中华预防医学杂志 017 年 10 月第 1 卷第 10 期 Chin J Prev Med,October 017, Vol. 1, No. 10 881 01 01 年郑州 7 株甲型副伤寒沙门菌分子分型与耐药研究 细菌耐药 赵嘉咏张胜勇张白帆穆玉姣苏佳黄学勇许汴利 摘要 目的 胶电泳 (PFGE) 分子型别特征 方法 分析 01 01 年郑州甲型副伤寒沙门菌临床分离株的耐药状况与脉冲场凝 于 01 01 年, 从郑州发热伴出疹症候群监测系统 个哨点 医院内, 分离经病例血培养和粪便培养的 7 株甲型副伤寒沙门菌, 其中 01 年 11 株,014 年 7 株, 01 年 49 株 根据国际 PulseNet 网络实验室公布的沙门菌 PFGE 分型操作规程与美国临床实验室标 准化协会沙门菌 K-B 法药敏试验方案, 对 7 株甲型副伤寒沙门菌进行药敏试验与 PFGE 脉冲场凝胶 电泳分子分型分析 结果 7 株甲型副伤寒沙门菌对 1 种抗生素均有不同程度的耐药, 有 株为 多重耐药株 (97.0%), 其中耐 ~ 种的为 株 (7.%), 耐 ~8 种的为 41 株 (1.%), 耐 9~10 种的为 11 株 (1.4%), 耐 11~1 种的为 8 株 (11.9%) 经 XbaⅠ 酶切与脉冲场凝胶电泳后,7 株甲型副伤寒沙门菌 共获得 10 种带型 (PTYA1~10), 每种带型包含 1~48 株菌株, 相似度为 94.1%~100% 其中 PTYA 包 含 48 株菌, 为其优势带型 ;PTYA1 9 包含 株菌 ;PTYA 4 7 8 10 各包含 1 株菌 结论 郑州市 临床分离的甲型副伤寒沙门菌耐药状况普遍比较严重,PFGE 带型呈现多样性的同时又具有较显著的 优势带型特点, 部分带型与其对应的耐药谱具有一定的关联性与聚集性 关键词 沙门菌, 甲型副伤寒 ; 电泳, 凝胶, 脉冲场 ; 抗药性 基金项目 : 国家科技重大专项 (01ZX100040 01ZX100041); 河南省科技攻关课题 (110101); 河南省医学科技攻关计划项目 (0100) Characteristics of molecular typing and drug resistance of 7 Salmonella paratyphi A isolated in Zhengzhou from 01 to 01 Zhao Jiayong *, Zhang Shengyong, Zhang Baifan, Mu Yujiao, Su Jia, Huang Xueyong, Xu Bianli. * Institute for Infectious Disease Control and Prevention, Henan Provincial Center for Disease Control and Prevention, Zhengzhou 4001, China Corresponding author: Xu Bianli, Email:xubl@hncdc.com.cn Abstract Objective To investigate the antimicrobial resistance and pulsed field gel electrophoresis (PFGE) patterns of S.paratyphi A strains in Zhengzhou city isolated from sentinel hospitals in 01-01. Methods According to Salmonella molecular typing and K- B drug susceptibility testing method published by international PulseNet bacterial infectious disease monitoring network and USA Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI01), we analyzed drug sensitivity and PFGE molecular characteristics of 7 S.paratyphi A strains(11 strains in 01, 7 strains in 014, 49 strains in 01) isolated from blood and stool samples in two sentinel hospitals of fever with rash syndrome surveillance system established in Zhengzhou city in 01-01. Results The results showed 7 strains of S.paratyphi A had different levels of resistance to 1 kinds of antibiotics, strains were multi-drug resistant strains (97.0%), isolates were resistant to - kinds of antibiotics (7.% ), 41 isolates were resistant to - 8 kinds of antibiotics (1.%),11 isolates were resistant to 9-10 kinds of antibiotics(1.4%),8 isolates were resistant to 11-1 kinds of antibiotics(11.9% ). 7 strains of S.paratyphi A were divided into 10 molecular patterns (PTYA1- PTYA10) by digestion with Xba Ⅰ restriction endonuclease and pulsed field gel electrophoresis, each pattern contains 1-48 strains with similarity ranged from 94.1%-100%. PTYA contained 48 strains, which was predominant band type; PTYA1, 9 contained strains; PTYA, 4,,, 7, 8, 10 contained 1 strains among them. Conclusion The status of drug resistance of clinical isolates of S.paratyphi A in Zhengzhou city was rather serious, PFGE patterns showed diversity and dominant characteristics. The PFGE patterns of partial strains and its corresponding anti- drug spectrum have certain relevance and cluster DOI:10.70/cma.j.issn.0-94.017.10.00 作者单位 :4001 郑州, 河南省疾病预防控制中心传染病所 ( 赵嘉咏 张白帆 穆玉姣 苏佳 黄学勇 许汴利 ); 登封市疾病预防控制中心检验科 ( 赵胜勇 ) 通信作者 : 许汴利,Email:xubl@hncdc.com.cn
88 中华预防医学杂志 017 年 10 月第 1 卷第 10 期 Chin J Prev Med,October 017, Vol. 1, No. 10 relationship. Key words Salmonella paratyphi A; Electrophoresis, gel, pulsed-field; Drug resistance Fund program: National Science and Technology Major Project (01ZX100040, 01ZX100041); Henan Province Science and Technology Research Project (110101); Henan Province Medical Science and Technology Research Project (0100) 甲型副伤寒是由甲型副伤寒沙门菌引起的急性消化道传染病, 其典型症状持续高热 相对缓脉 肝脾肿大 玫瑰疹与白细胞减少等为特征, 肠出血 肠穿孔为主要并发症 该病近年来新发病例症状趋缓, 主要以发热 畏寒 头痛为主 该病终年均可发病, 但以夏秋季为多, 可通过饮用水 食物 接触等途径进行传播 我国一般呈散在发生, 可出现局部暴发或流行, 是我国法定报告的乙类传染病之 [1] 一 郑州是河南伤寒副伤寒主要监测哨点地区之一, 也是河南近十年来甲型副伤寒散发和暴发病例的最主要来源地 本研究对 01 01 年内分离自郑州的 7 株甲型副伤寒沙门菌进行 PFGE 分子特征分析与药敏测试, 为深入了解甲型副伤寒沙门菌的分子流行病学特征与耐药状况, 指导临床合理用药和肠道传染病的防控提供科学依据 材料与方法 1. 样本来源 : 于 01 01 年, 从郑州发热伴出疹症候群监测系统 个哨点医院内, 分离经病例血培养和粪便培养的 7 株甲型副伤寒沙门菌, 其中 01 年 11 株,014 年 7 株,01 年 49 株. 主要试剂与仪器 : 沙门菌科玛嘉鉴定培养基购自法国 CHROMAgar 公司 ; 沙门菌分型血清购自丹麦 SSI 公司 ;API0E 肠杆菌科细菌鉴定板条购自法国 biomérieux 公司 ;TaqDNA 聚合酶购自美国 Promega 公司 ;dntp MIX 购自上海生工 ; 引物由上海 invitrogen 公司合成,HPLC 纯化 ; 琼脂糖购自西班牙 Biowest 公司 ;0 TAE/Tris-Hcl/EDTA/ TBE 购自北京 Solarbio 公司 ;SeakemGold 琼脂糖购自美国 LONZA 公司 ; 蛋白酶 K 购自英国 Roche 公司 ; 限制性内切酶 XbaⅠ 购自大连宝生物公司 ; 去离子水系统购于美国 Milipore 公司 ;SHZ-C 型水浴摇床购于上海博迅仪器公司 ; 三温水浴锅购于北京东方精瑞仪器公司 ;Minispin 台式离心机 PCR 仪购于德国 Eppendorf 公司 ; 脉冲场凝胶电泳及凝胶成像系统系统购于美国 Bio-Rad 公司. 菌株的生化鉴定与血清分型 : 从沙门菌科玛嘉平板上直接挑取淡紫色菌落转种脑心浸液平板, 7 培养 1~18 h,0.8% 生理盐水制备 0. 麦氏浊度菌液,API0E 肠杆菌科系统生化鉴定, 沙门菌诊断血清进行 O 相玻片凝集分型, 再利用 0.4% 营养 [] 软琼脂 ( 参见 WHO 沙门菌鉴定手册 ) 进行 H 相 (1/ 相 ) 鞭毛诱导与血清凝集, 生理盐水做自凝对 [] 照 根据 K-W 血清分型表确定对应血清型别 [] 4. 药敏试验 : 参照 WHO 推荐的 Kirby-Bauer 法, 将甲型副伤寒沙门菌转种脑心浸液琼脂平板,7 培养 1 h 后 0.8% 生理盐水制成 0. 麦氏单位悬液 用无菌棉拭子蘸取菌液均匀涂布于 M-H 平板表面, 用分配器将药敏纸片压盖其上,1 min 内送 7 温箱培养 18 h 以后测量各药敏纸片抑菌圈直径, 参照美国临床实验室标准化协会 (Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)01 年标准进行耐药表型 [4] 判定, 大肠杆菌 ATCC9 作为质控菌株.PFGE 分型 : 按照国际 PulseNet 网络实验室公布的沙门菌脉冲场凝胶电泳标准分型方法, 对 7 株甲型副伤寒沙门菌株进行分子分型, 沙门菌标准株 H981 作为分子量标记 限制性内切酶 XbaⅠ(0 U),7 酶切 h 电泳参数 : 电压 V/cm, 脉冲时间.~.8 s, 线性转换, 电场角度 10, 电泳时间 19 h, 电泳液温度 14 电泳结束后胶块用 GelRed 染料染色 0 min 后纯水清洗 0 min 后凝胶成像仪拍照 ( 曝光时间.0 s, 去过饱和成像 ) []. 数据分析 : 采用 BioNumerics.0 软件对电泳图谱进行数据分析, 绘制聚类分析树状图 聚类算法为非加权配对平均法, 电泳条带位置优化度为 [] 1.%, 相似度 100% 认定为同一 PFGE 带型 结 1. 甲型副伤寒沙门菌对抗生素耐药情况 :7 株甲型副伤寒沙门菌对氨苄西林 头孢他啶 头孢噻肟 头孢吡肟 萘啶酸 环丙沙星 诺氟沙星 链霉素 庆大霉素 氯霉素 甲氧苄氨嘧啶 甲氧嘧啶 + 磺胺甲唑 四环素等 1 种抗生素均有不同程度的耐药和多重耐药, 相关耐药及多重耐药率详见表 1 不同年份甲型副伤寒沙门菌对各药物耐药率详见图 1 果
中华预防医学杂志 017 年 10 月第 1 卷第 10 期 Chin J Prev Med,October 017, Vol. 1, No. 10 88 表 1 分离自郑州哨点医院的 7 株甲型副伤寒沙门菌 对 1 种抗生素的耐药情况 ( 株 ) 抗生素 耐药 中介 敏感 耐药率 (%) 头孢吡肟头孢他啶头孢噻肟氯霉素诺氟沙星环丙沙星链霉素甲氧嘧啶庆大霉素四环素氨苄西林甲氧嘧啶 + 磺胺甲 唑 14 1 1 1 4 4 7 0 1 1 8 1 4 8 4 1 0 0 1 47 4 8 7 0 1 8 0.9.4.4.9.8.8.8 40. 44.8 4. 7.1 8. 萘啶酸 0 9..PFGE 分子分型结果 :7 株甲型副伤寒沙门菌经 XbaⅠ 酶切后共分为 10 种带型, 分别命名为 PTYA1~PTYA10, 各带型包含菌株数为 1~48 株, 带型相似度在 94.1%~100% PTYA 包含 48 株菌, 为其主要优势带型 ;PTYA1 和 PTYA9 带型均包含 7 株菌, 带型相似度与 PTYA 较高 ( 均在 9% 以上 ) 详见图 7 株甲型副伤寒沙门菌 PFGE 带型与耐药谱之间呈现一定的对应关系,PTYA1 PTYA PTYA9 内均存在耐药表型一致的菌株聚集现象, 其中 PTYA1 中 4 株菌耐药表型为 ( 氨苄西林 + 庆大霉素 + 甲氧嘧啶 + 四环素 + 链霉素 + 萘啶酸 + 磺胺甲唑 );PTYA 中 7 株菌耐药表型为 ( 氨苄西林 + 甲氧嘧啶 + 环丙沙星 + 四环素 + 链霉素 + 萘啶酸 + 氯霉素 + 诺氟沙星 + 磺胺甲唑 ), 株菌耐药表型为 ( 氨苄西林 + 庆大霉素 + 甲氧嘧啶 + 环丙沙星 + 四环素 + 萘啶酸 + 氯霉素 + 诺氟沙星 + 磺胺甲唑 + 链霉素 );PTYA9 中 4 株菌耐药表型为 ( 氨苄西林 + 庆大霉素 + 甲氧嘧啶 + 四环素 + 萘啶酸 + 氯霉素 + 磺胺甲唑 ) 讨 论 图 1 不同年份分离自郑州哨点医院的 7 株甲型副伤寒沙门菌对 1 种抗生素的耐药率情况 副伤寒与伤寒一样, 在河南历史上曾经是一种严重威胁人民群众健康的传染性疾患 建国初期由于 表 分离自郑州哨点医院的 7 株甲型副伤寒沙门菌耐药谱 耐药谱 AMP-NAL AMP-NAL-CHL AMP-TMP-NAL-CHL-SXT AMP-CTX-TMP-NAL-CHL-SXT AMP-GEN-TMP-TET-NAL-STR-SXT AMP-TMP-TET- NAL-CHL-STR-SXT AMP-GEN-TMP-TET-NAL-CHL-SXT AMP-CIP-TET-NAL-CHL-NOR-SXT AMP-CTX-CIP-TET-NAL-CHL-NOR AMP-GEN-TMP-TET- NAL-CHL-SXT-STR AMP-TMP-TET- NAL-CHL-NOR-SXT-STR AMP-TMP-CIP-TET- NAL-CHL-NOR-SXT-STR AMP-GEN-TMP-CIP-TET- NAL-CHL-NOR-SXT-STR AMP-GEN-TMP-CIP-TET- NAL-CHL-NOR-SXT-CAZ-STR AMP-GEN-TMP-CIP-TET-NAL-CHL-NOR-SXT-CAZ-CTX-STR 菌株数 9 耐药率 (%).0 4. 4. 1.4 9. 4..1 4. 7. 9.0 9.0.0 注 :AMP: 氨苄西林 ;CAZ: 头孢他啶 ;CTX: 头孢噻肟 ;FEP: 头孢吡肟 ;CHL: 氯霉素 ;NOR: 诺氟沙星 ;CIP: 环丙沙星 ;STR: 链霉素 ;TMP: 甲氧嘧啶 ;GEN: 庆大霉素 ;TET: 四环素 ;SXT: 甲氧嘧啶 + 磺胺甲唑 ;NAL: 萘啶酸
884 中华预防医学杂志 017 年 10 月第 1 卷第 10 期 Chin J Prev Med,October 017, Vol. 1, No. 10 图 分离自郑州哨点医院的 7 株甲型副伤寒沙门菌 PFGE 聚类分析图谱 例 副伤寒疫情波及河南 18 个县区, 无论城市农村均有该病的发生 [1] 和流行 0 世纪 80 年代后通过采取改水改厕, 认真落实对传染源 传播途径和保护易感人群为主的综合性预防措施, 河南副伤寒的暴发疫情迅速下降 0 世纪 90 年代至今, 副伤寒的发病率基本控制在 0./ 10 万 ~1.7/10 万之间 ; 目前河南副伤寒病例主要分布于郑州城区周边, 流行趋势以高度散发为主, 暴发疫情偶然发生在卫生条件差的特殊人群中 由于慢性带菌者的持续存在, 传播途径不易彻底切断和人工免疫效果欠佳, 输入性与聚集性病例仍时有出现 临床过度治疗与抗生素滥用是造成病原菌耐药问题日益突出的主 [7-10] 要原因 从本研究看, 郑州自病例分离出的甲型副伤寒沙门菌耐药问题十分严重, 其对试验所用抗生素均存在不同程度的耐药, 比较严重的有青霉素类 磺胺类 四环素类 氯霉素类 氨基糖苷类以及一代喹诺酮类, 对临床常用三代喹诺酮类药物也存在较高的耐药率 ; 其多重耐药情况也非常严重, 临床分离菌株普遍对 ~1 种抗生素耐药, 且对头孢类 喹诺酮类一线常用药及其他 类抗生素的耐药率呈逐年上升趋势, 从临床和公共卫生角度看值得我们高度关注 另外, 氨苄西林和四环素的耐药率呈下降趋势, 推测其为临床用药量逐年减少和地 [11-1] 位降低有关 众所周知, 目前细菌耐药在世界范围内都已成为临床和公共卫生领域高度关注的问 [14] 题 建立科学有效的病原菌耐药监测体系, 及时分析分享数据, 指导农业 畜牧业和医疗部门合理规范用药, 减缓细菌耐药突变和扩散速 百废待兴, 卫生条件极差, 伤寒副伤寒的发病呈直线上升趋势, 二十世纪六七十年代发病率曾一度长期维持在 10.00/10 万例以上, 最高达到./10 万 度, 降低临床治疗成本, 是一件必要和迫切的事 [1-17] 情 本研究药敏试验方案采用了 K-B 法, 虽然其具有操作简单 成本低廉等优点, 但仅能够进行
中华预防医学杂志 017 年 10 月第 1 卷第 10 期 Chin J Prev Med,October 017, Vol. 1, No. 10 88 药敏表型的初筛, 与现在普遍使用的 MIC 法相比不 能够进行定性分析, 所得数据无论是对于指导进一步的基因型研究还是临床精准用药都存在较大的局限性, 这也是我们在今后的研究中需重点改进之处 本研究利用脉冲场电泳技术分析了郑州甲型副伤寒沙门菌全染色体 指纹图谱 特征, 为基于该技术的病原体分子流行病学特征和暴发溯源积累了基线数据 值得关注的是甲型副伤寒沙门菌 XbaⅠ 带型的高聚集性与相似度 ; 部分菌株的耐药表型与 PFGE 带型呈现聚类一致性, 提示我们基于共同暴露源的菌株可能也具有相同的基因和耐药表型特征, 这种特征尽管存在变异性和不确定性, 但在一定范围内可以成为及早发现聚集性病例的 [1] 重要指征参数 同时我们也要认识到只有结合病原学和流行病学信息, 才能更好地把握疾病传播特点和发挥 PFGE 技术在疾病防控 突发公卫事件 / 疫情处置中的作用 参考文献 [1] 卫生部疾病预防控制局, 中国疾病预防控制中心. 伤寒副伤寒防治手册 [M]. 版. 北京 : 人民卫生出版社,00. [] Wray C, Davies R H World Health Organization. Guidelines on detection and monitoring of salmonella infected poultry flocks with particular reference to salmonella enteritidis[eb/ol].[017-0-]. http://apps.who.int/iris/handle/10/9. [] 朱丹丹, 遇晓杰, 郑晓华, 等. 黑龙江省肉鸡养殖和生产加工环节中沙门菌耐药性分析 [J]. 中华预防医学杂志,01,0(9): 8-8.DOI: 10.70/cma.j.issn.0-94.01.09.018. [4] Khan AA, Melvin CD, Dagdag EB. Identification and molecular characterization of Salmonella spp. from unpasteurized orange juices and identification of new serotype Salmonella strain S. enterica serovar Tempe[J]. Food Microbiol, 007,4():9-4. DOI: 10.101/j.fm.00.09.00. [] Rivoal K, Protais J, Quéguiner S, et al. Use of pulsed-field gel electrophoresis to characterize the heterogeneity and clonality of Salmonella serotype Enteritidis, Typhimurium and Infantis isolates obtained from whole liquid eggs[j]. Int J Food Microbiol, 009,19 ():180-18. DOI: 10.101/j.ijfoodmicro.008.11.01. [] Petrov P, Hendriksen RS, Kantardjiev T, et al. Occurrence and characterization of Salmonella enterica subspecies enterica serovar 9,1:l,v:-strains from Bulgaria, Denmark, and the United States[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 009,8 ():47-479. DOI: 10.1007/s1009-008-0-9. [7] Harbottle H, White DG, McDermott PF, et al. Comparison of multilocus sequence typing, pulsed-field gel electrophoresis, and antimicrobial susceptibility typing for characterization of Salmonella enterica serotype Newport isolates[j]. J Clin Microbiol, 00,44(7):449-47. DOI: 10.118/JCM.00019-0. [8] Chiou CS, Lin JM, Chiu CH, et al. Clonal dissemination of the multi-drug resistant Salmonella enterica serovar Braenderup, but not the serovar Bareilly, of prevalent serogroup C1 Salmonella from Taiwan[J]. BMC Microbiol, 009,9:4. DOI: 10.118/1471-180-9-4. [9] Huang X, Huang Q, Dun Z, et al. Nontyphoidal Salmonella Infection, Guangdong Province, China, 01[J]. Emerg Infect Dis, 01,(4):7-79. DOI: 10.01/eid04.117. [10] Liu X, Liu Q, Xiao K, et al. Attenuated Salmonella Typhimurium delivery of a novel DNA vaccine induces immune responses and provides protection against duck enteritis virus[j]. Vet Microbiol, 01,18:189-198. DOI: 10.101/j.vetmic.01.0.001. [11] Ali A, Ali HA, Shah FH,et al. Pattern of antimicrobial drug resistance of Salmonella Typhi and Paratyphi A in a Teaching Hospital in Islamabad[J]. J Pak Med Assoc,017,7(): 7-79. DOI: 10.109/cid/cix18. [1] Dobinson HC, Gibani MM, Jones C, et al. Evaluation of the Clinical and Microbiological Response to Salmonella Paratyphi A Infection in the First Paratyphoid Human Challenge Model[J]. Clin Infect Dis, 017,4(8):10-107. DOI: 10.109/cid/cix04. [1] Verma S, Sharma V, Mokta K, et al. Outbreak of enteric fever due to Salmonella Paratyphi A variety durazzo (,1:a:-) in a hilly region of North India: A report of 4 cases[j]. Indian J Med Microbiol, 01,4():87-89. DOI: 10.410/0-087.188. [14] Yamaguchi T, Iida K, Shiota S, et al. Filament formation of Salmonella Paratyphi A accompanied by FtsZ assembly impairment and low level ppgpp[j]. Can J Microbiol, 01,1 (1):9-94. DOI: 10.119/cjm-01-041. [1] Elhadad D, Desai P, Rahav G, et al. Flagellin Is Required for Host Cell Invasion and Normal Salmonella Pathogenicity Island 1 Expression by Salmonella enterica Serovar Paratyphi A[J]. Infect Immun, 01,8(9):-8. DOI: 10.118/ IAI.0048-1. [1] Misra R, Prasad KN, Amrin N, et al. Absence of multidrug resistance in Salmonella enterica serotypes Typhi and Paratyphi A isolates with intermediate susceptibility to ciprofloxacin[j]. Trans R Soc Trop Med Hyg, 01,109(8): 8-40. DOI: 10.109/trstmh/trv0. [17] 赵嘉咏, 张玉凯, 谢志强, 等.011 01 年河南省肠炎沙门菌耐药与分子分型研究 [J]. 中华预防医学杂志,01,0(): 1-. DOI:10.70/cma.j.issn.0-94.01.0.014. ( 收稿日期 :017-0-) ( 本文编辑 : 梁明修 )