均表达于恶性肝癌细胞系, 而不表达于正常细胞系 结论 : 成功获得了 HTA 基因的全长序列并对其可变剪接进行了分析,2 个大小不同的转录本均在肝癌细胞系中特异性表达, 作为一个肝癌相关基因值得进一步深入研究 [ 关键词 ] 肝癌相关基因 ; 全长克隆 ; 可变剪接 Molecular cloning and alternative splicing analysis of hepatoma associated gene HTA LIU Yanhong, ZHAO Yanjie, FANG Shujuan, LI Yuehui, LI Guancheng (Institute of Cancer Research, Central South University; Key Laboratory of Carcinogenesis of Chinese Ministry of Public Health; Key Laboratory of Carcinogenesis and Invasion Theory of Chinese Ministry of Education, Changsha 410078, China) ABSTRACT Objective: To obtain the full length cdna sequences of hepatoma associated gene HTA, analyze its alternative splicing, detect the expression pattern of 2 HTA gene transcripts in different hepatic cell lines, and to establish a base for further study of HTA gene function in hepatocellular carcinoma (HCC) occurence and development. Methods: The full length cdna of HTA gene was cloned by rapid amplification of cdna 3' ends (3'-RACE), rapid amplification of cdna 5' ends (5'-RACE) and DNA sequencing. The gene structure and alternative splicing were analysed. Northern blot assay was performed to detect the 收稿日期 (Date of reception):2012-10-07 作者简介 (Biography): 刘艳红, 博士, 助理研究员, 主要从事基因工程抗体和肿瘤免疫治疗方面的研究 通信作者 (Corresponding author): 李官成,Email: libsun@163.com 基金项目 (Foundation items): 国家重点基础研究发展计划 ( 973 计划 )(2010CB833605); 国家自然科学基金 (81201903); 湖南省自然科学基金 (2010SK3132) This work was supported by the Major State Basic Research Development Program ("973") (2010CB833605); the National Natural Science Foundation of China(81201903) and the Natural Science Foundation of Hunan Province, P. R. China (2010SK3132).
870 中南大学学报 ( 医学版 ), 2013, 38(9) http://www.csumed.org; http://xbyx.xysm.net expression pattern of 2 HTA gene transcripts in different hepatic cell lines. Results: The full length of HTA gene was 1414 bp, composed of 3 exons and 2 introns, and the second intron could be retained in mrna. Northern blot assay showed that 2 transcripts of HTA mrna(1.4 kb and 1.7 kb) could express in the HCC cell lines HepG2 and QGY-7703, but not in the non-malignant cell line L-02 and HUVEC. The expression level of 1.4 kb transcript was much higher than 1.7 kb one. Conclusion: This study successfully has obtained the full length cdna of HTA gene, and analysed the gene sequence and alternative splicing, 2 transcripts of HTA mrna specifically expressed in HCC cell lines. As a hepatoma associated gene, HTA deserves further investigation. KEY WORDS HTA; full length cloning; alternative splicing 肝癌 (hepatocellular carcinoma,hcc) 是恶性程度极高 预后极差的恶性肿瘤, 占原发性肝癌 (primary hepatocellular carcinoma,phc) 的 91.5%, 其在世界范围内每年的发病率排第 5 位, 病死率居第 3 位 [1] 中国每年死于肝癌的人数为 11 万, 占世界肝癌死亡人数的 45% [2] HCC 的发病机制涉及多因素影响 多基因调控 多信号通路参与, 其根源是基因表达异常 [3] 基因表达异常导致细胞黏附力异常, 特定信号转导通路异常, 细胞凋亡程序异常等, 最终造成细胞失控性增殖 异常分化 癌变发生 因此, 对与 HCC 发生发展相关基因的进一步了解, 将有助于从根源上阐明 HCC 发生发展的规律, 筛选出更多的可用于早期筛查和诊断的高特异性 高灵敏度指标, 为今后该疾病的治疗和预防提供新的靶点 [4] 在前期工作中, 为寻找新的肿瘤标志物, 我们利用肿瘤基因组解剖计划 (CGAP) 网站的 cdna xprofile 工具 (http://cgap.nci.nih.gov/tissues/ xprofiler), 以人类正常组织和肿瘤组织 EST 数据库为基础, 结合电子杂交分析, 得到了一些在肿瘤组织中特异性表达的 EST 序列, 其中 NM 001101347 是一个全新的未知序列, 在数据库中尚未找到与其有同源序列的基因 我们用 RT-PCR 验证结果证实该基因不表达于正常组织, 只在少数肿瘤组织中表达, 在 HCC 组织中阳性率相对较高, 故将其命为 HCC 相关基因 (hepatoma associated gene, HTA) 对该基因进行初步的功能研究发现稳定转染 si-hta 后,HCC 细胞系 HepG2 生长速度明显降低, 平均倍增时间明显延长, 集落形成率明显降低 ;G 1 期细胞增多,S 期细胞减少, 体内成瘤能力下降 [5] 同时还发现, 沉默 HTA 基因后,HepG2 细胞中 caspase3, caspase4, bcl-xl, cyclind1,nf-kappab 等一些凋亡相关分子的表达水平发生不同程度的改变 以上结果提示 HTA 基 因可能在 HCC 发生发展中起重要作用, 且其作用 机制可能与 HCC 细胞的增殖和凋亡相关 作为一个肝癌相关基因,HTA 基因在肿瘤和 HCC 中的特异性表达及其增殖 凋亡相关作用机制 值得进一步研究 但由于 HTA 是从 EST 数据库中筛 选得到的一个全新的基因, 我们有必要在对其进行 进一步研究之前, 获取其全长并进行分析, 阐明该 基因的基本序列结构信息, 为进一步深入探讨 HTA 的功能和作用机制打下基础 本实验通过 cdna 末 [6-7] 端快速扩增的方法获取 HTA 基因的全长并分析其 基因结构, 同时用 Northern 印迹验证 HTA 基因转录 本大小及其在 HCC 细胞系中的表达 1 材料与方法 1.1 主要材料 人 HCC 细胞系 HepG2, 正常肝细胞系 L-02 和脐 静脉内皮细胞 HUVEC 为本室保存 人 HCC 细胞系 QGY-7703 购自中国科学院上海生命科学研究院细 胞资源中心 该细胞系于 1977 年建系, 取材自中国 HCC 高发地区启东的 1 名 35 岁女性 HCC 患者 染色 体数目变化大, 异倍体多 甲胎蛋白 (α-fetoprotein, AFP) 阳性, 异体移植能力强 [8] 细胞培养基 双抗溶液及新生牛血清购自美国 Hyclone 公司 3'/5'RACE 试剂盒为美国 Clontech 公司产品,DIG Northern Starter Kit 为美国 Roche 公司产品 真核表 达载体 pcdna3.1(+) 为本实验室保存,pGEM-T easy 载体购自美国 Promega 公司 RNA 抽提试剂 TRIzol 购自美国 Life Technologies 公司 带正电的尼龙膜 Biodyne Plus 购自美国 Pall 公司 RT-PCR 试剂盒 Taq 酶 T4 连接酶及各种限制性内切酶均购自美国 Fermentas 公司 质粒抽提试剂盒 DNA 胶回收试剂 盒购自上海索莱宝生物科技有限公司 寡核苷酸引 物由上海 Invitrogen 生物公司合成
肝癌相关基因的分子克隆和可变剪切分析刘艳红, 等 871 1.2 方法 1.2.1 细胞系总 RNA 和 mrna 的提取细胞系 HepG2, QGY-7703, L-02, HUVEC 培养在高糖 DMEM 培养基中常规培养 (37, 5%CO 2 ),0.25% 胰蛋白酶消化收集细胞加 TRIzol 试剂, 按照 TRIzol 试剂盒说明书抽提细胞系总 RNA 以此总 RNA 为 3'/5'RACE 的起始样品 在此基础上使用 Promega 公司的链霉抗生物素蛋白 - 磁珠系统从细胞总 RNA 中提取 mrna 作为 Northern 印迹实验样品 得到的细胞总 RNA 和 mrna 样品通过分光光度计测其 D(260 nm)/d(280 nm) RNA 温度孵育实验及甲醛变性电泳检测其纯度和完整性 1.2.2 3'RACE 和 5'RACE 扩增 HTA 基因全长根据 HTA 基因已知序列, 按照 RACE 实验要求设计 3 'RACE 和 5 'RACE 需要的 HTA 基因特异性引物 GSP1 和 GSP2 及巢式 PCR 引物 NGSP1 如图 1 表 1 所示 分别以 1 µ g HepG2 细胞总 RNA 样 品为材料, 按照 Clontech Smarter TM RACE cdna Amplification Kit 的操作流程生成 3 'RACE ready cdna 和 5'RACE ready cdna, 分别用 Upper primer mix+gsp1 引物对,Upper primer mix+gsp2 引物对扩增 HTA 基因的 3'/5' 序列 RACE PCR 采用 Touch down PCR 程序 具体如下 :94,30 s,72,3 min,5 个循环 ;94,30 s,70,30 s;72 ; 3min; 5 个循环 ;94, 30 s, 68, 30 s, 72,3 min,30 个循环 PCR 产物 5 µl 经 1% 琼脂糖凝胶电泳分析后通过 Image master VDS 凝胶成像系统记录结果 RACE PCR 产物稀释 25 倍作为巢式 PCR 的模板 分别用 3'/5' 巢式 PCR 引物对进行巢式 PCR 扩增 程序如下 :94,30 s,68,30 s, 72,3 min,30 个循环 PCR 产物经 1% 低熔点琼脂糖凝胶电泳分离后切下目的条带用 DNA 胶回收试剂盒回收并连接 pgem-t easy 载体, 连接产物转化大肠杆菌 DH5ɑ 挑取阳性克隆测序 Region of overlap Region to be amplified by 5'-RACE Region to be amplified by 3'-RACE 5' 3' GSP2 NGSP2 3' 5' Generalized first-strand cdna NGSP1 GSP1 图 1 3'/5'RACE 各引物对位置和扩增方向示意图 Figure 1 Location and direction of primers for 3'/5' RACE. 表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences 引物名称 Universal Primer (long) Universal Primer (short) Nested Universal Primer GSP1 GSP2 NGSP1 HTA-cDNA-F HTA-cDNA-R HTA-probe-F HTA-probe-R-T7 GAPDH-probe-F GAPDH-probe-R-T7 序列 (5' to 3') CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT CTAATACGACTCACTATAGGGC AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT TCTGCTGGAGGTGAGGGCTCGTGGT ATGGGTTGCTTGGGGCATCCTGTG GTCGGGGTTGTTCTTGTTTTCAG CGAAGATTTCTTATAGACAGGC GGAGGGCATTATGGTGAG CTATTTATGGGTTGCTTGG CTAATACGACTCACTATAGGGAGAGAGGGCATTATGGTGAGAT AATCCCATCACCATCTTCC CTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCTGTAGCCAAATTCGTTGT
872 中南大学学报 ( 医学版 ), 2013, 38(9) http://www.csumed.org; http://xbyx.xysm.net 1.2.3 HTA 基因结构和可变剪接的分析 将 RACE 产物各阳性克隆测序结果统一分析, blast 拼接后用 ORF-finder 软件预测 HTA 基因结构 通过分析结果设计 HTA 全长引物 HTA-cDNA-F 和 HTA cdna-r( 表 1) 进行 PCR 扩增, 得到 HTA 基因全 长转录本的 cdna 分子 ( 图 2) 将扩增产物分连接 pgem-t easy 载体测序, 比对分析 HTA 基因转录本 的可变剪接情况 1.2.4 Northern 印迹检测 HTA mrna 的表达 设计 HTA 特异性分子探针, 在长度为 589 bp 的探针 5 ' 端加上 24 bp 的 T7 启动子序列 5 '-CTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3', 然后 用体外转录的方法制备地高辛标记的 Northern 印 迹探针 相同方法制备内参基因 GAPDH 的分子探 针, 并根据试剂盒说明流程检测各探针的标记效 率 将 1.2.1 中所得的 4 种细胞系的 mrna 各 100 ng 作为样品进行 2% RNA 甲醛变性电泳 待电泳完成 之后将分离的 mrna 样品用毛细管转移法过夜转 印至合适大小的带正电的尼龙膜上 转膜完成后 用紫外交联 (245 nm,1.5 J/cm 2 照射膜,105 s) 并标 好膜的正面及加样顺序 在 Roche 公司的 DIG Easy Hyb 杂交液中将尼龙膜与标记好的探针在 68, 以 40 r/min 的转速在杂交炉中进行预杂交 1 h 和杂交过 夜 杂交完成后洗膜, 将膜置于标记了碱性磷酸 酶 AP 的地高辛抗体中孵育, 用 Luminescence 化学 发光法检测膜上的杂交信号 DL2000 HTA β-actin 2 结果 2.1 HTA 基因的全长序列方法部分 1.2.1 中提取的总 RNA 和 mrna 经检测其 D(260 nm)/d(280 nm) 均达到 1.9 以上 经 37 孵育和未孵育的样品甲醛变性电泳条带完整一致, 说明 RNA 质量完好 3'/5'RACE PCR 产物连接 pgem-t 载体后用 T7 通用引物测序结果显示扩增片段均与 HTA 已知序列有重叠区域, 经 blast 和序列拼接分析, 得到了长为 1414 bp 的 HTA 的全长序列 ( 图 3) 其 3' 端序列与原本已知的序列相同,HTA 基因的开放阅读框 (open reading frame,orf) 编码 1 个由 92 个氨基酸组成 预测大小为 10.2 kd 的蛋白 在 Genbank 数据库中, 除了在灵长类动物基因组中发现有其同源序列之外, 没有找到与 HTA 基因有很高相似度的基因序列 同时, 其预测蛋白序列的相似性比对也没有发现与 HTA 蛋白相似序列的已知蛋白 用 NCBI 提供的预测蛋白保守结构域的在线工具 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb. cgi) 也显示 HTA 蛋白没有保守的结构域 2.2 HTA 基因结构及可变剪接分析将 HTA 的全长序列和 HTA 基因对应的基因组序列输入 NCBI 的在线预测软件 ORF finder 中, 分析结果显示在 HTA 基因全长序列中包含 3 个外显子 2 个内含子序列, 而经 HTA 基因全长验证的 RT-PCR 结果显示 HTA mrna 有 2 个剪接体, 大小分别为 1.4 kb 和 1.7 kb( 图 3) 经 PCR 产物回收测序结果显示,1.4 kb 转录本即为 1.7 kb 第 2 号内含子存在可变剪切 长度为 252 bp 的第 2 号内含子在剪切过程中可被剪切掉, 或者留下成为成熟 mrna 的一部分 ( 图 4) 图 2 HTA 基因的全长扩增 Figure 2 Full length amplification of HTA gene. 2.3 Northern 印迹检测 HTA mrna 在不同 HCC 细胞系中的表达目的基因 HTA 和内参基因 GAPDH 的地高辛探针在稀释至 0.3 pg/µl 时仍能被检测到, 说明标记效率均达到杂交实验的要求 ( 图 5A) Northern 印迹结果显示 :HTA 的 1.4 kb 和 1.7 kb 转录本在 HCC 细胞系 HepG2 和 QGY-7703 中均有表达, 且 1.4 kb 转录本表达量远高于 1.7 kb 转录本, 而这两种转录本在正常肝细胞系 L-02 以及 HUVEC 细胞中未见表达 ( 图 5B)
肝癌相关基因的分子克隆和可变剪切分析刘艳红, 等 873 图 3 HTA 基因的全长序列及预测氨基酸序列 Figure 3 Full length sequence and the corresponding amino acid sequence of HTA gene. 10 pg/µl 3 pg/µl 1 pg/µl 0.3 pg/µl A HTA GAPDH A HUVEC L-02 HepG2 QGY-7703 B HTA 1.7 kb HTA 1.4 kb Exon 1 Exon 2 Exon 3 C GAPDH 1.3 kb B 图 4 HTA 基因的可变剪接 A:1.4 kb 转录本测序片段 ;B: 1.7 kb 转录本测序片段 ;C:HTA 基因可变剪切示意图 Figure 4 Alternative splicing of HTA gene. A: Sequence of 1.4 kb transcript; B: Sequence of 1.7 kb transcript; C: Sketch map of alternative splicing form. 图 5 Northern 印迹检测 HTA 基因在不同肝细胞系中的表达 A:HTA 和 GAPDH 地高辛探针的标记效率 ;B:HTA 和 GAPDH 在不同肝癌细胞系中的表达 Figure 5 Expression of HTA in different hepatic cell lines detected by Northern blot. A: Labeling efficiency of HTA and GAPDH digoxin probes; B: Expression of HTA and GAPDH.
874 中南大学学报 ( 医学版 ), 2013, 38(9) http://www.csumed.org; http://xbyx.xysm.net 3 讨论 HTA 基因是本实验室用生物信息学筛选得到 的一个新的 HCC 相关基因 前期用生物信息学结 合 RT-RCR 验证了该基因的表达特异性, 用干扰试 验揭示了其可能的功能, 但是对于进一步更深入的 研究来说, 首先需要获取该基因的全长, 以此为基 础才能进行后续的蛋白表达 抗体制备 表达谱研 究 以过表达为手段进行的基因功能研究等 获取全长的方法很多, 其中被广泛认可和应 [6] 用的 Smart 技术是基于以下两个观察发展起来 的 :1) 不同反转录酶包括 MMLV 合成的 cdna 3' 端保真度不高 ;2) 不同的反转录酶具有不同的加 尾特性,MMLV 特意的在 cdna 末端加上 3~4 个 dctp 该技术用 MMLV 合成 cdna 第一链, 同时 利用它的加尾特性在合成的 cdna 链 3 ' 加上 3~4 个 dctp, 而且当帽子结构存在时该酶的加尾活性最 高 ( 对全长分子的富集机制 ), 随后这 3~4 个碱基 与体系中事先加入的引物 ( 该引物的 3 ' 端有 3~4 个 dgtp) 配对,MMLV 继而以聚合酶活性将配对引物 补成双链 本研究中 HTA 基因即使在表达量上调 的 HCC 细胞系 HepG2 中,HTA 基因的 mrna 分子 的丰度对于高表达的看家基因来说也是相对较低 的, 这就为其全长的获取带来了一些困难, 本实 验就是选择采用了该 SMART 体系来获取 HTA 基因 [9] 的分子全长 同时用热启动 PCR 酶来抑制反应 升温阶段的非特异性结合, 用 Touch down PCR 程 [10] 序来抑制反应初始阶段的非特异性扩增, 同时 保证反应后期的扩增效率 通过 3 '/5'RACE 扩增出相应的 cdna 序列之 后, 需要进一步确认该序列的正确性及完整性 我们通过全长引物的 RT-PCR 来验证 RACE 的结果 因为 HTA 是灵长类动物中特异性表达的,HTA 基 因仅与人类及类人猿基因组序列匹配, 在其他物 种均未发现有相似序列, 故不能通过同源序列比 [11] 对的方法来确定该基因的全长 在这种情况 下, 该序列是否为基因全长则遵循以下规律 : 得 到的全长序列阅读框架完整, 在 ORF 的起始密码 子 ATG 上游有同框架的终止密码子, 有 poly A 尾 且通过 Northern 印迹实验证实该基因转录本的大小 和获取的全长序列一致 可变剪接是真核生物遗传变异中的常见现 象, 是产生蛋白功能多样性和控制基因表达的重要 机制, 已成为功能基因组时代研究的重点 越来越 多的研究发现, 转录本的可变剪接现象与肿瘤的发 生 发展密切相关 [12-13], 也可作为抗肿瘤药物筛选 的一个重要切入点 [14] 普遍认为生物复杂性被认为 应当以转录组的规模来衡量, 而正是可变剪接使得 许多基因具有多个转录状态, 规模相差不大的基因 组可产生差别巨大的功能状态组 [15] 在人类的遗 传物质中,95% 的多外显子基因存在可变剪接的 现象 [16], 外显子选择性缺失是目前观察到的最主 要的可变剪接形式 [15] 已有实验研究表明, 可变 剪接在产生受体多样性 控制调节生长发育等方面 起决定性作用 [17-18] [19-20], 尤其表现在神经系统和免疫 系统 [21-22], 这与此类系统的功能多样性和反应敏 感性是密切相关的 许多遗传疾病都与剪接发生 异常紧密相关 [23-24], 据估计, 导致疾病的变异中约 15% 会影响 Pre-mRNA 的剪接 HTA 基因中第 2 号内 含子在其 mrna 中选择性的保留, 产生了数量相对 较少, 相对分子质量较大的一部分 mrna 转录本, 这在其癌变过程中是否有其独特意义, 其功能和作 用机制并不清楚, 有待进一步研究 本研究运用 3'/5'RACE 技术和 Northern 印迹技 术成功地获取并证实了新 HCC 相关基因 HTA 的全 长序列并分析了其可变剪接形式 对该基因的基 本结构和信息在原有基础上有了进一步的了解, 也为后续的深入研究提供了必要的保证, 打下了 坚实的基础 参考文献 1. Motola-Kuba D, Zamora-Valdes D, Uribe M, et al. Hepatocellular carcinoma. An overview[ J]. Ann Hepatol, 2006, 5(1): 16-24. 2. El-Serag HB, Rudolph KL. Hepatocellular carcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis[ J]. Gastroenterology, 2007, 132(7): 2557-2576. 3. Zender L, Villanueva A, Tovar V, et al. Cancer gene discovery in hepatocellular carcinoma[ J]. J Hepatol, 2010, 52(6): 921-929. 4. Villanueva A, Minguez B, Forner A, et al. Hepatocellular carcinoma: novel molecular approaches for diagnosis, prognosis, and therapy[ J]. Annu Rev Med, 2010, 61: 317-328. 5. Liu Y, Li Y, Guo F, et al. Identification of HTA as a novel-specific marker for human hepatocellular carcinoma[ J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2010, 136(8): 1187-1192. 6. Scotto-Lavino E, Du G, Frohman MA. 5' end cdna amplification using classic RACE[ J]. Nat Protoc, 2006, 1(6): 2555-2562. 7. Scotto-Lavino E, Du G, Frohman MA. 3' end cdna amplification using classic RACE[ J]. Nat Protoc, 2006, 1(6): 2742-2745. 8. 王金兵, 朱德厚, 叶秀珍, 等. 启东肝癌细胞系 (QGY-7703) 的建 立及其特征 [ J]. 中华肿瘤杂志, 1981, 3(4): 241-244. WANG Jinbing, ZHU Dehou, YE Xiuzhen, et al. Qidong hepatocellular carcinoma cell line (QGY-7703) is established and its characteristics[ J].
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