870 中南大学学报 ( 医学版 ), 2013, 38(9) expression pattern of 2 HTA gene transcripts in different hepatic cell lin

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他圆寿
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中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 2013, 38(9) http://www.csumed.org; http://xbyx.xysm.net 869 ARTICLES 论著 DOI:10.3969/j.issn.1672-7347.2013.09.001 http://xbyx.xysm.net/xbwk/fileup/pdf/201309869.

1 中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 2013, 38(9) ARTICLES 论著 DOI: /j.issn 肝癌相关基因的分子克隆和可变剪切分析刘艳红, 赵艳洁, 房淑娟, 李跃辉, 李官成 ( 中南大学肿瘤研究所, 卫生部癌变原理重点实验室, 教育部癌变与侵袭原理重点实验室, 长沙 ) [ 摘要 ] 目的 : 获取肝癌相关基因 (hepatoma associated gene,hta) 的 mrna 分子全长序列并对其可变剪接进行分析, 检测其转录本在各肝癌细胞系中的表达, 为进一步研究该基因在肝癌发生发展中的作用奠定基础方法 : 用 3'RACE 和 5'RACE 方法扩增 HTA 基因的全长序列并对其序列信息和可变剪接进行扩增和测序分析, 用 Northern 印迹检测该基因转录本在不同肝癌和正常肝细胞系中的表达结果 :HTA 基因全长序列为 1414 bp, 经分析该序列包含 3 个外显子, 2 个内含子, 其中 2 号内含子在可变剪接中被作为外显子表达 Northern 印迹显示 HTA 基因 1.7 kb 转录本和 1.4 kb 转录本均表达于恶性肝癌细胞系, 而不表达于正常细胞系结论 : 成功获得了 HTA 基因的全长序列并对其可变剪接进行了分析,2 个大小不同的转录本均在肝癌细胞系中特异性表达, 作为一个肝癌相关基因值得进一步深入研究 [ 关键词 ] 肝癌相关基因 ; 全长克隆 ; 可变剪接 Molecular cloning and alternative splicing analysis of hepatoma associated gene HTA LIU Yanhong, ZHAO Yanjie, FANG Shujuan, LI Yuehui, LI Guancheng (Institute of Cancer Research, Central South University; Key Laboratory of Carcinogenesis of Chinese Ministry of Public Health; Key Laboratory of Carcinogenesis and Invasion Theory of Chinese Ministry of Education, Changsha , China) ABSTRACT Objective: To obtain the full length cdna sequences of hepatoma associated gene HTA, analyze its alternative splicing, detect the expression pattern of 2 HTA gene transcripts in different hepatic cell lines, and to establish a base for further study of HTA gene function in hepatocellular carcinoma (HCC) occurence and development. Methods: The full length cdna of HTA gene was cloned by rapid amplification of cdna 3' ends (3'-RACE), rapid amplification of cdna 5' ends (5'-RACE) and DNA sequencing. The gene structure and alternative splicing were analysed. Northern blot assay was performed to detect the 收稿日期 (Date of reception): 作者简介 (Biography): 刘艳红, 博士, 助理研究员, 主要从事基因工程抗体和肿瘤免疫治疗方面的研究通信作者 (Corresponding author): 李官成, libsun@163.com 基金项目 (Foundation items): 国家重点基础研究发展计划 ( 973 计划 )(2010CB833605); 国家自然科学基金 ( ); 湖南省自然科学基金 (2010SK3132) This work was supported by the Major State Basic Research Development Program ("973") (2010CB833605); the National Natural Science Foundation of China( ) and the Natural Science Foundation of Hunan Province, P. R. China (2010SK3132).

2 870 中南大学学报 ( 医学版 ), 2013, 38(9) expression pattern of 2 HTA gene transcripts in different hepatic cell lines. Results: The full length of HTA gene was 1414 bp, composed of 3 exons and 2 introns, and the second intron could be retained in mrna. Northern blot assay showed that 2 transcripts of HTA mrna(1.4 kb and 1.7 kb) could express in the HCC cell lines HepG2 and QGY-7703, but not in the non-malignant cell line L-02 and HUVEC. The expression level of 1.4 kb transcript was much higher than 1.7 kb one. Conclusion: This study successfully has obtained the full length cdna of HTA gene, and analysed the gene sequence and alternative splicing, 2 transcripts of HTA mrna specifically expressed in HCC cell lines. As a hepatoma associated gene, HTA deserves further investigation. KEY WORDS HTA; full length cloning; alternative splicing 肝癌 (hepatocellular carcinoma,hcc) 是恶性程度极高预后极差的恶性肿瘤, 占原发性肝癌 (primary hepatocellular carcinoma,phc) 的 91.5%, 其在世界范围内每年的发病率排第 5 位, 病死率居第 3 位 [1] 中国每年死于肝癌的人数为 11 万, 占世界肝癌死亡人数的 45% [2] HCC 的发病机制涉及多因素影响多基因调控多信号通路参与, 其根源是基因表达异常 [3] 基因表达异常导致细胞黏附力异常, 特定信号转导通路异常, 细胞凋亡程序异常等, 最终造成细胞失控性增殖异常分化癌变发生因此, 对与 HCC 发生发展相关基因的进一步了解, 将有助于从根源上阐明 HCC 发生发展的规律, 筛选出更多的可用于早期筛查和诊断的高特异性高灵敏度指标, 为今后该疾病的治疗和预防提供新的靶点 [4] 在前期工作中, 为寻找新的肿瘤标志物, 我们利用肿瘤基因组解剖计划 (CGAP) 网站的 cdna xprofile 工具 ( xprofiler), 以人类正常组织和肿瘤组织 EST 数据库为基础, 结合电子杂交分析, 得到了一些在肿瘤组织中特异性表达的 EST 序列, 其中 NM 是一个全新的未知序列, 在数据库中尚未找到与其有同源序列的基因我们用 RT-PCR 验证结果证实该基因不表达于正常组织, 只在少数肿瘤组织中表达, 在 HCC 组织中阳性率相对较高, 故将其命为 HCC 相关基因 (hepatoma associated gene, HTA) 对该基因进行初步的功能研究发现稳定转染 si-hta 后,HCC 细胞系 HepG2 生长速度明显降低, 平均倍增时间明显延长, 集落形成率明显降低 ;G 1 期细胞增多,S 期细胞减少, 体内成瘤能力下降 [5] 同时还发现, 沉默 HTA 基因后,HepG2 细胞中 caspase3, caspase4, bcl-xl, cyclind1,nf-kappab 等一些凋亡相关分子的表达水平发生不同程度的改变以上结果提示 HTA 基因可能在 HCC 发生发展中起重要作用, 且其作用机制可能与 HCC 细胞的增殖和凋亡相关作为一个肝癌相关基因,HTA 基因在肿瘤和 HCC 中的特异性表达及其增殖凋亡相关作用机制值得进一步研究但由于 HTA 是从 EST 数据库中筛选得到的一个全新的基因, 我们有必要在对其进行进一步研究之前, 获取其全长并进行分析, 阐明该基因的基本序列结构信息, 为进一步深入探讨 HTA 的功能和作用机制打下基础本实验通过 cdna 末 [6-7] 端快速扩增的方法获取 HTA 基因的全长并分析其基因结构, 同时用 Northern 印迹验证 HTA 基因转录本大小及其在 HCC 细胞系中的表达 1 材料与方法 1.1 主要材料人 HCC 细胞系 HepG2, 正常肝细胞系 L-02 和脐静脉内皮细胞 HUVEC 为本室保存人 HCC 细胞系 QGY-7703 购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心该细胞系于 1977 年建系, 取材自中国 HCC 高发地区启东的 1 名 35 岁女性 HCC 患者染色体数目变化大, 异倍体多甲胎蛋白 (α-fetoprotein, AFP) 阳性, 异体移植能力强 [8] 细胞培养基双抗溶液及新生牛血清购自美国 Hyclone 公司 3'/5'RACE 试剂盒为美国 Clontech 公司产品,DIG Northern Starter Kit 为美国 Roche 公司产品真核表达载体 pcdna3.1(+) 为本实验室保存,pGEM-T easy 载体购自美国 Promega 公司 RNA 抽提试剂 TRIzol 购自美国 Life Technologies 公司带正电的尼龙膜 Biodyne Plus 购自美国 Pall 公司 RT-PCR 试剂盒 Taq 酶 T4 连接酶及各种限制性内切酶均购自美国 Fermentas 公司质粒抽提试剂盒 DNA 胶回收试剂盒购自上海索莱宝生物科技有限公司寡核苷酸引物由上海 Invitrogen 生物公司合成

3 肝癌相关基因的分子克隆和可变剪切分析刘艳红, 等方法细胞系总 RNA 和 mrna 的提取细胞系 HepG2, QGY-7703, L-02, HUVEC 培养在高糖 DMEM 培养基中常规培养 (37, 5%CO 2 ),0.25% 胰蛋白酶消化收集细胞加 TRIzol 试剂, 按照 TRIzol 试剂盒说明书抽提细胞系总 RNA 以此总 RNA 为 3'/5'RACE 的起始样品在此基础上使用 Promega 公司的链霉抗生物素蛋白 - 磁珠系统从细胞总 RNA 中提取 mrna 作为 Northern 印迹实验样品得到的细胞总 RNA 和 mrna 样品通过分光光度计测其 D(260 nm)/d(280 nm) RNA 温度孵育实验及甲醛变性电泳检测其纯度和完整性 'RACE 和 5'RACE 扩增 HTA 基因全长根据 HTA 基因已知序列, 按照 RACE 实验要求设计 3 'RACE 和 5 'RACE 需要的 HTA 基因特异性引物 GSP1 和 GSP2 及巢式 PCR 引物 NGSP1 如图 1 表 1 所示分别以 1 µ g HepG2 细胞总 RNA 样品为材料, 按照 Clontech Smarter TM RACE cdna Amplification Kit 的操作流程生成 3 'RACE ready cdna 和 5'RACE ready cdna, 分别用 Upper primer mix+gsp1 引物对,Upper primer mix+gsp2 引物对扩增 HTA 基因的 3'/5' 序列 RACE PCR 采用 Touch down PCR 程序具体如下 :94,30 s,72,3 min,5 个循环 ;94,30 s,70,30 s;72 ; 3min; 5 个循环 ;94, 30 s, 68, 30 s, 72,3 min,30 个循环 PCR 产物 5 µl 经 1% 琼脂糖凝胶电泳分析后通过 Image master VDS 凝胶成像系统记录结果 RACE PCR 产物稀释 25 倍作为巢式 PCR 的模板分别用 3'/5' 巢式 PCR 引物对进行巢式 PCR 扩增程序如下 :94,30 s,68,30 s, 72,3 min,30 个循环 PCR 产物经 1% 低熔点琼脂糖凝胶电泳分离后切下目的条带用 DNA 胶回收试剂盒回收并连接 pgem-t easy 载体, 连接产物转化大肠杆菌 DH5ɑ 挑取阳性克隆测序 Region of overlap Region to be amplified by 5'-RACE Region to be amplified by 3'-RACE 5' 3' GSP2 NGSP2 3' 5' Generalized first-strand cdna NGSP1 GSP1 图 1 3'/5'RACE 各引物对位置和扩增方向示意图 Figure 1 Location and direction of primers for 3'/5' RACE. 表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences 引物名称 Universal Primer (long) Universal Primer (short) Nested Universal Primer GSP1 GSP2 NGSP1 HTA-cDNA-F HTA-cDNA-R HTA-probe-F HTA-probe-R-T7 GAPDH-probe-F GAPDH-probe-R-T7 序列 (5' to 3') CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT CTAATACGACTCACTATAGGGC AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT TCTGCTGGAGGTGAGGGCTCGTGGT ATGGGTTGCTTGGGGCATCCTGTG GTCGGGGTTGTTCTTGTTTTCAG CGAAGATTTCTTATAGACAGGC GGAGGGCATTATGGTGAG CTATTTATGGGTTGCTTGG CTAATACGACTCACTATAGGGAGAGAGGGCATTATGGTGAGAT AATCCCATCACCATCTTCC CTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCTGTAGCCAAATTCGTTGT

872 中南大学学报 ( 医学版 ), 2013, 38(9) http://www.csumed.org; http://xbyx.xysm.net 1.2.3 HTA 基因结构和可变剪接的分析将 RACE 产物各阳性克隆测序结果统一分析, blast 拼接后用 ORF-finder 软件预测 HTA 基因结构通过分析结果设计 HTA 全长引物 HTA-cDNA-F 和 HTA

4 872 中南大学学报 ( 医学版 ), 2013, 38(9) HTA 基因结构和可变剪接的分析将 RACE 产物各阳性克隆测序结果统一分析, blast 拼接后用 ORF-finder 软件预测 HTA 基因结构通过分析结果设计 HTA 全长引物 HTA-cDNA-F 和 HTA cdna-r( 表 1) 进行 PCR 扩增, 得到 HTA 基因全长转录本的 cdna 分子 ( 图 2) 将扩增产物分连接 pgem-t easy 载体测序, 比对分析 HTA 基因转录本的可变剪接情况 Northern 印迹检测 HTA mrna 的表达设计 HTA 特异性分子探针, 在长度为 589 bp 的探针 5 ' 端加上 24 bp 的 T7 启动子序列 5 '-CTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3', 然后用体外转录的方法制备地高辛标记的 Northern 印迹探针相同方法制备内参基因 GAPDH 的分子探针, 并根据试剂盒说明流程检测各探针的标记效率将中所得的 4 种细胞系的 mrna 各 100 ng 作为样品进行 2% RNA 甲醛变性电泳待电泳完成之后将分离的 mrna 样品用毛细管转移法过夜转印至合适大小的带正电的尼龙膜上转膜完成后用紫外交联 (245 nm,1.5 J/cm 2 照射膜,105 s) 并标好膜的正面及加样顺序在 Roche 公司的 DIG Easy Hyb 杂交液中将尼龙膜与标记好的探针在 68, 以 40 r/min 的转速在杂交炉中进行预杂交 1 h 和杂交过夜杂交完成后洗膜, 将膜置于标记了碱性磷酸酶 AP 的地高辛抗体中孵育, 用 Luminescence 化学发光法检测膜上的杂交信号 DL2000 HTA β-actin 2 结果 2.1 HTA 基因的全长序列方法部分中提取的总 RNA 和 mrna 经检测其 D(260 nm)/d(280 nm) 均达到 1.9 以上经 37 孵育和未孵育的样品甲醛变性电泳条带完整一致, 说明 RNA 质量完好 3'/5'RACE PCR 产物连接 pgem-t 载体后用 T7 通用引物测序结果显示扩增片段均与 HTA 已知序列有重叠区域, 经 blast 和序列拼接分析, 得到了长为 1414 bp 的 HTA 的全长序列 ( 图 3) 其 3' 端序列与原本已知的序列相同,HTA 基因的开放阅读框 (open reading frame,orf) 编码 1 个由 92 个氨基酸组成预测大小为 10.2 kd 的蛋白在 Genbank 数据库中, 除了在灵长类动物基因组中发现有其同源序列之外, 没有找到与 HTA 基因有很高相似度的基因序列同时, 其预测蛋白序列的相似性比对也没有发现与 HTA 蛋白相似序列的已知蛋白用 NCBI 提供的预测蛋白保守结构域的在线工具 ( cgi) 也显示 HTA 蛋白没有保守的结构域 2.2 HTA 基因结构及可变剪接分析将 HTA 的全长序列和 HTA 基因对应的基因组序列输入 NCBI 的在线预测软件 ORF finder 中, 分析结果显示在 HTA 基因全长序列中包含 3 个外显子 2 个内含子序列, 而经 HTA 基因全长验证的 RT-PCR 结果显示 HTA mrna 有 2 个剪接体, 大小分别为 1.4 kb 和 1.7 kb( 图 3) 经 PCR 产物回收测序结果显示,1.4 kb 转录本即为 1.7 kb 第 2 号内含子存在可变剪切长度为 252 bp 的第 2 号内含子在剪切过程中可被剪切掉, 或者留下成为成熟 mrna 的一部分 ( 图 4) 图 2 HTA 基因的全长扩增 Figure 2 Full length amplification of HTA gene. 2.3 Northern 印迹检测 HTA mrna 在不同 HCC 细胞系中的表达目的基因 HTA 和内参基因 GAPDH 的地高辛探针在稀释至 0.3 pg/µl 时仍能被检测到, 说明标记效率均达到杂交实验的要求 ( 图 5A) Northern 印迹结果显示 :HTA 的 1.4 kb 和 1.7 kb 转录本在 HCC 细胞系 HepG2 和 QGY-7703 中均有表达, 且 1.4 kb 转录本表达量远高于 1.7 kb 转录本, 而这两种转录本在正常肝细胞系 L-02 以及 HUVEC 细胞中未见表达 ( 图 5B)

肝癌相关基因的分子克隆和可变剪切分析刘艳红, 等 873 图 3 HTA 基因的全长序列及预测氨基酸序列 Figure 3 Full length sequence and the corresponding amino acid sequence of HTA gene. 10 pg/µl 3 pg/µl 1 pg/µl 0.

5 肝癌相关基因的分子克隆和可变剪切分析刘艳红, 等 873 图 3 HTA 基因的全长序列及预测氨基酸序列 Figure 3 Full length sequence and the corresponding amino acid sequence of HTA gene. 10 pg/µl 3 pg/µl 1 pg/µl 0.3 pg/µl A HTA GAPDH A HUVEC L-02 HepG2 QGY-7703 B HTA 1.7 kb HTA 1.4 kb Exon 1 Exon 2 Exon 3 C GAPDH 1.3 kb B 图 4 HTA 基因的可变剪接 A:1.4 kb 转录本测序片段 ;B: 1.7 kb 转录本测序片段 ;C:HTA 基因可变剪切示意图 Figure 4 Alternative splicing of HTA gene. A: Sequence of 1.4 kb transcript; B: Sequence of 1.7 kb transcript; C: Sketch map of alternative splicing form. 图 5 Northern 印迹检测 HTA 基因在不同肝细胞系中的表达 A:HTA 和 GAPDH 地高辛探针的标记效率 ;B:HTA 和 GAPDH 在不同肝癌细胞系中的表达 Figure 5 Expression of HTA in different hepatic cell lines detected by Northern blot. A: Labeling efficiency of HTA and GAPDH digoxin probes; B: Expression of HTA and GAPDH.

6 874 中南大学学报 ( 医学版 ), 2013, 38(9) 讨论 HTA 基因是本实验室用生物信息学筛选得到的一个新的 HCC 相关基因前期用生物信息学结合 RT-RCR 验证了该基因的表达特异性, 用干扰试验揭示了其可能的功能, 但是对于进一步更深入的研究来说, 首先需要获取该基因的全长, 以此为基础才能进行后续的蛋白表达抗体制备表达谱研究以过表达为手段进行的基因功能研究等获取全长的方法很多, 其中被广泛认可和应 [6] 用的 Smart 技术是基于以下两个观察发展起来的 :1) 不同反转录酶包括 MMLV 合成的 cdna 3' 端保真度不高 ;2) 不同的反转录酶具有不同的加尾特性,MMLV 特意的在 cdna 末端加上 3~4 个 dctp 该技术用 MMLV 合成 cdna 第一链, 同时利用它的加尾特性在合成的 cdna 链 3 ' 加上 3~4 个 dctp, 而且当帽子结构存在时该酶的加尾活性最高 ( 对全长分子的富集机制 ), 随后这 3~4 个碱基与体系中事先加入的引物 ( 该引物的 3 ' 端有 3~4 个 dgtp) 配对,MMLV 继而以聚合酶活性将配对引物补成双链本研究中 HTA 基因即使在表达量上调的 HCC 细胞系 HepG2 中,HTA 基因的 mrna 分子的丰度对于高表达的看家基因来说也是相对较低的, 这就为其全长的获取带来了一些困难, 本实验就是选择采用了该 SMART 体系来获取 HTA 基因 [9] 的分子全长同时用热启动 PCR 酶来抑制反应升温阶段的非特异性结合, 用 Touch down PCR 程 [10] 序来抑制反应初始阶段的非特异性扩增, 同时保证反应后期的扩增效率通过 3 '/5'RACE 扩增出相应的 cdna 序列之后, 需要进一步确认该序列的正确性及完整性我们通过全长引物的 RT-PCR 来验证 RACE 的结果因为 HTA 是灵长类动物中特异性表达的,HTA 基因仅与人类及类人猿基因组序列匹配, 在其他物种均未发现有相似序列, 故不能通过同源序列比 [11] 对的方法来确定该基因的全长在这种情况下, 该序列是否为基因全长则遵循以下规律 : 得到的全长序列阅读框架完整, 在 ORF 的起始密码子 ATG 上游有同框架的终止密码子, 有 poly A 尾且通过 Northern 印迹实验证实该基因转录本的大小和获取的全长序列一致可变剪接是真核生物遗传变异中的常见现象, 是产生蛋白功能多样性和控制基因表达的重要机制, 已成为功能基因组时代研究的重点越来越多的研究发现, 转录本的可变剪接现象与肿瘤的发生发展密切相关 [12-13], 也可作为抗肿瘤药物筛选的一个重要切入点 [14] 普遍认为生物复杂性被认为应当以转录组的规模来衡量, 而正是可变剪接使得许多基因具有多个转录状态, 规模相差不大的基因组可产生差别巨大的功能状态组 [15] 在人类的遗传物质中,95% 的多外显子基因存在可变剪接的现象 [16], 外显子选择性缺失是目前观察到的最主要的可变剪接形式 [15] 已有实验研究表明, 可变剪接在产生受体多样性控制调节生长发育等方面起决定性作用 [17-18] [19-20], 尤其表现在神经系统和免疫系统 [21-22], 这与此类系统的功能多样性和反应敏感性是密切相关的许多遗传疾病都与剪接发生异常紧密相关 [23-24], 据估计, 导致疾病的变异中约 15% 会影响 Pre-mRNA 的剪接 HTA 基因中第 2 号内含子在其 mrna 中选择性的保留, 产生了数量相对较少, 相对分子质量较大的一部分 mrna 转录本, 这在其癌变过程中是否有其独特意义, 其功能和作用机制并不清楚, 有待进一步研究本研究运用 3'/5'RACE 技术和 Northern 印迹技术成功地获取并证实了新 HCC 相关基因 HTA 的全长序列并分析了其可变剪接形式对该基因的基本结构和信息在原有基础上有了进一步的了解, 也为后续的深入研究提供了必要的保证, 打下了坚实的基础参考文献 1. Motola-Kuba D, Zamora-Valdes D, Uribe M, et al. Hepatocellular carcinoma. An overview[ J]. Ann Hepatol, 2006, 5(1): El-Serag HB, Rudolph KL. Hepatocellular carcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis[ J]. Gastroenterology, 2007, 132(7): Zender L, Villanueva A, Tovar V, et al. Cancer gene discovery in hepatocellular carcinoma[ J]. J Hepatol, 2010, 52(6): Villanueva A, Minguez B, Forner A, et al. Hepatocellular carcinoma: novel molecular approaches for diagnosis, prognosis, and therapy[ J]. Annu Rev Med, 2010, 61: Liu Y, Li Y, Guo F, et al. Identification of HTA as a novel-specific marker for human hepatocellular carcinoma[ J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2010, 136(8): Scotto-Lavino E, Du G, Frohman MA. 5' end cdna amplification using classic RACE[ J]. Nat Protoc, 2006, 1(6): Scotto-Lavino E, Du G, Frohman MA. 3' end cdna amplification using classic RACE[ J]. Nat Protoc, 2006, 1(6): 王金兵, 朱德厚, 叶秀珍, 等. 启东肝癌细胞系 (QGY-7703) 的建立及其特征 [ J]. 中华肿瘤杂志, 1981, 3(4): WANG Jinbing, ZHU Dehou, YE Xiuzhen, et al. Qidong hepatocellular carcinoma cell line (QGY-7703) is established and its characteristics[ J].

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材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌