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完允雷
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中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 2017, 42(11) http://www.csumed.org 1257 DOI:10.11817/j.issn.1672-7347.2017.11.003 www.csumed.org/xbwk/fileup/pdf/2017111257.

1 中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 2017, 42(11) DOI: /j.issn 和 IL-7 对优化检测 1 型糖尿病患者谷氨酸脱羧酶 65 特异性 T 细胞反应的比较袁娇 1, 崔秋燕 2, 唐维 2, 超晨 2, 周智广 2 2, 杨琳 ( 1. 南昌市第三医院代谢内分泌科, 南昌 ;2. 中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所, 中南大学糖尿病中心, 糖尿病免疫学教育部重点实验室, 国家代谢性疾病临床医学研究中心, 长沙 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨何种细胞因子 ( 或 IL-7) 及其最佳浓度能够最有效地改善酶联免疫斑点法 (enzyme-linked immunospot,elispot) 检测 1 型糖尿病患者谷氨酸脱羧酶 65(glutamic acid decarboxylase 65,GAD65) 特异性 T 细胞反应的效率方法 : 选取 20 例 1 型糖尿病患者 (A 组 ) 及年龄和性别均匹配的 16 例正常对照者 (B 组 );Ficoll 法分离外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cells,pbmcs), 以人 GAD65 内对照巴斯德五合一疫苗为抗原, 加入不同浓度的 [0 U/mL(1 组 ) 0.5 U/mL(2 组 ) 2.5 U/mL(3 组 ) 和 12.5 U/mL(4 组 )],ELISPOT 检测上述各浓度组分泌干扰素 - γ (interferon-gamma,ifn-γ) 的 CD4 + T 细胞, 比较各浓度组的 GAD65 孔 ( 信号 ) 内对照孔( 背景 ) 的斑点数斑点净值以及刺激指数 ( 即信噪比,stimulating index,si); 另选取 21 例 1 型糖尿病患者 (C 组 ) 及 12 例正常对照者 (D 组 ), 检测针对 GAD65 抗原的特异性 T 细胞反应, 比较联合 (2.5 U/mL, 上述实验已证明其为最优浓度,5 组 ) 与联合 IL-7 (0.5 ng/ml,6 组 ) 所产的斑点数和 SI 结果:1)A 组在加入刺激后, 各浓度组中 GAD65 反应性 T 细胞数均较 A1 组增高, 而各浓度下的内对照孔的斑点数亦呈比例升高各浓度组斑点净值比较显示 :A4 组与 A3 组差异无统计学意义 (P>0.05), 而 SI 的比较则提示 A3 组最高 ; 且仅 A3 组的 SI(2.8) 高于 B3 组 (1.5), 差异有统计学意义 (P<0.05) 2)C6 组及 D6 组的 GAD65 孔斑点数均分别略高于 C5 组及 D5 组, 且 C6 组及 D6 组的斑点数增幅也分别高于 C5 组及 D5 组, 但差异均无统计学意义 (P>0.05) C5 组的斑点净值 (5.5) 和 SI(2.8) 均显著高于 C6 组的斑点净值 (4.3) 和 SI(1.8), 差异均有统计学意义 ( 均 P<0.05) 结论:2.5 U/mL 为 ELISPOT 检测 1 型糖尿病患者 GAD65 特异性 T 细胞反应的最佳浓度 ; 较 IL-7 更有利于改善 ELISPOT 检测的 SI [ 关键词 ] 1 型糖尿病 ;T 细胞 ; 酶联免疫斑点法 ; 信噪比 Comparison of effects between and IL-7 on glutamic acid decarboxylase 65 reactive T cell responses in patients with Type 1 diabetes YUAN Jiao 1, CUI Qiuyan 2, TANG Wei 2, CHAO Chen 2, ZHOU Zhiguang 2, YANG Lin 2 收稿日期 (Date of reception): 第一作者 (First author): 袁娇, yuanjiaoyys@163.com 通信作者 (Corresponding author): 杨琳, linda231231@126.com 基金项目 (Foundation item): 国家自然科学基金 ( ) This work was supported by the National Natural Science Foundation of China ( ).

2 1258 中南大学学报 ( 医学版 ), 2017, 42(11) (1. Department of Endocrinology and Metabolism, Third Hospital of Nanchang, Nanchang ; 2. Institute of Metabolism and Endocrinology, Second Xiangya Hospital, Central South University; Diabetes Center, Central South University; Key Laboratory of Diabetes Immunology, Ministry of Education; National Center for Clinical Studies of Metabolic Diseases, Changsha , China) ABSTRACT Objective: To explore the type of cytokine ( or IL-7) and its most optimal concentration regarding the improvement of the signal-to-noise ratio of glutamic acid decarboxylase 65 (GAD65) in enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay in Type 1 diabetic (T1DM) patients. Methods: Twenty T1DM patients (Group A) and sixteen healthy controls matched with age and sex (Group B) were enrolled in our study, and their peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated by Ficoll method. GAD65, internal control and Pediacel served as five-for-one vaccine were selected as the stimulating antigen. Different concentrations of [0 U/mL (Group 1), 0.5 U/mL (Group 2), 2.5 U/mL (Group 3) and 12.5 U/mL (Group 4)] were added to the culture system. The CD4 + T cells of secreting interferon-gamma (IFN-γ) in the above groups were determined by ELISPOT. The spots number, net values and stimulating index (SI) were compared in GAD65 (signal) and internal control (background). Next, another 21 T1DM patients (Group C) and 12 healthy controls matched with age and sex (Group D) were enrolled, and the specific T cell response to the GAD65 antigen was detected. The net values and SI were compared between the best optimal concentration of (2.5 U/mL, Group 5) and IL-7 (0.5 ng/ml, Group 6). Results: 1) After adding into the Group A, the amount of GAD65 reactive T cells in different groups increased compared with Group A1, while the background in the internal control also increased gradually with the increased concentration of. There was no significant difference in net value (signal-noise) in the different concentration between the Group A3 and the Group A4 (P>0.05). The SI in the Group A3 (2.8), the highest one, was significantly higher than that in the Group B3 (1.3) (P<0.05). 2) Although the number of GAD65 spots in the Group C6 and the Group D6 were slightly higher than that in the Group C5 and the Group D5, respectively, the background in the Group C6 and the Group D6 also increased, without statistical significance (P>0.05). The mean net value spot and SI in the Group C5 (net value: 5.5; SI: 2.8) were both significantly higher than those in the Group C6 (net value: 4.3; SI: 1.8) (both P<0.05). Conclusion: The concentration of 2.5 U/mL for is proved to be the best optimal concentration for GAD65 specific T-cell responses in ELISPOT in patients with T1DM. is much better than IL-7 in improvement of the SI in the ELISPOT. KEY WORDS Type 1 diabetes; T cells; enzyme-linked immunospot; signal-to-noise ratio 1 型糖尿病 (Type 1 diabetes,t1dm) 是 T 细胞介导的以 β 细胞选择性破坏为特征的自身免疫性疾病,T 细胞在胰岛自身抗原刺激下分泌不同功能的参与发病机制的细胞因子 [1], 故 T 细胞及其分泌的细胞因子在病程进展中扮演着非常重要的角色, 通过检测外周血中的 T 细胞可以反映胰岛自身免疫的状态目前几项主流的 T 细胞检测手段中, 以酶联免疫斑点技术 (enzyme-linked immunospot,elispot) 最为重要, 它能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况, 并识别外周血中极低频率的自身反应性 T 细胞 [2], 是一种敏感度高特异性强的检测抗原特异性 T 细胞的方法 [3] 即便如此, 由于胰岛自身抗原本身刺激性较弱,T1DM 患者外周血中的自身反应性 T 细胞频率极 [4] 低, 且随着病程的延长体内的细胞免疫反应会减弱等原因, 使得在 T1DM 领域应用 ELISPOT 技术检测仍具困难是最早应用于体外培养扩增 T 细胞的一

3 和 IL-7 对优化检测 1 型糖尿病患者谷氨酸脱羧酶 65 特异性 T 细胞反应的比较袁娇, 等 1259 种细胞因子,IL-7 亦被证实为成熟 T 细胞的一种重要生长因子, 故本研究探讨上述细胞因子是否有利于增强 ELISPOT 检测的信噪比, 且进一步比较两种细胞因子何种更优 1 对象与方法 1.1 对象选取 2012 年 1 月至 2013 年 7 月中南大学湘雅二医院内分泌科门诊及住院的 41 例 T1DM 患者作为病例组, 其中男 23 例, 女 18 例, 年龄 23.0~40.0(29.4±10.6) 岁 ; 另同期纳入年龄性别均匹配的健康志愿者作为对照组, 其中男 16 例, 女 12 例, 年龄 21.0~41.0(30.9±11.2) 岁病例组的纳入标准 :1) 根据 1999 年 WHO 提出的诊断标准诊断为糖尿病 ;2) 诊断后 6 个月内自发酮症或酮症酸中毒 ;3) 长期依赖胰岛素治疗 ;4) 病程 <3 年对照组的纳入标准 :1) 经 75 g 葡萄糖耐量试验 (oral glucose tolerance test,ogtt) 检测, 空腹及服糖后 2 h 血糖均正常 ;2) 无糖尿病及其他自身免疫疾病家族史病例组的排除标准 :1) 特殊类型糖尿病及妊娠糖尿病 ;2) 采血近 2 周内有急性感染 ;3) 同时合并有肿瘤或其他自身免疫相关性疾病 ; 4) 采血前半年曾使用糖皮质激素免疫调节剂本研究得到中南大学湘雅二医院伦理委员会批准, 研究对象均签署知情同意书 1.2 主要仪器耗材及试剂 Thermo 细胞培养箱购于美国 Thermo Scientific 公司 ;AIRTECH 超净工作台购于苏州市苏净环保新材料有限公司 ; 低温离心机购于德国 Eppendorf 公司 ; ELISPOT 读板仪购于美国 Cellular Technology 公司 ; 聚偏二氟乙烯 (polyvinylidene difluoride,pvdf) 膜板购于美国 Millipore 公司 ; 刻度离心管购于德国 Greiner 公司 ; 干扰素 -γ(interferon-gamma,ifn-γ) 包被抗体和二抗购于荷兰 U-CyTech 公司 ;T 细胞谷氨酸脱羧酶 65(glutamic acid decarboxylase 65,GAD65) 及内对照购于瑞典 Diamyd 公司 ; 和 IL-7 购于美国 R&D 公司 ; 巴斯德五合一疫苗购于法国赛诺菲有限公司 ; 淋巴细胞分离液购于美国 Sigma 公司 ;RPMI1640 培养基胎牛血清和 AIM-V(albumin in medium-v) 无血清培养基均购于美国 Gibco 公司 ; 红细胞裂解液购于美国 Biolegend 公司 ;5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚基 - 磷酸盐 / 氯化硝基四氮唑蓝 (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium,nbt/bcip) 片剂购自德国 Roch 公司 ; 磷酸盐缓冲液为中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所自制 1.3 方法人外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cells,pbmcs) 的分离抽取病例组和对照组空腹静脉血 10 ml 置于肝素抗凝管, 加入等体积的磷酸盐缓冲液混匀稀释后沿管壁缓慢加至盛有淋巴细胞分离液的管中在室温下离心 (740 g,30 min), 离心后管中液体可分 4 层 : 上层为血浆和磷酸盐缓冲液, 下层主要为红细胞和粒细胞, 中层为淋巴细胞分离液, 在上层和中层界面之间的白色云雾层即白膜带 ; 小心吸取白膜, 加入大约 5 倍体积的磷酸盐缓冲液吹打混匀, 离心 (290 g,10 min), 离心后倾倒上清, 弹散细胞团, 加入红细胞裂解液静置 5 min 后, 加入 2%HS-1640 液洗涤 1 次, 再次离心 (290 g,10 min) 离心后弃上清, 弹散细胞团, 加入约 1~2 ml 的 AIM-V 培养基重悬细胞后, 取少许悬液行细胞计数再次离心 (290 g,10 min), 弃上清, 加入含的 AIM-V(4 种不同的终浓度 ) 或含 IL-7 的 AIM-V( 终浓度为 0.5 ng/ml) 重悬细胞浓度至个 /ml, 用于 ELISPOT 检测 ELISPOT 检测 ELISPOT 检测步骤如下 :1)IFN-γ 抗体包被 PVDF 膜板,35% 的无水乙醇预湿 PVDF 膜板,1 min 后甩干, 磷酸盐缓冲液洗涤 5 遍, 拍干, 再加入已稀释的 IFN-γ 抗体约 75 μl/ 孔,4 过夜 2) 次日取出 PVDF 膜板, 用力甩去 IFN-γ 抗体, 用无菌的磷酸盐缓冲液洗涤 5 次, 倒扣拍干加入 200 μl/ 孔的封闭液 (10%HS-1640),37 5%CO 2 培养箱放置 1 h, 取出用力甩掉封闭液, 分别加入 GAD65(25 μg/ml) 内对照 ( 未加任何抗原 )(25 μg/ml), 阳性对照巴斯德五合一疫苗 (0.2 g/ml), 随后用含 /IL-7 的 AIM-V 重悬细胞至适当浓度, 每孔加入个 PBMCs 37,5%CO 2 培养箱孵育 40~42 h, 设 2~3 个平行孔 3) 取出 ELISPOT 板, 用力甩除细胞, 磷酸盐缓冲液洗板 5 次, 拍干 ; 加入 90 μl/ 孔生物素标记的二抗室温孵育 1 h, 再次甩干洗板, 加入碱性磷酸酶标记的亲和素室温下继续孵育 1 h, 如上洗板后, 加入 90 μl/ 孔的显色剂, 室温下放置 10~15 min 至斑点出现 ; 去除显色剂, 去离子水反复冲洗 PVDF 膜板, 终止显色, 置于室温吹风干燥,ELISPOT 读板仪自动计算斑点数及其他参数 GAD 斑点净值 =GAD 孔斑点数内对照孔斑点数 ; 刺激指数 (stimulate index,si)=gad 孔斑点数 / 内对照孔斑点数 Ficoll 法分离外周血 PBMCs 选取 20 例 T1DM 患者 (A 组 ) 及年龄和性别均匹配的 16 例正常对照组 (B 组 );Ficoll 法分离 PBMCs, 以人 GAD65 内对照巴斯德五合一疫苗为抗原, 加入不同浓度的 [0 U/mL(1 组 ) 0.5 U/mL(2 组 )

4 1260 中南大学学报 ( 医学版 ), 2017, 42(11) U/mL(3 组 ) 和 12.5 U/mL(4 组 )],ELISPOT 检测上述各孔分泌 IFN-γ 的 CD4 + T 细胞, 比较各浓度组的 GAD65 孔 ( 信号 ) 内对照孔( 背景 ) 的斑点数斑点净值以及 SI A 组与 B 组与上述浓度分别可组合成 A1, A2,A3,A4 组和 B1,B2,B3,B4 组联合与联合 IL-7 所产生的斑点数和 SI 的检测另选取 21 例 T1DM 患者 (C 组 ) 及 12 例正常对照 (D 组 ), 检测针对 GAD65 抗原的特异性 T 细胞反应, 比较联合 (2.5 U/mL, 上述实验已证明其为最优浓度,5 组 ) 与联合 IL-7(0.5 ng/ml,6 组 ) 所产的斑点数和 SI C 组与 D 组与和 IL-7 分别组合成 C5,C6 和 D5,D6 组 1.4 统计学处理采用 SPSS 18.0 统计软件进行分析计量资料若服从正态分布用均数 ± 标准差 (x±s) 表示, 若服从偏态分布则以中位数和四分位数间距表示计数资料用绝对数构成比或率表示计量资料正态分布且方差齐性的两组均数间比较用 t 检验 ; 若为非正态分布数据, 则采用非参数检验, 两独立样本比较采用 Mann-Whitney U 检验, 多个独立样本间计量资料的比较采用 Friedman 检验 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 不同浓度下的 ELISPOT 结果比较 A 组中各浓度组的比较 GAD65 孔及内对照孔的平均斑点数 : 二者的平均斑点数均随浓度的增加而增加,GAD65 孔中逐步上升的顺序分别为 A1 组 (2.5) A2 组 (4.5) A3 组 (13) A4 组 (28); 内对照孔中逐步上升的顺序分别为 A1 组 (1.5) A2 组 (2.5) A3 组 (6.5) A4 组 (20.0), 且二者在各浓度组间差异均具有统计学意义 ( 均 P<0.01) 平均斑点净值 :A4 组 (7.5)>A3 组 (6.5)>A2 组 (2.0)>A1 组 (1.0), 其中 A3 组与 A2 组的组间差异具有统计学意义 (P<0.01) SI:A3 组 (2.4)>A4 组 (1.3)>A2 组 (1.2)>A1 组 (1.0), 其中 A3 组与 A2 组 A3 组与 A4 组的组间差异均具有统计学意义 ( 均 P<0.01) B 组中各浓度组的比较 GAD65 孔及内对照孔的斑点数虽然均随浓度的增加而逐步上升, 但差异均无统计学意义 ( 均 P>0.05); 而平均斑点净值及 SI 在各浓度组间差异均未发现统计学意义 ( 均 P>0.05) A 组与 B 组间的比较平均斑点净值比较 : 仅 A3 组的平均斑点净值显著大于 B3 组 (P<0.01, 图 1A) 平均 SI 比较 : 仅 A3 组的平均 SI 显著大于 B3 组 (P<0.01, 图 1B) 斑点数 / PBMCs U/mL A 组 B 组 0.5 U/mL ** 2.5 U/mL 12.5 U/mL SI (1 组 ) (2 组 ) (3 组 ) (4 组 ) A (1 组 ) (2 组 ) (3 组 ) (4 组 ) B U/mL A 组 B 组 0.5 U/mL ** 2.5 U/mL 12.5 U/mL 图 1 A 组和 B 组 GAD65 特异性 T 细胞于 4 种浓度中所产生的斑点净值和 SI 比较 Figure 1 Comparison of spot net values and SI in the detection of GAD65 specific T-cell in different concentrations subgroups of in the Group A and the Group B A: Spot net values. **P<0.01 vs the Group A2; P<0.01 vs the Group B3. B: SI. **P<0.01 vs the Group A2; P<0.01 vs the Group A4; P<0.01 vs the Group B3 2.2 ELISPOT 法联合与联合 IL-7 检测结果比较 C 组中和 IL-7 检测的比较 C6 组 GAD65 孔及内对照孔斑点数均高于 C5 组, 但差异均无统计学意义 ( 均 P>0.05, 表 1);C5 组 GAD65 孔的斑点净值及 SI 均高于 C6 组, 差异均具有统计学意义 ( 均 P<0.05);C6 组的 GAD65 孔斑点数较 C5

5 和 IL-7 对优化检测 1 型糖尿病患者谷氨酸脱羧酶 65 特异性 T 细胞反应的比较袁娇, 等 1261 组增加 18%, 而 C6 组的内对照孔斑点数较 C5 组增加 48% D 组中与 IL-7 检测的比较 3 讨论 D6 组 GAD65 孔及内对照孔斑点数和斑点净值均高于 D5 组, 但差异均无统计学意义 ( 均 P>0.05); 虽然 C5 组的 SI 高于 C6 组, 但二者间差异亦无统计学意义 (P>0.05) C 组与 D 组检测的斑点净值及 SI 的比较 C5 组的斑点净值 (5.5) 高于 D5 组 (1.5), 且 C5 组的 SI(2.8) 也高于 D5 组 (1.5), 且差异均有统计学意义 ( 均 P<0.05, 表 1) C6 组的斑点净值和 SI 虽高于 D6 组, 但差异均无统计学意义 (P>0.05, 表 1) 表 1 C5,C6 组与 D5,D6 组的 ELISPOT 联合或 IL-7 检测 GAD65 特异性 T 细胞的斑点净值及 SI 的比较 Table 1 Comparison of spot net values and SI by ELISPOT with or IL-7 in the detection of GAD65 specific T-cell in the C5, C6 groups and the D5, C6 groups 组别 n 斑点净值 SI C5 组 * 2.8* D5 组 C6 组 D6 组与 D5 组比较,*P<0.05; 与 C5 组比较, P<0.05 随着 T 细胞检测技术的不断发展, 其临床应用 [5] 价值也逐渐受到关注, 现在已经有研究认为 T 细胞检测可以作为糖尿病病因学分型诊断和免疫治疗效果监测的有效手段如何提高 ELISPOT 检测的敏感度, 提升 T 反应的信号, 关键在于增加特异性斑点的数目减少非特异性斑点的形成, 降低背景, 提高 SI [6] 本研究发现 : 在加入刺激后, 各浓度组中 GAD65 反应性 T 细胞数目较未加入组均增高, 但相应浓度下的内对照孔斑点数目 ( 即背景 ) 也呈比例升高, 故需比较各组斑点净值结果虽显示 12.5 U/mL 组最大, 但与 2.5 U/mL 组相比差异并无统计学意义 (P>0.05) 此外,SI 的比较进一步提示 2.5 U/mL 在背景未显著增加的情况下, 可最大程度地提高信号, 即有助于提高 SI, 证实该浓度为 ELISPOT 检测中针对 GAD65 特异性 T 细胞反应时的最佳浓度在首届 [7-8] 国际 T 细胞检测标准化会议上, 有学者指出在实验体系中加入低浓度的可抑制自身反应性 T 细胞凋 [9] 亡, 并促进自身反应性 T 细胞的增殖 Ganusov 等研究显示 : 浓度在 2.5 U/mL 时,CD4 + T 细胞分裂速度最快, 此时抗原诱导刺激下 T 细胞数量在 2 次细胞分裂增殖后即可达到最大值虽然, 和 IL-7 拥有共同的 γ 链, 且在维持 T 细胞动态增殖及功能方面均都发挥重要作用, 但二者 [10-11] 对于 T 细胞的作用机制又不尽相同有学者认为 IL-7 能够优先选择作用于记忆性 T 细胞, 则在增强初始 T 细胞及调节性 T 细胞反应方面更具优势 [12-13], 这一假设吸引了越来越多研究者们的注意, 尤其是其在提高 ELISPOT 检测敏感度上的作用让科学家们抱有极大的兴趣和希望但二者之中究竟孰更有利于提高实验敏感度并降低实验背景, 目前尚无定论本研究分别对和 IL-7( 试验中所用浓度定为 2.5 U/mL, 本实验已证实该浓度为最适浓度 ;IL-7 [14] 浓度定于 0.5 ng/ml,martinuzzi 等已证实该浓度为最适浓度 ) 对 GAD65 自身反应性 T 细胞反应强度的影响进行比较, 发现 IL-7 的 GAD65 孔斑点数较增加 18%, 而 IL-7 的内对照孔斑点数较增加 48% IL-7 较而言, 在增加 GAD65 特异性斑点数的同时, 背景也显著提高, 且背景增幅明显高于 GAD65 特异性 T 细胞数增幅, 而在提高特异性斑点数的同时, 背景未进一步增加, 从而在提高 SI 方面优于 IL-7 [15] Dooms 等研究发现在抗原刺激下 CD4 + T 细胞表面的 IL-7Rα 表达下调, 而 Rα 表达上调, 促进了抗原特异性 T 细胞增殖本研究结果显示 : 无论是比较平均斑点净值还是 SI,(2.5 U/mL) 均显著高于 IL-7(0.5 ng/ml)(p<0.05), 表明较 IL-7 而言, 更有利于增强 GAD65 自身反应性 T 细胞的反应强度 Martinuzzi [14] 等应用 IFN-γ ELISPOT 检测 T1DM 患者 CD8 + T 细胞时, 发现 IL-7 联合无血清培养基的结果优于联合人血清培养基, 和本实验结果不一致, 其原因可能主要与二者所研究的 T 细胞亚群不一样有关, 本实验中研究的是 CD4 + [14] T 细胞, 而 Martinuzzi 等研究的是 CD8 + T 细胞 ; 而该两种 T 细胞对 IL-7 应答水平存在明显不同, 相比 CD8 + T 细胞,CD4 + T 细胞的增殖效率要低很多 [16], 其具体机制不清 [17] [18] Guimond 等通过体外实验证实, 可能由于两种细胞表达不同的 IL-7Rα, CD8 + T 细胞较 CD4 + T 细胞对于 IL-7 更具有竞争优势基于上述结果, 作者认为 ELISPOT 联合这一优化方案在提高 ELISPOT 检测敏感度上较 T 细胞检测联合 IL-7 更具优势, 但鉴于研究的抗原种类限于 GAD65, 还需要进一步在其他常用胰岛抗原上再加以验证, 以便尽快应用于临床糖尿病的免疫分型诊断

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600 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 5 期 2016 年 5 月 were significantly decreased, but the levels of IL-12 in two groups were significantly increa

600 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 5 期 2016 年 5 月 were significantly decreased, but the levels of IL-12 in two groups were significantly increa 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 5 期 2016 年 5 月 599 喘可治注射液联合细辛脑注射液治疗小儿毛细支气管炎的临床研究唐辉英, 佘定平, 马颐娇深圳市儿童医院呼吸科, 广东深圳 518026 摘要 : 目的探讨喘可治注射液联合