染料木素对胃癌干细胞的作用及机制的研究 The function of Genistein in Gastric Cancer Stem Cell-like Properties 博士后姓名黄卫锋流动站 ( 一级学科 ) 名称生物学专业 ( 二级学科 ) 名称细胞生物学研究工作起始时间 20

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认乙花
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1 分类号 U D C 密级编号厦门大学附属第一医院博士后研究工作报告染料木素对胃癌干细胞的作用及机制的研究工作完成日期报告提交日期黄卫锋 2014 年 8 月 2014 年 8 月厦门大学 2014 年 8 月

2 染料木素对胃癌干细胞的作用及机制的研究 The function of Genistein in Gastric Cancer Stem Cell-like Properties 博士后姓名黄卫锋流动站 ( 一级学科 ) 名称生物学专业 ( 二级学科 ) 名称细胞生物学研究工作起始时间 2012 年 2 月研究工作期满时间 2014 年 8 月厦门大学 2014 年 8 月

3 厦门大学博士后研究工作报告著作权使用声明本人完全了解厦门大学有关保留使用博士后研究工作报告的规定厦门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交该报告的纸质版和电子版, 有权将该报告用于非赢利目的的少量复制并允许该报告进入学校图书馆被查阅, 有权将该报告的内容编入有关数据库进行检索, 有权将博士后研究工作报告的标题和摘要汇编出版保密的博士后研究工作报告在解密后适用本规定本研究报告属于 : 1 保密( ), 2 不保密( ) 纸本在年解密后适用本授权书 ; 电子版在年解密后适用本授权书 ( 请在以上相应括号内打 ) 作者签名 : 日期 : 年月日导师签名 : 日期 : 年月日

4 摘要染料木素, 大豆中发现的一种主要的大豆异黄酮, 多项研究表明其在体外和体内能够抑制不同类型肿瘤的发生发展越来越多的证据显示在胃癌中有肿瘤干细胞的存在我们发现, 在胃癌肿瘤细胞 MGC-803 和 SGC-7901 中, 通过软琼脂克隆形成和无血清瘤球形成实验表明, 由丰城鸡血藤中提取的染料木素 (15 µm) 能够抑制肿瘤细胞的自我更新能力同时, 染料木素能够提高胃癌细胞对化疗药物 5-Fu 和 ciplatin 的敏感性我们的进一步结果表明, 染料木素抑制胃癌细胞的干细胞特性与其诱导的 mir-145 的表达密切有关此外, 染料木素也能够抑制胃癌细胞在裸鼠成瘤体内的肿瘤生长在本研究中, 我们还发现 mir-145 的一个新的靶基因 ABCG2 本研究揭示了染料木素能够抑制胃癌细胞的干细胞特性, 这种抑制作用与诱导 mir-145 的表达 ERK 活性的抑制密切相关我们的研究结果为染料木素治疗胃癌提供了进一步的理论依据和实验基础关键词 : 染料木素, 胃癌肿瘤干细胞, 耐药性,miR-145

5 Abstract Genistein, the predominant isoflavone found in soy products, has exerted its anticarcinogenic effect in many different tumor types in vitro and in vivo. Accumulating evidence in recent years strongly indicated the existence of cancer stem cells in gastric cancer. Here, we showed that low does of genistein (15 µm), extracted from Millettia nitida Benth var hirsutissima Z Wei, inhibit tumor cell self-renewal in two types of gastric cancer cells by colony formation assay and tumor sphere formation assay. Treatment of gastric cancer cells with genistein reduced its chemoresistance to 5-Fu (fluorouracil) and ciplatin. Our further results indicated that the reduced self-renewal and chemoresistance may associated with the induction of mir-145 expression and the inhibition of ERK 1/2 activity. Furthermore, genistein reduced tumor mass in the xenograft model. At the same time, we found ABCG2 is the new target of mir-145. Together, genistein inhibited gastric cancer stem cell-like properties and reduced its chemoresistance. Our results provide a further rationale and experimental basis for using the genistein to improve treatment of patient with gastric cancer. Key Words: Genistein, Gastric Cancer Stem Cell, Chemoresistance, mir-145.

6 目录第一章前言肿瘤干细胞学说胃癌干细胞 MIRNA 与肿瘤干细胞染料木素本文的研究目的和意义第二章材料与方法实验材料统计学方法第三章结果染料木素的结构分析染料木素抑制胃癌细胞的克隆形成染料木素抑制胃癌细胞的瘤球形成染料木素提高胃癌细胞对肿瘤化疗药物的敏感性在裸鼠体内染料木素抑制肿瘤的形成染料木素诱导 MIR-145 的的表达 MIR-145 调控胃癌细胞瘤球的形成抑制 MIR-145 能部分消除染料木素对胃癌细胞瘤球形成的抑制作用 MIR-145 INHIBITOR/ 染料木素对胃癌细胞耐药性的影响 ABCG2 是 MIR-145 的靶基因第四章结果与讨论... 41

7 参考文献 : 致谢博士生期间发表的学术论文博士后期间发表的学术论文个人简历... 51

8 第一章前言胃癌是一种人类消化道的恶性肿瘤, 是目前全球最常见的一种, 其严重地危害着人类的健康和生存与发展胃癌的发病率和死亡率一直居高不下, 在所有恶性肿瘤中发病率占全球第四位, 而死亡率更是排名第二 [1] 在国内, 消化道肿瘤中发病率最高的就是胃癌, 同时其死亡率也在所有人类恶性肿瘤中位居首位, 据统计, 全国罹患胃癌患者中, 平均每年死亡率达到 16/10 万人口, 其中高发地区如我国西北地区甚至高达 60/l0 万人口虽然伴随着科学技术与医疗水平的不断发展, 诊断和治疗胃癌的方法和技术已经有了显著的提升和进步, 但是由于胃癌患者在发现胃癌时通常都处于胃癌的进展期或者晚期, 其最佳的手术时机普遍被错过, 即使手术也容易导致胃癌复发和广泛转移, 因此胃癌患者的术后 5 年生存率根本没有得到明显的升高, 死亡率仍旧居高不下因此, 如何降低胃癌发病率和死亡率是目前研究的重中之重, 也是我们迫切需要解决的重要问题胃癌的详细分子机制目前仍未被完全解释清楚然而已有的实验结果认为胃癌的产生与进展程度是波及多种因素和多个阶段的, 其胃癌的恶变过程包括了细胞增殖细胞周期紊乱 DNA 复制逃避的细胞凋亡过度的细胞永生化血管形成及胃癌通过血管和周围组织的侵袭转移等一系列的过程环境因素, 特别是不健康的饮食, 被认为是最重要的致病原因很多研究显示腌制烟熏及罐头类食物富含亚硝酸盐, 而 N- 亚硝基化合物与胃癌发生有重要关系此外, 胃癌的产生与进展程度被认为与幽门螺杆菌的感染 (Helicobacter pylori,hp) 癌前病变和基因遗传等因素息息相关分子生物学的研究发现, 抑癌基因癌基因凋亡基因与转移相关基因等多种因子的改变参与了胃癌的发生发展过程, 但是这些相关基因的调控机制极其复杂, 而且相关基因的变化也是千变万化, 相关基因的详细的调控机制仍未被完全阐明 1.1 肿瘤干细胞学说肿瘤干细胞学说认为, 肿瘤细胞存在异质性, 肿瘤组织中存在极少量具有干细胞性质的癌细胞亚群, 具有多向分化潜能和无限增殖及自我更新能力, 是肿瘤发生发展浸润转移复发及耐药的决定性因素 [2] 这些肿瘤干细胞能分化为具有多种不同表型的细胞亚群, 组成大块肿瘤组织以往针对肿瘤的常规治 1

9 疗是以减少肿瘤细胞数量为目的, 主要针对快速分裂期的肿瘤细胞, 肿瘤干细胞对其具有较强的抵抗性, 无法被有效地消灭, 残留的肿瘤干细胞就是引起复发和转移的根源因此, 只有杀灭肿瘤干细胞或诱导其分化, 才有可能彻底治愈癌症随着 1997 年 Bonnet 等从急性髓系白血病患者骨髓中分离出一类表面抗原标记为 CD34+CD38- 的细胞, 并最终鉴定出这一群细胞具有自我更新和多向分化潜力, 极有可能就是肿瘤干细胞 [3] 至此之后, 多种实体肿瘤 CSC 包括胃癌干细胞先后被分离及鉴定出来 1.2 胃癌干细胞胃癌干细胞的存在证据胃癌干细胞的研究起步较晚,2009 年 Takaishi[4] 等利用只含表皮生长因子 ( epidermal growth factor,egf) 和碱性成纤维细胞生长因子 ( basic fibroblast growth factor,bfgf) 的无血清培养基培养人胃癌细胞系 MKN-45 MKN-74 和 NCI-87, 得到成球细胞集落, 将该群细胞移植入非肥胖糖尿病 / 严重联合免疫缺陷型小鼠 ( NOD/SCID) 体内后较其母代细胞系具有更加明显的致瘤能力, 符合肿瘤干细胞的定义标准 [5] 此后, 肿瘤干细胞领域开始了大规模的关于胃癌干细胞的研究胃癌干细胞的生物学特性胃癌干细胞的生物学特性与其他肿瘤干细胞类似, 主要表现在自我更新多向分化高效致瘤多重耐药等几个方面自我更新主要表现为体外高效的克隆成球特征 Takaishi 等 [4] 利用无血清培养基得到 CD44(+) 胃癌干细胞后检测了该细胞亚群的体外克隆成球能力, 结果显示将近 10% ~ 20% 的 CD44(+) 细胞亚群在 3 ~ 4 周后形成了明显的细胞集落, 而 CD44(-) 细胞亚群在相同条件下培养 4 周后形成细胞集落的比例不到 1% Xue[6] 等用化疗富集胃癌干细胞的方法从 SGC-7901 人胃癌细胞系中得到具有肿瘤干细胞性质的胃癌干样细胞亚群 ; 体外克隆成球实验结果显示, 两周后胃癌干细胞亚群组形成了明显的细胞集落, 而普通 SGC-7901 细胞组几乎没有细胞集落的形成因此, 体外无血清培养基中形成肿瘤球是胃癌干细胞的一项重要特征多向分化是指胃癌干细胞的多向分化能力是指胃癌干细胞具有类似于组织 2

10 干细胞的向不同方向分化为分化程度不同的肿瘤细胞的能力, 这可能是肿瘤组织异质性产生的重要原因之一 Zhang[7] 等在人胃癌细胞系 AGS 中利用表面标志物 CD44 和 CD24 进行细胞分选, 得到了少量的 CD44(+)/CD24(+) 细胞亚群, 将 100 个该细胞亚群注射入 NOD/SCID 小鼠胃浆膜和腹部皮下, 成瘤后在胃癌移植瘤中同时分离出 CD44(+)/CD24(+) 细胞亚群和 CD44(-)/ CD24(-) 细胞亚群, 该结果显示该胃癌干细胞亚群具有分化潜能高效致瘤是指肿瘤干细胞在肿瘤组织中所占的比例很小, 大约 0.1%~10%, 但只需极少量的肿瘤干细胞即可以在免疫缺陷小鼠体内形成肿瘤, 此即高效成瘤肿瘤干细胞体内高效成瘤被认为是肿瘤干细胞最重要的特征, 是鉴定肿瘤干细胞的金标准 [8] 近年来关于胃癌干细胞分离和纯化的相关研究中, 得到的胃癌干细胞或胃癌干样细胞虽然表面标志物各有差异, 但大多数分离出的胃癌干细胞亚群与对照组相比在 NOD/SCID 小鼠体内都可以高效致瘤 Zhang 等 [7] 将人胃癌细胞系 AGS 中分离得到的 200 个 CD44(+)/CD24 (+) 和 10 4 CD44(-)/CD24(-) 个细胞分别接种到免疫缺陷小鼠胃黏膜及皮下, 两周后即在 CD44(+)/CD24(+) 组发现有 6/12 的小鼠形成肿瘤,16 周后 CD44(-)/CD24(-) 组发现有 1 /12 的小鼠形成肿瘤多重耐药是指传统的化疗药物治疗胃癌的疗效不佳, 其主要原因可能是缺乏以胃癌干细胞为主要靶点的治疗手段胃癌干细胞的具有耐药性被认为可能是导致胃癌化疗不彻底并容易复发的根源其耐药机制主要有四个方面 [9]: 一是沉默静止, 大多情况下绝大多数胃癌干细胞处于 G0 期而不进入细胞周期, 而大多数化疗药物均作用于细胞周期中的细胞 ; 二是高表达 ATP 转运蛋白 ( ATP binding cassette,abc) 将化疗药物泵出细胞外, 从而避免化疗药物引起的损伤 ; 其三是抑制凋亡 ; 其四是 DNA 修复功能的异常激活在胃癌干细胞的相关研究中, 同样可以观察到胃癌干细胞的高效耐药性 Han 等 [10] 将 EpCAM (+)/CD44(+) EpCAM(+)/CD44 (-) EpCAM(-)/CD44(+) 和 EpCAM(-)/CD44(-) 细胞亚群分别在相同条件下接受不同浓度梯度的抗肿瘤药物 ( 氟尿嘧啶紫杉醇长春新碱阿霉素 ) 处理, 48h 后用 WST-1 进行活性染色, 酶联免疫吸附实验结果显示 EpCAM(+)/CD44(+) ( 胃癌干细胞组 ) 具有更明显的抵抗化疗作用, 随着化疗药物浓度梯度的增加, 这种抵抗化疗的现象越明显 3

11 1.2.3 胃癌干细胞的表面标志物与急性髓系白血病乳腺癌非小细胞肺癌不同, 胃癌干细胞的特异性表面标志物至今尚无明确的共识, 多数标志物存在争议 Takaishi 等 [4] 认为 CD44 是胃癌干细胞特异性表面标志物, 并且证实了 CD44(+) 胃癌细胞亚群具有显著的自我更新高效致瘤多重耐药的特性 ; 但 Xue[6] 等的研究结果提示人胃癌细胞系 SGC-7901 中 CD44(+) 胃癌细胞比例占 90% 以上, 但体内成瘤实验结果显示其与 CD44(-) 细胞亚群无明显差异其他目前比较常用的胃癌干细胞标志物还有 : CD90(+) [11] CD133(+)[12] CD71(-)[13] EpCAM(+)/CD44(+)[7, 10] CD44(+)/CD54(+)[14] CD44(+)/CD24(+)[7] 等虽然目前大多数研究结果尚未能对胃癌干细胞特异性表面标志物达成共识, 但是他们研究中所分离出的胃癌干细胞大都经过肿瘤干细胞特性 ( 体外成球和体内致瘤 ) 的检验, 符合肿瘤干细胞的定义和标准结果的差异可能与肿瘤细胞的异质性有关, 正如胚胎干细胞与成体干细胞的差异类似, 处于不同分化阶段的肿瘤干细胞所表达的细胞表面分子可能也会有所差异胃癌干细胞的分离和提纯胃癌干细胞的获取可以从胃癌病灶中取得组织后进行原代培养和分离, 另外还可以通过从人胃癌细胞系中分离或诱导来获取胃癌干细胞虽然来源不同, 但是主要的提纯方法都基本一致 : 形态性筛选和功能性筛选还有部分研究中通过化疗诱导产生上皮间质转化的方法来获取胃癌干细胞克隆成球分选法克隆成球细胞分选技术即无血清培养技术, 是利用肿瘤干细胞能在无血清培养基中增殖并且保留干细胞特性的特点将肿瘤干细胞与普通肿瘤细胞分选开来目前多数肿瘤干细胞都可以用该方法分选出来 [15, 16], Han[10] 和 Song[17] 等利用该方法分别在胃癌组织和胃癌细胞系中分选出了具有干细胞特性的胃癌干细胞该分选方法简便易行, 是分选肿瘤干细胞的有效途径流式细胞分选法细胞仪分选法即荧光活化细胞分选法, 是利用样本细胞结合荧光素标记的抗体能力大小来分选目的细胞, 所以在肿瘤干细胞分选领域适用于表面标志物明确的肿瘤干细胞的分选对于胃癌干细胞的分选, 尚缺乏统一的表面标志物, 限制了其在胃癌干细胞分选中的应用, 但仍有学者采用一些比较常用的肿瘤干细胞表面标志物进行标记分选, 比如 CD44 CD24 CD133 EpCAM 4

12 等免疫磁珠分选法免疫磁珠分选法类似流式细胞分选法, 也是利用干细胞标志来分选胃癌干细胞其作用原理是利用细胞表面抗原可以与连接有磁珠的特异性单克隆抗体相结合, 在外来磁场的作用下, 目的细胞会被吸附在磁场中, 从而将其分选出来免疫磁珠分选法与流式细胞分选法在胃癌干细胞研究中多用于表面标志物的验证侧群细胞分选法侧群细胞的概念最早由 Goodell 等率先提出 [18] 认为干细胞和一部分肿瘤细胞可以将荧光染料 Hoechst33342 泵出胞外导致拒染, 表现为细胞核着色程度极低甚至不着色, 然后利用流式细胞术将这部分细胞分选出来, 即得到 SP 细胞因该方法是利用干细胞拒染的特性进行分选, 属于功能分选, 所以适用于表面标志物尚不明确的肿瘤干细胞的分选大网膜乳斑分选法大网膜乳斑分选法是近年来针对胃癌干细胞的特异性分选方法其理论基础是胃癌干细胞在转移灶内增殖分化为成熟肿瘤细胞的过程中经历了肿瘤干细胞肿瘤前驱细胞 ( progenitor cell) 快速扩增细胞 (rapidlyproliferating cell) 和终末分化细胞 (terminally differentiated cell)4 个阶段 [2, 19] 有研究发现, 胃癌细胞发生腹膜转移的早期会特异性地首先侵犯大网膜乳斑区并形成微转移灶, 乳斑区的巨噬细胞在发挥杀伤肿瘤细胞作用的同时, 也分泌细胞因子促进肿瘤细胞增殖 3 天后可以发现大部分肿瘤细胞被杀死, 但仍有少量的细胞存活并以 3~8 个为一个细胞团定植下来, 经证实这类细胞具有肿瘤干细胞的性质 [20, 21] 上皮间质转换诱导分选法 EMT 是指某些上皮细胞在一定条件下失去上皮粘附因子的表达而脱粘附, 转而获得具有迁徙能力的间质细胞特性的现象 [22] 这种现象被认为是恶性肿瘤发生转移的重要原因并被大量的研究结果所证实 [23-25] 而一些化疗药物如阿霉素长春新碱氟尿嘧啶等可以诱导 EMT 现象的发生 [26, 27] 发生了 EMT 的细胞侵袭力得以提高, 进而更加容易发生转移 1.3 mirna 与肿瘤干细胞 mirna 简介 mirna 在动物体内的合成比较复杂, 概括如下 : 首先在细胞核内 mirna 基因由 RNA 聚合酶 II 进行转录, 形成初级转录物 pri-mirna[28] 该转录物由属于 5

13 RNase III 家族的 Drosha 酶与 DGCR8 蛋白形成的复合体切割成具有茎环结构的前体 mir-na (pre-mirna) DGCR8 能协助 Drosha 酶的定位, 保证剪切的精确性在动物体内, 这种酶 - 蛋白复合体途径不是形成 pre-mirna 的唯一途径新近的文献 [29] 表明, 另外有一种方式对 pri-mirna 进行剪切, 释放出结构类似 pre-mirna 的内含子, 该内含子能继续进入成熟 mirna 的形成途径, 因此该内含子的形成不需要 Drosha 复合体的剪切 Pre-miRNA 被依赖 Ran-GTP 的转运蛋白 Exportin-5 转运至胞浆 [28], 在另一种酶 Dicer 的剪切作用下形成约 22 个核苷酸长度的 mirna 双链体双链形式的 mirna 存在很短暂, 其中一条单链与一些酶类构成 RNA 诱导的沉默复合物 ( RNA-induced silencing complex, RISC) 而发挥作用, 另一条单链则被降解丢失有文献指出,miRNA 可对人类大约 30 % 的编码蛋白的基因进行了调控 mirna 调节基因表达主要通过与靶 mrna 的互补结合发挥作用 [30] 在包括人的大多数动物体内,miRNA 与 mrna 的 3 UTR 的一些序列通过碱基配对的方式结合, 但这种互补配对不完全, 中间经常出现错配或无法配对的碱基, 这时 mirna 会抑制该 mrna 的翻译而在大多数植物体内,miRNA 与 mrna 能进行近乎完全的互补配对,miRNA 诱导对 mrna 的切割降解 [28] mirna 与肿瘤干细胞肿瘤干细胞较一般肿瘤细胞更能抵抗化疗的杀伤有研究者利用这一特点, 用表柔比星干扰乳腺癌细胞系 SKBR3 传代, 得到富含大量 CD44 + CD24- 表型的癌细胞, 这些细胞在培养时因为自我更新聚集成球体 (mammosphere), 具有这种表型的癌细胞被公认为乳腺癌干细胞, 这也证实了肿瘤干细胞对化疗有抵抗作用 [31] 这些乳腺癌干细胞与其余乳腺癌细胞相比,let-7 下调明显, 几乎测不到而 let-7 能促进乳腺癌干细胞分化, 抑制其增殖传代致癌能力研究人员同时在临床标本上进行了实验, 从乳腺癌患者的癌细胞里分离出乳腺癌干细胞, 对这些细胞做了类似实验, 发现 let-7 确实下调明显, 转染 let-7 后能抑制其自我更新, 这与细胞系实验结果相符这些都说明低水平的 let-7 有利于维持乳腺癌干细胞的增殖潜能及未分化状态他们继续研究发现 let-7 调控 Ras, 能抑制乳腺癌干细胞的自我更新及增殖, 但不影响分化相反,let-7 抑制 Hmga2 表达能促进这些细胞分化, 但不影响其自我更新这反映了 let-7 抑制不同靶基因发挥不同的作用 Shimono 等也发现 6

14 mir-200c 在乳腺癌干细胞中表达下调, 该 mirna 能抑制乳腺癌干细胞在小鼠体内的致瘤能力,BMI1 基因是其调控的靶点 [32] CD133 + 的肿瘤细胞是脑肿瘤的肿瘤干细胞, 它们在培养时因自我更新也能形成球体目前 mirna 对脑瘤干细胞的研究主要集中在抑癌方面在脑胶质母细胞瘤中, mir-451 在 CD133 - 瘤细胞中表达明显高于 CD133 + 瘤细胞, 且能抑制 CD133 + 细胞自我更新形成球体, 与药物甲磺酸伊马替尼联用后, 抑制作用更强 mir-124 与 mir-137 能促进 CD133 + 肿瘤干细胞的分化, 抑制癌细胞的增殖, 细胞周期蛋白激酶 CDK6 是它们的作用靶点 [33] mir-199b-5p 也能通过抑制 Notch 通路上的转录因子 HES1 来抑制 CD133 + 肿瘤干细胞的增殖近来, 高表达上皮细胞黏附分子 EpCAM 且甲胎蛋白阳性的癌细胞被认为是肝细胞肝癌的肿瘤干细胞 Ji 等 [34] 发现在此类细胞中,miR-181 家族的表达量上升转染 mir-181 后, 发现 EpCAM 表型的癌细胞增多 mir-181 能激活肿瘤信号途径 Wnt/β-catenin, 并抑制一些促分化分子调节细胞分化的 CDX2 GATA6, 以及抑制 Wnt/β2catenin 通路的激酶 NLK 是 mir-181 的直接靶点, 使它们沉默能导致 EpCAM + 癌细胞数量的增加这些说明 mir-181 对维持肝癌干细胞 EpCAM 表型即其干性具有重要意义在淋巴细胞性白血病肿瘤干细胞中,miR-17 家族表达上调, 而且瘤细胞中 mir-17-19b 表达越高, 肿瘤干细胞的含量越高在小鼠模型中,miR-17 家族能加强该肿瘤干细胞的致瘤能力, 缩短白血病的发病潜伏期, 抑制瘤细胞的分化, 而且通过对 CDK 抑制因子 p21 的调控来促进瘤细胞增殖 [35] 而在卵巢癌肿瘤干细胞 (CD44 + 瘤细胞 ) 中,miR-199a-2 及 mir-214 的表达较 CD44 - 瘤细胞低, 这两种 mirnas 能促进该肿瘤干细胞分化为 CD44 - 的普通卵巢癌细胞 [36] mir-145 与肿瘤干细胞 mir-145 在乳腺癌肠癌结肠癌中的表达被广泛抑制, 过表达 mir-145 抑制肿瘤的增殖迁移和浸润 [37-40] 在胃癌中,miR-145 的表达下调, 过表达 mir-145 抑制细胞的增殖 P Cao 等人的结果显示 [41], 在体外培养的胃癌细胞系中, mir-145 通过靶向 N-cadherin 调节胃癌细胞的迁移和浸润 [42] 研究表明, mir-145 通过调控 KLF4,OCT4 和 SOX2 来调节胚胎干细胞的分化与此同时, mir-145 通过调控 KLF4,OCT4 和 SOX2 来肿瘤干细胞 [43] 在肺癌, 头颈癌中过 7

15 表达 mir-145 能够抑制肿瘤干细胞的特性 [44, 45] 1.4 染料木素染料木素属于异黄酮类化合物, 又称为染料木黄酮金雀异黄酮 5,7,4 - 三羟基异黄酮, 外观淡黄至浅褐色粉末, 熔点 297 ~298, 溶于 DMSO 和乙醇, 几乎不溶于水, 存在于人及动物食用的各种植物中, 尤其在大豆三叶草苜蓿燕麦大麦黑麦小麦玉米中含量较高 [46] 由于其具有与雌激素相似的结构, 能竞争性结合雌激素受体发挥雌激素样作用, 故又被称为植物雌激素染料木素在植物中主要以非活性成分染料木苷的形式存在, 在被摄入体内后在肠中被分解代谢为活性化合物染料木素而被肠道组织吸收, 然后与葡萄糖醛酸结合, 以尿液和胆汁的形式外排在分泌入胆汁后又被肠肝循环重吸收染料木素具有多种生物学活性, 如抗氧化抗肿瘤抗糖尿病等, 目前, 药效学毒理学研究及临床应用研究具有广阔的前景染料木素的抗肿瘤作用染料木素能够抑制细胞周期, 使细胞停滞于 G2/M 期 Zhou NJ 等 [47] 通过在 HeLa 细胞试验中证明, 染料木素通过下调 TopoⅡα 及 Sp1 mrna 的表达, 上调 Sp3 mrna 的表达促进细胞凋亡, 并使细胞停滞于 G2/M 期 Zhang B 等 [48] 发现, 用离子辐射形式作用于肿瘤细胞, 使处于 G1 和 S 期的细胞降低, G2/M 期明显增多 ; 单独用染料木素作用时大多数细胞停滞于 S 期 ; 合用离子辐射染料木素作用其大多数细胞停滞于 G2/M 期, 其数量显著高于单独使用离子辐射或染料木素作用 Lin HM 等 [49] 指出, 半乳凝素 -3(galectin-3) 可能为染料木素介导的细胞停滞于 G2/M 期及凋亡的关键决定子染料木素诱导肿瘤细胞凋亡, 通过上调相应促凋亡基因, 下调相应抗凋亡基因, 来促进肿瘤细胞的凋亡进而预防限制肿瘤的发生 Dave B 等 [50] 发现喂食雌性小鼠含有染料木素的食物能增加乳房上皮细胞凋亡, 提高抑癌基因 PTEN 水平, 增加 p21 bax bok 等促凋亡基因的表达在细胞试验中, 用染料木素分别作用于转染 PTEN SiRNA 与没经过转染的人乳癌细胞 MCF-7 发现, 经过转染的 MCF-7 细胞凋亡数明显下降,p21 bok 的基因表达也明显下调这说明染料木素主要是通过诱导肿瘤抑制子 PTEN 的表达来促进乳房表皮细胞凋亡的 Vantyghem SA 等 [51] 通过将人乳癌细胞 MDA-MB-435/HAL 注射入雌性裸鼠乳房组织中造成乳癌模型, 然后喂 8

16 其含有染料木素的食物, 观察该裸鼠术后乳癌的迁移情况结果表明, 染料木素能有效地抑制乳癌迁移, 同时发现染料木素能抑制癌细胞的增殖, 促进癌细胞的凋亡 Zhou HB 等 [52] 将人 SG7901 细胞注射入裸鼠皮下组织建立移植肿瘤模型, 然后直接在肿瘤附近注入不同浓度的染料木素, 测定细胞凋亡指数试验证明随着染料木素浓度增加, 凋亡指数相应增加, 其作用机理可能为下调抗凋亡相关基因 Bcl-2, 上调促凋亡相关基因 bax 染料木素的抗糖尿病作用在过去几十年, 肥胖以及由肥胖而引发的相关疾病 ( 如糖尿病 ) 的患病率在西方国家增加迅速, 然而在亚洲国家却处于一种较低的发病率, 由此亚洲含高豆类的饮食正受到人们广泛的关注 [53] 在胰岛细胞株 INS-1E 上的实验 [54] 表明, 染料木素能提高葡萄糖刺激的 B 细胞胰岛素分泌, 但对胞内胞外总胰岛素含量并无影响, 其机制可能与胞内 Ca+ 浓度提高 camp/pka 通路有关杨维霞等 [55] 在 Ⅱ 型糖尿病大鼠模型上的实验表明, 染料木素具有降低其血清胰岛素水平, 改善糖耐量, 降低总胆固醇 (TC) 低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C) 肝糖原及肌糖原含量等 Choi JS 等 [56] 以高脂饲料喂养的卵巢切除小鼠为模型, 发现染料木素能显著降低血清中血糖胰岛素浓度及胰岛素抵抗指数, 肾中 TG 胆固醇也明显降低此外各种蛋白如甾醇反应元件结合蛋白 -2(SREBP-2) 转化生长因子 -β(tgf-β) 表达显著下降, 雌激素受体 -α/β(er-α/β) 过氧化物酶体增值子激活受体 -α(ppar-α) SOD 表达明显升高 SREBP 在调节脂肪酸胆固醇的合成中起了关键性作用 SREBP-2 表达的下降将使得甘油三酯 (TG) 胆固醇合成下降以不同浓度染料木素与高脂饲料饲养 C57BL/6J 小鼠, 几周后发现 [57] 染料木素组小鼠体重明显较轻, 随着染料木素浓度的增加, 小鼠肝及血清中胆固醇 TG 浓度越低, 虽然 PPAR mrna 的水平在各组间没有什么差异, 但高浓度组中的 PPARγ 共激活剂 mrna 水平明显较高用高糖 ( 果糖 ) 喂食 Wistar 大鼠造成胰岛素抵抗模型, 观察染料木素作用的实验 [58] 表明, 染料木素组与模型组比较体重明显减轻, 糖耐量实验也表明染料木素能明显改善大鼠糖耐量, 另外其脂质过氧化产物 TBARS 明显降低,GSH 明显升高在人肝癌细胞株 HepG2 上的试验 [59] 表明, 染料木素通过增加 PPARα mrna 水平及其表达来提高线粒体脂肪酸 β- 氧化酶活性, 增强脂肪酸 β- 氧化最终降低血脂浓度 Szkudelski 9

17 Degree papers are in the Xiamen University Electronic Theses and Dissertations Database. Full texts are available in the following ways: 1. If your library is a CALIS member libraries, please log on and submit requests online, or consult the interlibrary loan department in your library. 2. For users of non-calis member libraries, please mail to etd@xmu.edu.cn for delivery details.

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染料木素对胃癌干细胞的作用及机制的研究 The function of Genistein in Gastric Cancer Stem Cell-like Properties 博士后姓名黄卫锋 流动站 ( 一级学科 ) 名称 生物学 专业 ( 二级学科 ) 名称细胞生物学 研究工作起始时间 20

染料木素对胃癌干细胞的作用及机制的研究 The function of Genistein in Gastric Cancer Stem Cell-like Properties 博士后姓名黄卫锋流动站 ( 一级学科 ) 名称生物学专业 ( 二级学科 ) 名称细胞生物学研究工作起始时间 20