目录生物柱选择指南... 1 生物分子分离... 6 方法开发指南 一级结构分析方法 反相 LC/MS 方法 电荷异构体分析方法 聚集体和片段分析方法 多糖及亲水性多肽 / 糖肽分析方法 滴度测定和细胞培养优化方法

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1 安捷伦生物分析液相色谱柱选择指南 生物药物和生物分子分析参考指南

2 目录生物柱选择指南... 1 生物分子分离... 6 方法开发指南 一级结构分析方法 反相 LC/MS 方法 电荷异构体分析方法 聚集体和片段分析方法 多糖及亲水性多肽 / 糖肽分析方法 滴度测定和细胞培养优化方法 高灵敏度毛细管色谱柱方法 用于蛋白质鉴定和杂质分析的安捷伦仪器... 3 一级结构分析 AdvanceBio RP-mAb ZORBAX 3Å StableBond ZORBAX 3Å Extend-C Poroshell AdvanceBio 肽谱分析色谱柱 PLRP-S ZORBAX 氨基酸分析 (AAA) 柱和消耗品 电荷异构体分析 Agilent Bio MAb HPLC 色谱柱 Agilent Bio IEX HPLC 色谱柱... 8 PL-SAX 强阴离子交换柱 PL-SCX 强阳离子交换柱... 9 Agilent Bio-Monolith 离子交换 HPLC 柱 聚集体和片段分析 Agilent Bio SEC Agilent Bio SEC ProSEC 3S ZORBAX GF-25 和 GF-45 凝胶过滤柱 糖基化表征 N- 糖链分析 N- 糖链标准品 N- 糖链样品前处理 亲水性多肽和糖肽分析 滴度测定 Agilent Bio-Monolith Protein A HPLC 色谱柱 蛋白质去除 安捷伦蛋白质分离系统和蛋白质组学试剂 多重亲和去除系统 多重亲和去除系统启动试剂盒 特殊规格色谱柱 毛细管和纳流液相色谱柱 ZORBAX Bio-SCX 系列 II MicroBore (1. mm 内径 ) 色谱柱 二维液相色谱 纯化 制备 HPLC mrp-c18 高蛋白回收柱 ZORBAX PrepHT 适用于 Prep to Process( 制备到生产级别 ) 的 PLRP-S Agilent Bio MAb 和 Agilent Bio IEX 用于 Prep to Process( 制备到生产级别 ) 的 PL-SAX 和 PL-SCX 多肽纯化 适用于合成多肽的 VariTide RPC 柱 VariPure IPE Load & Lock 轴向压缩制备型 HPLC 色谱柱装填系统 实验室 Load & Lock 色谱柱 Agilent Bio SEC BioHPLC 资源 卡套柱系统 柱芯 / 保护柱芯系统兼容性指南 USP 指定产品 仅 BioHPLC 色谱柱 BioHPLC 色谱柱文献 生物制药相关定义 引用参考文献 AdvanceBio 肽谱分析色谱柱 Bio SEC Bio-Monolith PLRP-S PL-SAX PL-SCX Poroshell ZORBAX

3 生物柱选择指南 生物柱选择指南 生物治疗药物具有改善人类健康的巨大潜力 全世界已批准蛋白质和抗体治疗制剂数量持续增长, 因为这一类重要的治疗制剂能够应对不断增长的医疗需求 但是生物治疗药物的发现和开发具有一定的难度 您将面对各种挑战, 不仅需要了解最新的知识和技术进展, 还需要及时掌握随时变化的各种政府法规 关键是要迅速作出正确的决策 从疾病研究到 QA/QC 再到生产的每个阶段, 安捷伦都能帮助您做出正确选择, 将治疗产品成功推向市场 这不只是因为我们提供可靠的仪器和消耗品, 能为您提供准确 可重复的结果, 还因为我们全面了解生物制药的工作流程, 能够提供可无缝协同工作的一系列产品, 作为药物研究 发现和开发的有效动力, 推动生物制药候选药物的发展 由于蛋白质生物治疗药物具有很强的异质性, 我们需要采用多种色谱方法才能准确表征其活性药物成分 (API) 常用的方法包括用于二聚体和聚集体定量的体积排阻色谱法, 以及用于电荷异构体分析的离子交换色谱法 作为完全表征的一部分, 我们还必须考察蛋白质生物治疗药物的一级氨基酸序列以及在纯化或制剂步骤中序列可能发生的任何翻译后修饰 为了确保您在关键表征工作流程中实现完整 可重现且高质量的分析, 安捷伦提供多种色谱柱和备件 此完整全面的指南将帮助您选择最适用于您的表征工作流程的色谱柱 我们还针对方法开发 溶剂选择 流动相改性 优化给出了一些建议和提示, 并列举了许多分离实例, 所有这些都将为您选择色谱柱和开发方法提供帮助 安捷伦针对您的需求提供了完备的解决方案 包括采用无金属样品流路设计的 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元梯度液相色谱系统, 以及专为 UHPLC 应用 ( 包括使用安捷伦大孔径 ZORBAX 3Å StableBond 柱的应用 ) 提供最高分析速度 分离度和超高灵敏度的 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统 生物分子的结构可能非常复杂, 但使用安捷伦 HPLC 色谱柱 系统和备件可以大大简化其分析过程

4 生物柱选择指南 什么是生物分子? 生物分子是由生物体产生的化合物 其分子量范围可以从氨基酸和小分子脂类到大分子多聚核苷酸, 如 DNA 或 RNA 在本章中, 我们将探讨以下分离方法 : 蛋白质 用体积排阻色谱基于尺寸进行分离 用离子交换色谱基于电荷进行分离 用反相色谱基于疏水性进行分离 多肽 用于各种多肽 ( 包括所有尺寸的疏水 亲水 碱性和酸性多肽 ) 分析和纯化的生物色谱柱 另外, 还有适用于 HPLC 和 UHPLC 肽谱分析的色谱柱 DNA/RNA 寡核苷酸 反相和离子交换柱适合分离 DNA 和 RNA 寡核苷酸, 填料孔径满足所有尺寸寡核苷酸的分离需求, 从合成的小寡核苷酸到大的质粒 氨基酸 ZORBAX Eclipse 氨基酸分析 HPLC 色谱柱可为 24 种氨基酸的分析提供高效解决方案 一般情况下, 分析时间从 14 min( 使用 75 mm 色谱柱 ) 到 24 min( 使用 15 mm 色谱柱 ) 不等 重链 Fab 轻链 s s s s 糖基化位点 Fc 单克隆抗体 2

5 生物柱选择指南 什么是生物柱? 生物色谱柱 ( 或称生物柱 ) 是用于分离生物化合物 ( 如多肽和蛋白质 寡核苷酸和多聚核苷酸 ) 以及其他生物分子和复合物的液相色谱柱 生物柱专为生物分子分析而特别设计, 具有适合分析大分子的大孔径 填料设计上, 尽量减少填料与分析物之间的非特异性结合, 以提高回收率 分离机制的选择或为保留分析物的生物学功能 ( 在分析过程中不失去生物活性 ), 或有意使分析物变性以便对一级结构进行表征 安捷伦生物色谱柱产品可针对您的生物分子分析所采用的所有主要表征技术提供最佳解决方案 包括 : 滴度测定和纯化 : 采用 AdvanceBio Bio-Monolith Protein A 等独特技术进行滴度测定与细胞系优化 完整蛋白质与翻译后修饰 : 采用 AdvanceBio RP-mAb ZORBAX RRHD 3Å Poroshell 3 以及 AdvanceBio 肽谱分析柱等关键色谱技术, 可以显著提高从完整蛋白质到蛋白质片段等一级结构表征结果可信度 聚集体 :Agilent Bio SEC-3 和 Agilent Bio SEC-5 可准确测定聚集体 ( 二聚体 三聚体 四聚体等 ), 并能从大分子量蛋白质中分离小分子量赋形剂和杂质 电荷异构体分析 : 安捷伦离子交换色谱柱, 包括专为单克隆抗体分析而设计的优化填料, 如 Agilent Bio MAb 和用于精确异构体分析的 Agilent Bio IEX 糖基化表征 : 安捷伦亲水相互作用色谱 (HILIC) 柱可实现准确 重现性高的多糖与糖肽分析 特殊应用 : 包括采用 ZORBAX Eclipse AAA 色谱柱的稳定 高效的氨基酸分析解决方案以及 DNA/RNA 分析解决方案 BioHPLC 色谱柱 3

6 生物柱选择指南 AdvanceBio 安捷伦最近推出了用于蛋白质和 mab 表征的 AdvanceBio 系列产品 Agilent AdvanceBio 色谱柱旨在为提升单克隆抗体和其他完整蛋白质表征准确度和速度而设计, 包括聚集体 SEC 分析 电荷异构体 IEX 分析 完整质量数 一级结构和翻译后修饰 (PTM) 的反相色谱分析, 以及使用亲水相互作用色谱进行裂解糖链分析 本指南提供关于完整安捷伦生物色谱柱产品的详细信息, 以及有关选择 AdvanceBio 系列产品以准确表征生物治疗药物的信息 提示与工具 如需了解有关 AdvanceBio 系列色谱柱以及可满足您表征需求的各种工具的更多信息, 请访问 4

7 生物柱选择指南 液相柱选择流程图 以下流程图为您提供了各章选择指南的页码, 帮助您为您的生物分子分离应用选择最佳色谱柱 我们提供许多可参考的指南, 帮助您为生物分子的分离选择最佳色谱柱 首先要考虑的是生物分子的尺寸, 这将决定分离所用 HPLC 色谱柱填料的孔径 第二点要考虑的是待分离分子的溶解度 第三要关注的是分离机制 尺寸 疏水性和电荷 一级结构分析 反相色谱柱 参见第 32 页 电荷异构体分析 离子交换 (IEX) 参见第 71 页 单克隆抗体或其他蛋白质 聚集体和片段分析 体积排阻色谱 (SEC) 参见第 96 页 糖基化表征 亲水相互作用色谱 (HILIC) 参见第 115 页 滴度测定 ( 亲和 ) Protein A 参见第 125 页 蛋白质去除 多重亲和去除 (MARS) 参见第 129 页 BioHPLC 色谱柱 5

8 生物分子分离 生物分子分离 蛋白质分离 蛋白质是复杂的分子, 对其进行全面表征需要多种技术 蛋白质以三维结构存在, 这一结构决定了其生物活性 氨基酸链的序列决定了蛋白质的一级结构 一级结构中氨基酸之间的氢键使蛋白质形成了二级结构, 一般为 α 螺旋和 β 折叠 二级结构区域之间进一步发生一系列氢键 离子 疏水和二硫键相互作用, 即形成三级蛋白质结构, 或三维构象 如果蛋白质是由许多个氨基酸链组成的, 那么各链之间的相互作用即形成了四级结构 所以, 从图 1 可以清楚地看出, 要表征天然状态的蛋白质, 不能破坏其三级结构和四级结构 而当测定一级氨基酸序列时, 需要破坏其三维结构, 在蛋白质完全变性状态下进行分析 氨基酸 蛋白质一级结构为氨基酸序列 氢键 β 折叠 α 螺旋 蛋白质二级结构当氨基酸序列发生内部氢键连接时形成 氢键离子相互作用 β 折叠 α 螺旋 蛋白质三级结构当 α 螺旋和 β 折叠之间存在某种引力时即形成三级结构 疏水相互作用二硫桥 蛋白质四级结构是含有一条以上氨基酸链的蛋白质 图 1. 蛋白质多级结构示意图 6

9 生物分子分离 蛋白质所处的环境可以改变 稳定或破坏其结构 涉及的环境影响因素包括 ph 温度 盐浓度 水或有机溶剂的含量 对某些蛋白质来说, 还有起稳定作用的小分子或金属离子 蛋白质结构还可以因使用巯基还原剂打断二硫键, 或使用变性剂 ( 尿素或盐酸胍等 ) 而被破坏 除了内在的复杂性以及决定其三维结构的分子内相互作用, 蛋白质分子与其他分子之间, 以及它们的接触表面之间也存在分子间相互作用 这些相互作用可以导致蛋白复合物 聚集 ( 可能发生沉淀 ), 以及在 HPLC 柱或 HPLC 系统等的表面发生沉积现象 因此, 我们必须考虑蛋白质的处理方法和保存环境 蛋白质柱选择指南 应用技术安捷伦色谱柱备注 一级结构分析 UHPLC/HPLC 反相分离 AdvanceBio RP-mAb ZORBAX RRHD 3Å Poroshell 3Å ZORBAX 3Å AdvanceBio 肽谱分析 PLRP-S 反相分离需要 ( 或会引起 ) 蛋白质变性, 以获得关于氨基酸序列和 / 或氨基酸修饰 ( 包括翻译后修饰 ) 的详细信息 电荷异构体分析 离子交换分离 安捷伦 Bio IEX 色谱柱安捷伦 Bio MAb 色谱柱 PL-SAX 色谱柱 PL-SCX 色谱柱 聚集体和片段分析 体积排阻分离 Bio SEC-3 Bio SEC-5 ProSEC 3S ZORBAX GF 糖基化表征 亲水相互作用色谱 AdvanceBio 糖谱分析 ZORBAX RRHD 3 HILIC 滴度测定 亲和分离 AdvanceBio Bio-Monolith Protein A 蛋白质去除 亲和纯化 MARS Human-14 MARS Human-7 MARS Human-6 MARS Human-6 High Capacity MARS Human-2 MARS Human-1 MARS Mouse-3 各氨基酸的比例决定了蛋白质分子的静电荷 静电荷为零的 ph 值称为等电点 (pi) 当溶液 ph 低于 pi 时, 蛋白质带正电荷 ( 酸性 ), 当溶液 ph 高于 pi 时, 蛋白质带负电荷 ( 碱性 ) 对于离子交换分析, 我们建议洗脱剂 ph 至少高于或低于其 pi 一个 ph 单位 使用离子交换柱分析蛋白质, 需要使用缓冲流动相, 以及进行盐梯度洗脱或者 ph 梯度洗脱 蛋白质生物药物的聚集体形成是一个重要问题, 因为其可能引发免疫原性反应, 并影响最终制剂的组成 随着人们越来越重视免疫原性效果和生物治疗药物的安全性, 了解蛋白质和 mab 的糖基化和糖链结构变得尤为重要 由于 HILIC 色谱能够保留样品的亲水部分, 它能够提供反相色谱柱的正交信息 在投入高成本进行制备以及使用大量 Protein A 色谱填料之前, 若想要对细胞培养上清液的单克隆抗体滴度和产量进行监测, 需要通过小型 ( 分析型 ) 处理工序来确定单克隆抗体的滴度, 以便确定单克隆抗体产品的最佳采集时间 去除生物样品中的高丰度蛋白质 去除这些高丰度蛋白质有助于改善样品的后续 LC/MS 分析和电泳分析, 有效地扩展了动态范围 BioHPLC 色谱柱 7

10 生物分子分离 赫赛汀变体 IgG1 的高速 高分离度分离 色谱柱 : AdvanceBio RP-mAb C x 1 mm, 3.5 µm 流动相 : A:.1% TFA 溶于水 :IPA (98:2) B: IPA:ACN: 流动相 A (7:2:1) 流速 : 1. ml/min 梯度 : 柱温 : 8 C 检测器 : 样品 : 4 min 内 B 由 1% 升至 58%, 以 95% B 淋洗 1 min, 并以 1% B 重新平衡 1 min UV,254 nm mau min 内即可完成表征 mau µl 完整人源化重组赫赛汀变体 IgG1, 购自 Creative Biolabs (1 mg/ml) AdvanceBio RP-mAb C4 柱提供尖锐的峰形, 可在 2 min 内使分析物实现完美分离 氧化物的高分离度分离 色谱柱 : 流动相 : 流速 : ZORBAX RRHD 3SB-C x 5 mm, 1.8 µm A:.1% TFA B:.1% TFA + 8% 乙腈 1. ml/min mau 氧化胰岛素 B 链 氧化胰岛素 A 链 胰岛素 氧化胰岛素 B 链各亚型 梯度 : 33% 到 5% B, 到 4 分钟 检测器 : 129 Infinity LC, 带二极管阵列检测器, 检测波长 28 nm 样品 : 胰岛素 氧化胰岛素 A 链和 B 链 (BSA, 购自 Sigma-Aldrich,Corp.,1 mg/ml) min 显而易见, 使用安捷伦 ZORBAX RRHD 3SB-C x 5 mm,1.8 µm 色谱柱能够在两分钟内实现氧化胰岛素链与胰岛素的分离 8

11 生物分子分离 完整 Mab 单体和二聚体的分离 色谱柱 : Bio SEC-3, 3Å x 3 mm, 3 µm 缓冲液 : 15 mm 磷酸钠缓冲液,pH 7. 等度 : 缓冲液在 3 分钟时间内由 升至 1% 流速 : 样品 : 进样 : 5 µl 检测器 : 柱温 : 1. ml/min CHO- 人源化,5 mg/ml 完整 UV,22 nm 室温 mau 二聚体 单体 min VLC_MD_Mab 提示与工具 安捷伦深知您的分析工作极其繁杂且需要耗费大量人力 我们将助力您的分析 如需了解更多信息, 请参阅 BioPharma Workflow Solutions: How Agilent Helps Resolve Complex Analytical Challenges ( 生物制药工作流程解决方案 : 安捷伦如何助您应对复杂的分析挑战 ), 出版号 EN BioHPLC 色谱柱 9

12 生物分子分离 采用盐梯度分离人 IgG1 电荷异构体 色谱柱: Bio MAb, PEEK x 25 mm, 5 µm 流动相: A 1 mm Na2HPO4 ph 5.5 B A +.5 M NaCl 流速:.85 ml/min 梯度: B 在 - 25 min 内从 1% 升至 35% 检测器: UV 225 nm 样品 5 µl 1 mg/ml 的完整 IgG1 或羧基端消解的 IgG1 仪器 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱或 Agilent 11 系列液相色谱 完整 12 mau 1 消解 mau m in Lys Lys-2 Lys min 采用 Agilent Bio MAb 5 µm 色谱柱分离完整 IgG1 和羧基端消解的 IgG1 CHO 细胞上清液 IgG1 滴度的测定 色谱柱: Bio-Monolith Protein A x 4.95 mm, µm mau 35 3 流动相: A 5 mm 磷酸盐 ph 7.4 B 1 mm 柠檬酸 ph 2.8 流速: 1 ml/min 梯度 时间 (min) %B 结合 洗脱 再生 进样量 5 µl 检测器: UV 28 nm 馏分收集 基于时间 克隆 9 赫赛汀原研药物 25 键合 2 洗脱 再生 采用 AdvanceBio Bio-Monolith Protein A 色谱柱分析产曲妥珠单抗 CHO 克隆 克隆 9 和赫赛汀原研药物 用 5 mm ph 7.4 的磷酸钠稀释至.2 mg/ml 的 色谱图 请注意 采用磷酸盐缓冲液按 1:1 的比例稀释上清液 1 min

13 生物分子分离 超快速糖谱分析 采用 1.8 µm 填充颗粒 在 1 min 内即可完成分析 色谱柱: AdvanceBio 糖谱分析色谱柱 x 15 mm, 1.8 µm 仪器 配备 126 Infinity 荧光检测器 (FLD) 的 Agilent 129 Infinity 液相色谱 柱温 55 C 样品恒温箱 1 C 流动相: A 1 mm 甲酸铵 ph 4.5 B ACN FLD 激发 = 26 发射 = 43 进样量 2 µl 溶于 7:3 ACN:1 mm 甲酸铵 样品 安捷伦 2-AB 标记的人类 IgG N-连接糖链文库 部件号 LU 时间 %A %B 流速 (ml/min) AB 标记试剂 G GF GFB G1F G1F' G1FB G1FB Man6 G2 G2F G2FB G1FS1 A1 A1F A1FB A2 A2F A2FB 快速 高分离度的糖谱分析 1.8 µm 色谱柱 该标准品适用于所有 Agilent AdvanceBio 糖 谱分析色谱柱的测试 色谱峰 多糖 结构 色谱峰 多糖 min 结构 1 G 1 G2FB 岩藻糖 2 GF 11 G1FS1 半乳糖 3 GFB 12 A1 甘露糖 4 G1F 13 A1F N-乙酰氨基葡萄糖 5 G1F' 14 A1FB N-乙酰神经氨酸 6 G1FB 15 A2 7 G1FB Man6 16 A2F 8 G2 17 A2FB 9 G2F BioHPLC 色谱柱 11

14 生物分子分离 多肽分离肽谱分析 表征蛋白质需要进行肽谱分析 用于确认蛋白质的种类, 并鉴定和定量翻译后修饰 首先, 用酶 ( 如胰蛋白酶 ) 裂解纯化的蛋白质, 得到一系列多肽片段 酶的特异性裂解能够产生蛋白的特征性多肽指纹图谱 对多肽片段的鉴定可以进一步确认蛋白质的类型, 多肽裂解谱的变化可以用来鉴定蛋白生产或纯化过程中可能发生的翻译后修饰 反相 UHPLC/HPLC 结合 MS 或 UV 检测是分析多肽酶解物的首选技术 LC/MS 适用于多肽片段的鉴定以及序列覆盖率的测定, 而 LC/UV 则常被监测 /QC 部门用于肽谱的比较 在进行鉴定和定量分析时, 为达到足够的分离度, 应选用专门针对此类应用设计的色谱柱, 例如 AdvanceBio 肽谱分析,2.7 µm 色谱柱 多肽酶解物为复杂的混合物, 要完全覆盖酶解产物组分 ( 即分离所有多肽 ), 需要采用高效 / 高分离度的色谱柱 Agilent AdvanceBio 肽谱分析色谱柱专门针对翻译后修饰的鉴定和测定而设计 这些色谱柱让您能快速分离并鉴定一级序列中的氨基酸取代 / 修饰 采用安捷伦多肽混标进行的质量保证测试 色谱柱 : 流速 : 进样 : 3 µl 梯度 : 柱温 : 55 C 检测器 : 样品 : AdvanceBio 肽谱分析色谱柱 x 15 mm, 2.7 µm.5 ml/min A- 水 (.1% TFA),B-ACN (.1% TFA), -25 min 内 B 从 15% 升至 65%; min 内 B 从 65% 升至 95% 22 nm 安捷伦肽谱分析混标 ( 每种多肽.5-1. µg/µl) 部件号 舒缓肽片段 (1-7) 2. 舒缓肽醋酸盐 3. 血管紧张素 II 4. 神经降压素 5. 血管紧张素 I 6. 肾素 7. [Ace-F-3,-2 H-1] 血管紧张素 (1-14) 8. Ser/Thr 蛋白磷酸酶 (15-31) 9. [F14] Ser/Thr 蛋白磷酸酶 (15-31) 1. 二甲双胍 ( 蜂毒液 ) 用于测试每批 AdvanceBio 肽谱分析色谱柱填料的混标 该混标含 1 种分子量在 Da 范围内的亲水 疏水和碱性多肽 另外我们还采用小分子探针对每根色谱柱进行测试以确保其分析效率 12

15 生物分子分离 Agilent AdvanceBio 色谱柱 : 更快 一致性更好的生物制药分析 AdvanceBio 肽谱分析色谱柱是安捷伦不断壮大的顶尖生物色谱柱系列中的一员 该色谱 柱专为分离和表征多肽 蛋白质 抗体 偶合物 新生物体和生物制药而设计, 具有一 致 卓越的性能 AdvanceBio 色谱柱的科学设计能够提高结果的准确性和分析效率, 显 著提高您的实验室分析速度和工作效率 如需了解安捷伦肽谱分析解决方案的订购信息, 请转到第 56 页 BioHPLC 色谱柱 13

16 生物分子分离 DNA 和 RNA 寡核苷酸的分离 寡核苷酸又重新引起关注, 因为其应用越来越多, 包括潜在的治疗作用 其合成流程与较成熟的多肽合成流程相似, 即采用活性固相合成树脂, 通过不断添加特定核苷酸, 来构建所需要的序列 在 5 羟基端采用二甲氧基三苯甲烷 (DMT) 基团保护核苷酸, 目标核苷酸裂解后仍将带着这些保护基团 由于 DMT 具有疏水性, 我们可在第一阶段的分析中充分利用它的这一性质 为提高寡核苷酸的稳定性, 特别是对酶降解的稳定性, 我们可以对其进行化学改性, 例如用硫置换氧, 形成硫代磷酸酯 使用化学合成法生产生物分子时, 延长分子长度每个循环的偶联效率都不可能是 1% 从固相合成支持相上裂解下来的样品将包含缺失序列 ( 丢失了一个或几个残基的寡核苷酸 ), 以及一些由于双偶联或支链连接产生的更大的寡核苷酸 样品混合物非常复杂, 需要采用高效的技术进行分析 14

17 生物分子分离 寡核苷酸的分离通常使用三种 UHPLC/HPLC 技术 : Trityl-on: 这一步骤为从脱保护失败序列中分离仍带有 DMT 基团的全长目标寡核苷酸, 相对比较简单 得到的分析信息有限, 这一步一般认为是纯化方法 脱保护寡核苷酸的离子交换分离 : 该方法利用寡核苷酸骨架上的负电荷进行分离 较短寡核苷酸的分离度良好, 但分离度随链长增加而降低 使用水相洗脱液, 但寡核苷酸高度带电荷, 需要用高浓度盐从色谱柱上洗脱下来 去三苯甲基脱保护寡核苷酸的离子对反相色谱分离 : 这项技术使用有机溶剂和挥发性离子配对试剂, 适用于 LC/MS 采用高效填料时该技术的性能最佳 需要能使寡核苷酸完全变性, 且能防止其与互补序列结合的条件 因此, 该分离最好在较高温度下进行 提示与工具想了解科学家们是怎样利用安捷伦产品分离 RNA/DNA 寡核苷酸的吗? 请参阅 Denaturing reversed phase liquid chromatographic separation of non-coding ribonucleic acids on macro-porous polystyrene-divinylbenzene resins" Journal of Chromatography A, 1312 (213): 更多此类文献请参见附录 BioHPLC 色谱柱 15

18 生物分子分离 DNA 和 RNA 寡核苷酸色谱柱的选择 应用技术安捷伦色谱柱备注 Trityl-on/trityl-off 寡核苷酸 Trityl-on PLRP-S 5 µm 填料 基于疏水性差异进行分离 特别适合从 Trityl-off 寡核苷酸中分离 Trityl-on 寡核苷酸, 也可以用于反相离子对色谱分离脱保护的寡核苷酸 脱保护的寡核苷酸脱保护 ( 脱三苯甲基, Trityl-off) 寡核苷酸的离子对反相色谱分离 PLRP-S 3 µm 到 5 µm 脱保护的寡核苷酸 脱保护寡核苷酸的离子交换分离 PL-SAX 1Å 在变性高 ph 条件下分离脱保护寡核苷酸 聚合型填料上的季胺功能基实现了高 ph 下的离子交换分离, 改善了自补序列的色谱分离 提示与工具 更多信息可参考 : Agilent PLRP-S 1Å HPLC Columns and Media(Agilent PLRP-S 1Å 液相色谱柱和填料 ), 出版号 EN Agilent PL-SAX 1Å HPLC Columns and Media(Agilent PL-SAX 1Å 液相色谱柱和填料 ), 出版号 EN

19 生物分子分离 氨基酸分析 Agilent ZORBAX Eclipse AAA 高效色谱柱采用优化的改进方案分离氨基酸 在生产蛋白质的过程中, 我们需要监测细胞培养基, 确保其营养成分水平适当且处于营养平衡的状态, 这样才能保证产物蛋白质的正常表达 氨基酸是细胞培养基的重要组分, 因此在生产过程中我们必须对其进行监测和调整 反相色谱是氨基酸分析的主要技术 采用较短的 75 mm 色谱柱, 前一次进样到下一次进样间的总时间可缩短至 14 min( 其中分析时间 9 min), 而采用 15 mm 的色谱柱则为 24 min( 其中分析时间 18 min) 使用 Agilent 11/12 Infinity 液相色谱仪, 采用 OPA 和 FMOC 衍生化填料, 执行全自动化分析程序, 可获得卓越的灵敏度 ( 用二极管阵列或荧光检测器可达 5 至 5 pmol) 和可靠性 ZORBAX Eclipse AAA 柱的选择 应用内径 x 长度 (mm) 填料粒径 (µm) 分析型常规灵敏度 4.6 x 使用 FLD 可达到常规的分析灵敏度 高分离度 4.6 x 常规分析灵敏度 高通量 4.6 x 节省溶剂, 高灵敏度 高分离度 3. x BioHPLC 色谱柱 17

20 生物分子分离 氨基酸 H C 6 H 9 N 3 O 2 His D C 4 H 7 NO 4 Asp Histidine Aspartic Acid R C 6 H 14 N 4 O 2 Arg F C 9 H 11 NO 2 Phe A C 3 H 7 NO 2 Ala C C 3 H 7 NO 2 S Cys G C 2 H 5 NO 2 Gly Q C 5 H 1 N 2 O 3 Gln E C 5 H 9 NO 4 Glu Arginine Phenylalanine Alanine Cysteine Glycine Glutamine Glutamic Acid K C 6 H 14 N 2 O 2 Lys L C 6 H 13 NO 2 Leu M C 5 H 11 NO 2 S Met N C 4 H 8 N 2 O 3 Asn S C 3 H 7 NO 3 Ser Y C 9 H 11 NO 3 Tyr T C 4 H 9 NO 3 Thr Lysine Leucine Methionine Asparagine Serine Tyrosine Threonine I C 6 H 13 NO 2 Ile W C 11 H 12 N 2 O 2 Trp P C 5 H 9 NO 2 Pro V C 5 H 11 NO 2 Val Isoleucine Tryptophan Proline Valine 碱性非极性 ( 疏水性 ) 极性, 不带电荷 单字母氨基酸代码分子量 MW-H 2O 分子式 S C 3 H 7 NO 3 Ser 3 字母氨基酸代码 化学结构 酸性化合物 Serine 化学名称 18

21 方法开发指南 方法开发 一级结构分析方法 本节内容为一级结构分析色谱柱的选择策略, 为 mab 蛋白质和多肽的方法开发提供了一些关键细节 肽和多肽 MW <1 kda 蛋白质 MW >1 kda 还原 / 片段 MW <5 kda 单克隆抗体 完整 MW >15 kda 初始键合相 AdvanceBio 肽谱分析色谱柱 还可考虑 : ZORBAX 3Å StableBond C8 还可考虑 : AdvanceBio RP-mAb StableBond C8 还可考虑 : AdvanceBio RP-mAb C4 还可考虑 : ZORBAX 3Å StableBond C18 ZORBAX 3Å StableBond C18 ZORBAX 3Å StableBond C3 AdvanceBio RP-mAb C4 AdvanceBio RP-mAb 联苯柱 AdvanceBio RP-mAb StableBond C8 AdvanceBio RP-mAb 联苯柱 Poroshell 3 StableBond C18 Poroshell 3 StableBond C8 Poroshell 3 StableBond C3 ZORBAX 3Å 联苯柱 ZORBAX 3Å StableBond C8 ZORBAX 3Å StableBond C3 ZORBAX 3Å StableBond C18 Poroshell 3 StableBond C3 Poroshell 3 StableBond C8 初始分离条件 流动相 : A:95% H 2 O:5% ACN ( 含.1% TFA) B:5% H 2 O:95% ACN ( 含.85% TFA) 流动相 : A:95% H 2 O:5% ACN ( 含.1% TFA) B:5% H 2 O:95% ACN ( 含.85% TFA) 流动相 : A:1% H 2 O ( 含.1% TFA) B:1% H 2 O:1% ACN:8% n-pa( 含.8% TFA) 流动相 : A:98% H 2 O:2% IPA ( 含.1% TFA) B:1% H 2 O:2% ACN:7% IPA( 含.8% TFA) 梯度 : 3 min 内从 3% 升至 6% 温度 : 4 C 梯度 : 2 min 内从 5% 升至 7% 温度 : 8 C 梯度 : 1 min 内从 5% 升至 4% 温度 : 6 C 梯度 : 5 min 内 B 从 1% 升至 6% 温度 : 8 C 2.1 mm 内径色谱柱 4.6 mm 内径色谱柱 2.1 mm 内径色谱柱 4.6 mm 内径色谱柱 2.1 mm 内径色谱柱 4.6 mm 内径色谱柱 2.1 mm 内径色谱柱 4.6 mm 内径色谱柱 粒径 2.7 µm SPP 流速.5 ml/min 粒径 2.7 µm SPP 流速 2. ml/min 粒径 1.8 µm TPP 3.5 µm TPP 5 µm TPP 5 µm SPP 流速.5 ml/min.2 ml/min.2 ml/min 1. ml/min 粒径 3.5 µm TPP 5 µm TPP 流速 1. ml/min 1. ml/min 粒径 3.5 µm SPP 1.8 µm TPP 3.5 µm TPP 5 µm TPP 流速.8 ml/min.3 ml/min.2 ml/min.2 ml/min 粒径 3.5 µm SPP 3.5 µm TPP 5 µm TPP 流速 4. ml/min 1. ml/min 1. ml/min 粒径 3.5 µm SPP 5 µm SPP 流速 1. ml/min 粒径 3.5 µm SPP 流速 5. ml/min SPP = 表面多孔颗粒,TPP = 全多孔颗粒 BioHPLC 色谱柱 19

22 方法开发指南 从低 ph 简单水溶液 / 有机梯度开始一般采用含.1% 三氟乙酸 (TFA) 的水 : 乙腈梯度, 洗脱所有目标组分 3Å 孔径色谱柱的典型高分离度梯度分析需要 3-5 min, 而 AdvanceBio RP-mAb 色谱柱所需的分析时间更短, 采用的流速更高, 并且仍能达到出色的分离度 要改善分离度, 可以增加梯度时间 缩短柱长或提高流速 在 LC/MS 方法中, 采用 TFA 会降低检测器的灵敏度, 所以我们通常用甲酸铵 / 甲酸代替 TFA 优化样品溶解度在任何 ph 下, 完全溶解样品对于获得最佳峰形和回收率都是非常重要的 AdvanceBio RP-mAb ZORBAX 3Å StableBond Poroshell 3 StableBond 和 AdvanceBio 肽谱分析色谱柱可以使用强酸性或中性溶剂, 而 ZORBAX 3Extend-C18 和 Poroshell 3Extend-C18 色谱柱可以使用中性溶剂和稀碱 溶解蛋白质和多肽的溶剂选择 水 / 磷酸盐缓冲液稀酸 (TFA 乙酸或盐酸) 中性 ph 6-8 M 盐酸胍或异硫氰酸酯乙酸 5%/6 M 尿素稀酸 + 水溶液 / 有机溶剂 (ACE, MeOH, THF) 稀碱 ( 氢氧化铵 ) DMSO 或.1%-1% TFA 溶于 DMSO 甲酰胺 最弱 最强 提高温度 蛋白和多肽的分离受温度影响, 较高的柱温可以显著改善蛋白质和疏水性和聚集性多肽的分离度和回收率 AdvanceBio RP-mAb: 高达 9 C ZORBAX 3 StableBond Poroshell 3 StableBond: 高达 8 C AdvanceBio 肽谱分析色谱柱 : 高达 6 C 优化流动相 ph 如果低 ph 效果不佳, 可尝试中等或高 ph 如果优化的低 ph 方法不能提供理想的分离, 可以使用中等或高 ph 流动相 高 ph 下的选择性通常区别很大, 因为此时酸性氨基酸带负电荷, 而某些碱性氨基酸可能丢失其电荷 ZORBAX 3Extend-C18 是中等和高 ph 分离的良好选择 色谱柱 : ZORBAX 3Extend-C x 15 mm, 5 µm 梯度 : 温度 : 3 分钟内 5-6% B 25-3 C(<6 C) 流动相 : A:2 mm NH 4 OH 溶于 H 2 O B:2 mm NH 4 OH 溶于 8% ACN 流速 : 1 ml/min 2

23 方法开发指南 反相 LC/MS 方法 蛋白质和多肽的 LC/MS 分析可为我们提供蛋白质表征所需的信息, 让我们能够精确鉴定蛋白质的翻译后修饰, 以及确定合成和天然多肽的分子量 LC/MS 还可在蛋白质组学应用中用于鉴定二维分离的蛋白质 因此, 蛋白质和多肽的 LC/MS 分离是一个非常重要的分离领域, 此类分析需要采用特殊的色谱柱和流动相 LC/MS 分离通常使用小尺寸色谱柱, 并且一般不采用含 TFA 的流动相, 因为这种流动相添加剂会降低 MS 灵敏度 分析型 LC/MS 应用 当样品量足够时, 采用 2.1 mm 内径的色谱柱可以实现较高的灵敏度 若采用 Poroshell 柱, 则适合采用 1 mm 内径的色谱柱 高灵敏度 / 蛋白质组学应用毛细管色谱柱常用于高灵敏度的蛋白质和多肽应用.5 mm 内径的色谱柱适用于分离蛋白质和蛋白质酶解物, 而.3 mm 内径的色谱柱则最常用于分离蛋白质酶解物的色谱柱 这些色谱柱可以在高 ph 氢氧化铵流动相条件下进行分析 纳流柱 (.1 和.75 mm 内径 ) 常用于蛋白质组学二维 LC/MS 分析, 起始键合相通常选择 C18 BioHPLC 色谱柱 21

24 方法开发指南 电荷异构体分析方法 本节内容为电荷异构体分析色谱柱的选择策略, 为 mab 蛋白质或多肽的方法开发提供了一些关键细节 Bio MAb 色谱柱单克隆抗体 阳离子交换 (SCX, WCX) 单克隆抗体 蛋白质 多肽和糖蛋白 阴离子交换 (SAX, WAX) 寡核苷酸 蛋白质 推荐的初始条件 流动相 : A:2 mm 磷酸钠,pH 5.5 B: 缓冲液 A + 2 mm NaCl 梯度 : 5 分钟内 1-35% B 样品量 : 2 mg/ml,5 µl 进样温度 : 室温检测 : UV,22 nm 流动相 : A:2 mm 磷酸钠,pH 5. (WCX) 或 梯度 : 样品量 : 温度 : 室温 检测 : ph 6. (SCX) B: 缓冲液 A + 5 mm NaCl 5 mm 柱 3 min 内 B 从 1% 升至 1%(25 mm 柱 6 min) 2 mg/ml,5 µl 进样 UV,22/28 nm 流动相 : A:2 mm Tris-HCl,pH 8.5 B:A + 5 mm NaCl 梯度 : 5 mm 柱 3 min 内 B 从 1% 升至 1%(25 mm 柱 6 min) 样品量 : 2 mg/ml,5 µl 进样 温度 : 室温 检测 : UV,22/28 nm 根据色谱柱内径和粒径选择流速 2.1 mm 内径色谱柱 4.6 mm 内径色谱柱 粒径,µm 流速,mL/min 粒径,µm 流速,mL/min

25 方法开发指南 优化条件 某些分离可能需要使用特殊的缓冲液 离子强度 ph 和 / 或温度 离子强度需要一定离子强度以保持色谱柱功能 : 通常, 需要的最小盐浓度为 1-2 mm 但强度大于 2 mm 可以防止生物分子吸附到色谱柱上 常用的盐是钠和钾的氯化物和醋酸盐 洗脱时常用的盐浓度为 4-5 mm 注 : 一定不要用水单独冲洗色谱柱, 否则将导致背压明显升高 缓冲液和 ph 的选择缓冲液在分离条件优化中起着重要作用 抗体和许多生物分子的分离一般使用磷酸盐缓冲液 我们还推荐以下缓冲液 :MES Tris 和 ACES 缓冲液 使用 ph 的缓冲液,pH 通常可以调节 +/-.2 个单位 某些特殊蛋白可能需要更高的 ph (>ph 6.5) 可以用磷酸 醋酸 HCl 和 NaOH 来调节 ph 洗脱时也可以采用 ph 梯度 缓冲液和 ph 的选择对于阴离子交换, 建议使用 ph 的醋酸盐和磷酸盐缓冲液,pH 通常可以调节 +/-.2 个单位 某些特殊蛋白可能需要更高或更低 ph 的缓冲液 可以用磷酸 醋酸 HCl 和 NaOH 来调节 ph 洗脱时也可以采用 ph 梯度 有机溶剂 表面活性剂 添加剂 乙腈 乙醇 甲醇和其他类似溶剂最多可用到 5% 可以使用非离子型 阴离子型和两性离子型表面活性剂 不建议使用阳离子表面活性剂 有机溶剂 乙腈 乙醇 甲醇和其他类似溶剂最多可用到 5% 表面活性剂 添加剂 可以使用非离子型 阳离子型和两性离子型表面活性剂 不建议使用阴离子表面活性剂 柱温 安捷伦 Bio MAb 和 IEX 柱可在高达 8 C 的温度下保持稳定, 但许多蛋白质和生物大分子对热不稳定 在常规分离中使用高温之前, 一定要确定您样品的温度稳定性 BioHPLC 色谱柱 23

26 方法开发指南 电荷异构体分析方法 ( 使用安捷伦缓冲溶液顾问 ) 通过四元混合产生 ph 恒定的盐浓度梯度 纯化时通过四元混合产生 ph 恒定的盐浓度梯度 色谱柱 : 流动相 : 梯度 : 温度 : 进样量 : 样品 : 样品浓度 : 检测 : 仪器 : 盐浓度梯度 ( 请参阅应用简报 : CHCN) Agilent Bio WCX,4.6 x 25 mm,1 µm Agilent Bio WCX,4.6 x 25 mm,5 µm A: 水 B:1.6 M NaCl C:4. mm NaH 2 PO 4 D:4. mm Na 2 HPO 4 通过混合预先确定好比例的 C 和 D 组分, 配制出 ph 在所需范围内的 2 mm 缓冲溶液 - 2 min 内 B 从 升至 5% (ph 恒定, 例如 ph 6.) 2-25 min B 保持 5% min,b 降至 室温 1 µl 卵清蛋白 核糖核酸酶 A 细胞色素 C 溶菌酶 2 mg/ml( 溶于 2 mm 磷酸钠缓冲液, ph 6.) UV,22 nm Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱 推荐初始条件 色谱柱 : 流动相 : 梯度 : 温度 : 进样量 : 样品 : 样品浓度 : 检测 : 仪器 : ph 梯度 ( 请参阅应用简报 : CHCN) Agilent Bio MAb,4.6 x 25 mm,5 µm A: 水 B:1.6 M NaCl C:4. mm NaH 2 PO 4 D:4. mm Na 2 HPO 4 通过混合预先确定好比例的 C 和 D 组分, 配制出 ph 在所需范围内且具有特定离子强度的缓冲溶液 - 2 min 内 ph 从 6. 升至 min 内 NaCl 从 升至 8 mm 25-3 min 内 NaCl 保持 8 mm 室温 1 µl IgG 单克隆抗体 2 mg/ml( 溶于 2 mm 磷酸钠缓冲液, ph 6.) UV,22 nm 注 : 类似地, 上述方法也可应用于改良的安捷伦 WAX 和 SCX 色谱柱的分析 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱 根据色谱柱内径和粒径选择流速 2.1 mm 内径色谱柱 4.6 mm 内径色谱柱 粒径,µm 流速,mL/min 粒径,µm 流速,mL/min 注 : 从低流速和默认值开始, 然后缓慢提升到色谱柱的操作限值 24

27 方法开发指南 聚集体和片段分析方法 本节内容为聚集体分析色谱柱的选择策略, 为 mab 蛋白质或多肽的方法开发提供了一些关键细节 为肽 多肽和蛋白质的生物分子 聚集体基于分子体积的分离选择初始色谱柱和条件 肽 多肽 蛋白质 MW > kda 肽 多肽 蛋白质 MW >.1-1 kda 根据分子量范围和孔径选择色谱柱 安捷伦 Bio SEC-3 (3 µm) 孔径 分子量范围,kDa 1Å Å Å 安捷伦 Bio SEC-5 (5 µm) 孔径 分子量范围,kDa 1Å Å Å Å Å Å >1 推荐的初始分离条件 色谱柱 : 安捷伦 Bio SEC (3 µm 和 5 µm) 温度 : 推荐温度 1-3 C, 最高温度 8 C 流动相 : 梯度 : 15 mm 磷酸盐缓冲液,pH 7.* 15-6 min 等度洗脱 流速 : 4.6 mm 内径柱.1-.4 ml/min 7.8 mm 内径柱 ml/min 21.2 mm 内径柱 ml/min 样品量 : 总柱体积的 5% 可以使用高盐和低盐的其它水相缓冲液有关详细信息, 请参阅 : 采用 Agilent BioHPLC 体积排阻色谱柱, 快速可靠地分离蛋白质聚集体和降解产物, 出版号 CHCN BioHPLC 色谱柱 25

28 方法开发指南 得到初始色谱图后, 可能需要进行某些改变以改善分离度 保持蛋白质溶解性, 或降低样品与色谱柱填料之间的相互作用 流动相的离子强度可以向上或向下调整, 以获得最佳分离度,pH 值通常也可以调节 +/-.2 个单位 如果还需要进一步优化, 则应再把向上或向下调整的范围扩大 还可以改变温度或是添加有机溶剂 对于需要加盐的方案, 以下为常用缓冲液 : 1-15 mm 氯化钠溶于 5 mm 磷酸钠,pH mm 硫酸钠溶于 5 mm 磷酸钠,pH mm 尿素溶于 5 mm 磷酸钠,pH 7. 也可以采用其他类似的盐 ( 如 KCl) 和盐酸胍 ph 范围 : 可添加的有机溶剂包括 : 5-1% 乙醇 ( 或其他类似溶剂 ) 溶于 5 mm 磷酸钠, ph 7. 5% DMSO 溶于 5 mm 磷酸钠, ph 7. 我们还必须采取一定的措施以防止由于某些水相 / 有机溶剂混合物粘度过高而引起过大的压力变化 降低流速或增加温度可减少潜在的问题 柱温 : 通常,SEC 分离都是在 2-3 C 下进行 蛋白质和多肽的分离需要较高温度, 以改善蛋白质和疏水性多肽的分离度和回收率 Bio SEC 色谱柱的最高耐受温度是 8 C 26

29 方法开发指南 多糖及亲水性多肽 / 糖肽分析 多糖 MW <5 kda 糖肽和离亲水性多肽 MW <1 kda AdvanceBio 糖谱分析色谱柱,1.8 µm 适用于快速分离和高通量分析 初始键合相 AdvanceBio 糖谱分析色谱柱,2.7 µm 适用于高分离度分析,25 mm 柱长采用表面多孔填料, 可提高低压条件下的分离度 ZORBAX RRHD 3-HILIC 还可考虑 :AdvanceBio 糖谱分析色谱柱 流动相 : A:ACN B:1 mm 甲酸铵,pH 4.5 梯度 : 12 min 内 A 从 25% 升至 4% 温度 : 55 C 初始分离条件 流动相 : A:ACN B:1 mm 甲酸铵,pH 4.5 梯度 : 35 min 内 A 从 25% 升至 6% 温度 : 6 C 流动相 : A:ACN B:5 mm 甲酸铵,pH 4.5 梯度 : 15 min 内 A 从 95% 降至 % 温度 : 室温 规格 2.1 x 1 mm 2.1 x 15 mm 色谱柱 应用高通量分析速度与分离度 规格 2.1 x 1 mm 2.1 x 15 mm 2.1 x 25 mm 4.6 x 1 mm 4.6 x 15 mm 4.6 x 25 mm 色谱柱 应用 UHPLC 分析速度稳定的方法 UHPLC 分离度 HPLC 分析速度稳定的方法 HPLC 分离度 规格 2.1 x 5 mm 2.1 x 1 mm 色谱柱 应用速度分离度 BioHPLC 色谱柱 27

30 方法开发指南 滴度测定和细胞培养优化方法 Agilent Bio-Monolith Protein A 方法 色谱柱 : 流动相 : 梯度 : 流速 : 样品 : 进样量 : 温度 : 检测 : 推荐条件 Agilent Bio-Monolith Protein A( 部件号 ) A:5 mm 磷酸盐,pH 7.4; B:1 mm 柠檬酸,pH 2.8 mm 或 5 mm 乙酸,pH 2.6 时间 (min) %A %B 结合 洗脱 再平衡 1 ml/min IgG1 (1-2 mg/ml) 和含 IgG1( 总蛋白浓度最高可达 2 mg/ml) 的 CHO 细胞上清液 可变 (5 µl 针对含 IgG1 的 CHO 细胞培养物上清液的优化进样体积 ) 室温 UV,28 nm 注 : 可向流动相中添加氯化钠等其他盐类 ( 浓度最高可为 15 mm) 是否可添加超过该浓度的其他盐类, 需通过实验确定 提示与工具 安捷伦了解, 诸多因素都会影响 mab 和蛋白质分离的分离质量 为了帮助您获得最佳结果, 我们开发了一系列使用指南 更多信息, 请参见 最优化肽段表征的要点: 肽谱分析指南, 出版号 CHCN Ion-exchange chromatography for biomolecule analysis:a "How to" guide ( 用离子交换色谱分析生物分子 : 操作指南 ), 出版号 EN 使用体积排阻色谱法分析生物分子: 操作指南, 出版号 CHCN 有关上述内容的详细信息, 以及其他有助于您的表征分析的指南, 请访问 :

31 方法开发指南 高灵敏度毛细管柱方法 反相色谱法流动相选择策略 在 LC/MS 方法中, 色谱柱洗脱液将直接从色谱柱流向 MS 检测器, 因此流动相只能包含挥发性盐类和添加剂 并且为了达到最高灵敏度, 还必须避免离子抑制或副产物的形成 低 ph 中和高 ph 蛋白和多肽的 LC/MS 分离一般不采用 TFA, 因为它会抑制离子化并提高检测限 第一步我们通常采用.1-1% 的甲酸替代 TFA 醋酸( 浓度最高可为 1%) 也可以替代 TFA 作为流动相改性剂 在低 ph 条件下采用 TFA 作为流动相改性剂仍有可能获得最佳的分离结果, 但分离的灵敏度会降低 在某些情况下, 我们可以通过简单的在线脱盐 / 反离子交换方法, 采用另一种酸 ( 如丙酸 ) 对 TFA 进行柱后取代 蛋白质的鉴定通常不采用高 PH 条件, 但在高 ph 条件下, 采用 1-2 mm NH 4 OH 作为 流动相添加剂仍可进行 LC/MS 分析 BioHPLC 色谱柱 29

32 用于蛋白质鉴定和杂质分析的安捷伦仪器 用于蛋白质鉴定和杂质分析的安捷伦仪器 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱 : 蛋白质分离的最佳选择 唯一能提供无金属样品流路的 UHPLC 其他优势还包括 : 1% 生物惰性 不使用不锈钢 : 样品不会接触到金属表面可耐受 可耐受 ph 1 至的条件 ( 短时间可耐受 ph 14) 可在 2 M 盐和 8 M 尿素条件下操作 最新的毛细管技术 UHPLC 级分析性能 :6 bar 稳定易用 : 表面活性低, 耐腐蚀, 主动密封垫冲洗和四元缓冲液混合功能 非常适用于蛋白质鉴定 要得到最佳结果, 请与 AdvanceBio 肽谱分析色谱柱 Bio SEC-3 和 Bio IEX 1.7 µm 色谱柱 一同使用 Agilent 129 Infinity 二元液相色谱 : 我们应用范围最广泛 适应性最强的 UHPLC 系统 在 LC/UV 和 LC/MS 中具有最佳单位时间分离度 分散性 灵敏度 准确度和精度 与创新性的主动阻尼 微流混合和光流波导检测技术相结合, 可实现 : 高达 12 bar 和 5 ml/min 的 UHPLC 性能范围最快和最简便的方法转移 ( 使用 ISET, 安捷伦独特的智能系统模拟技术 ) 以 HPLC 的使用维护成本, 获得 UHPLC 的生产率适用于杂质分析 肽谱分析或超快速梯度要获得最佳结果, 请与 ZORBAX RRHD 3Å 1.8 µm 色谱柱一同使用 3

33 用于蛋白质鉴定和杂质分析的安捷伦仪器 Agilent 126 Infinity 二元液相色谱 : 将分析型 HPLC 的标准提升至 6 bar 8 Hz 高速检测器和最高 1 倍的灵敏度 1% HPLC 兼容性, 拥有 UHPLC 的功能, 加上 : 以 HPLC 的使用维护成本, 获得 UHPLC 的性能 支持液相色谱和液质联用色谱系统应用, 可使用任何窄径和标准内径分析柱 (2.1 到 4.6 mm 内径 ) 高压混合获得卓越的梯度准确度 适用于所有标准 UHPLC 应用 Agilent 129 Infinity 四元液相色谱 : 高性能与灵活性的结合 唯一具有二元泵准确性和精度的四元 UHPLC 系统 其他优势还包括 : 高达 12 bar 和 5 ml/min 的 UHPLC 性能范围 BlendAssist( 混合助手 ), 实现缓冲液和添加剂准确混合的最简便工具以 HPLC 的使用维护成本, 获得 UHPLC 的生产率适用于方法开发或含准确缓冲液混合功能的无人值守 (walk-up) 系统 如需了解这些先进系统的详细信息, 请访问 :agilent.com/chem/biohplc UHPLC/HPLC 31

34 一级结构分析 一级结构分析 准确测定氨基酸序列及翻译后修饰 s s s s 要完整表征一种蛋白质 ( 例如单克隆抗体 ), 需要考察其一级氨基酸序列以及其在制备过 程的纯化或制剂步骤中可能发生的所有序列翻译后修饰 此类分析需要变性条件, 所以 我们通常采用反相液相色谱技术 安捷伦提供行业内种类最多的大孔径 3Å,45Å 色谱柱, 以及孔径更大的反相 BioHPLC 柱, 并且所有这些色谱柱产品均由遍布全球的技术支持专家和应用化学家提供支持 这些色谱柱产品系列包括 和 5 µm 全多孔填料色谱柱, 适用于压力 4 到 12 bar 的色谱系统, 还包括三种不同的表面多孔填料色谱柱, 适用于较低压力下的 UHPLC 分离, 此外还有可应对极端分析条件的聚合物色谱柱 Agilent AdvanceBio RP-mAb 色谱柱 : 唯一针对 mab 表征而设计的反相色谱柱 通过 45Å 孔径 Poroshell 技术以及适合的键合相选择性, 可快速 高分离度地表征完整 mab 和 mab 片段 Agilent ZORBAX RRHD 3Å 1.8 µm 色谱柱 : 为完整蛋白质 蛋白质片段以及蛋白质酶解物的反相分离提供 UHPLC 分析性能, 在 12 bar 下性能稳定 Agilent ZORBAX 3Å 3.5 和 5 µm 色谱柱 : 采用全多孔填料, 适用于 HPLC 分离和制备级分离 ; 多种键合相还可扩展至 1.8 µm 填料 Agilent Poroshell 3 色谱柱 : 业内首款用于多肽和蛋白质快速分离的表面多孔小粒径填料柱 Agilent AdvanceBio 肽谱分析色谱柱 : 快速分离和鉴定一级结构中的氨基酸修饰 AdvanceBio 肽谱分析色谱柱采用 2.7 µm 填料, 具有 C18 官能团, 能够为碱性疏水性多肽的分离提供卓越的保留性能 分离度和峰形 Agilent PLRP-S 色谱柱 : 大孔聚合物填料可以在最宽的 ph 范围内进行 HPLC 分离 PLRP-S 柱具有 3 种宽孔径尺寸和 8 种填料粒径, 可以为多肽 蛋白质以及蛋白质复合体的分析以及制备分离提供最佳解决方案 32

35 一级结构分析 反相柱的选择 应用 安捷伦色谱柱 说明 单克隆抗体和 mab 片段 AdvanceBio RP-mAb C4 SB-C8 基于 Poroshell 技术, 采用该技术制造的表面多孔填料可降低扩散距离, 因此我们可使用更高的流速及更陡的梯度, 从而缩短分析时间 即使在 6 bar 系统上也不例外 45Å 孔径使大分子可与键合相完全接触, 确保最佳的色谱性能 联苯柱 专门针对单克隆抗体分离而设计的稳定键合固定相, 提供宽泛的选择性范围, 帮助您优化分离分析 AdvanceBio 完整蛋白质 单克隆抗体 mab 片段和多肽 ZORBAX 3Å, 1.8 µm RRHD 3SB-C18 柱 RRHD 3SB-C8 柱 RRHD 3SB-C3 柱 RRHD 3- 联苯柱 优化的填充工艺使其可耐压高达 12 bar, 因此适用于 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统 RRHD 1.8 µm 色谱柱有 5 和 1 mm 两种规格可选, 分别适用于最复杂样品的快速分离和高分离度 ( 真正的高分离度 ) 分离 StableBond C18 色谱柱是分离复杂的蛋白质及蛋白质酶解产物的理想选择 AdvanceBio ZORBAX 3Å, 3.5 和 5 µm 3SB-C18 3SB-C8 3SB-C3 3SB-CN ZORBAX 3Å Extend- C18 色谱柱 HPLC 系统的理想选择 StableBond C3 和 CN 柱特别适用于更大 疏水性更强的化合物 包含独特的双齿硅烷, 并结合双封端工艺, 可有效保护硅胶颗粒, 可使其在高 ph( 高达 ph 11.5) 条件下免于发生溶解 大分子完整蛋白质 Poroshell 3 色谱柱 5 µm Poroshell 填料及 3Å 孔径可实现完整蛋白质的快速 HPLC 3SB-C18 3SB-C8 3SB-C3 3Extend-C18 分离 AdvanceBio 蛋白质酶解物中的蛋白质 AdvanceBio 肽谱分析色谱柱 理想的 12Å 孔径, 可用于鉴定较宽分子量范围内的多肽 采用复杂的多肽混标进行了测试, 可确保色谱柱性能 独特的 Agilent Poroshell 技术可缩短分析时间并提高全多肽序列的分离度 AdvanceBio 多肽到 DNA PLRP-S 色谱柱 填料颗粒本身具有疏水性, 因此不需要烷基配体键合相即可进行反相分离 这也 小分子 / 合成 1Å 使得这些填料成为了不含硅醇和重金属离子的高重现性填料 重组多肽 / 蛋白质 3Å 大分子蛋白 1Å DNA/ 高速分离 4Å 氨基酸 ZORBAX Eclipse 氨基酸分析 (AAA) 柱 采用众所周知的 OPA 和 FMOC 柱前衍生化方法进行了针对氨基酸分析的测试 提供适用于 HPLC 和 UHPLC 的不同选择 UHPLC/HPLC 33

36 一级结构分析.25 µm 3. µm 3.5 µm AdvanceBio RP-mAb 更高的准确性度 : 大孔径 (45Å) 的表面多孔颗粒填料 (3.5 µm) 兼容所有液相色谱仪, 可提高 mab 分离度 速度更快 : 与填充相同尺寸的全多孔颗粒填料的色谱柱相比, 分析时间更短 灵活的方法开发 : 固定相范围 :SB-C8 C4 和联苯固定相 成本更低 : 稳定的 Poroshell 填充床和 2 µm 入口滤芯可防止入口堵塞, 从而延长色谱柱使用寿命 专注于应对单克隆抗体表征特有挑战的唯一反相色谱柱 AdvanceBio 完整和还原态单克隆抗体的分析是表征治疗性蛋白质以及了解其有效性与稳定性的重要测量手段 不良的色谱分离性能可能导致返工, 甚至影响表征的准确度 较长的分析时间会降低实验室通量, 还会由于不能及时提供表征结果而影响决策 为了解决这些问题, 安捷伦开发出一种新型反相色谱柱来优化完整和还原态 mab 分析的性能 Agilent AdvanceBio RP-mAb 色谱柱基于 Poroshell 技术, 具有独特的孔径与键合相工艺设计 提示与工具 有关单克隆抗体一级结构表征的更多信息, 请参阅 : Better Characterization of Biomolecules using Agilent AdvanceBio Reversed-Phase Columns ( 使用安捷伦 AdvanceBio 反相色谱柱优化生物分子的表征 ), 出版号 EN

37 一级结构分析 我们通常采用低流速和平缓的梯度以较慢的速度分离大分子物质 ( 例如多肽和蛋白质 ), 这是为了减少此类低扩散分析物可能发生的峰展宽现象 AdvanceBio RP-mAb 色谱柱采用了 Poroshell 技术, 其使用的表面多孔填料颗粒通过在 3. µm 的固体硅胶内核上涂覆仅.25 µm 的多孔硅胶薄层而制成 这种构造的填料颗粒可降低扩散距离, 因此我们可使用更高的流速和更陡的梯度, 甚至 6 bar 系统中也不例外 多孔硅胶薄层上直径达 45Å 的孔使得大分子的单克隆抗体可与键合相完全接触, 确保最佳的色谱性能 适用于单克隆抗体分离的稳定键合固定相, 其包括 C4 SB-C8 以及独特的联苯固定相, 可提供宽泛的选择性范围, 帮助您优化分离分析 Agilent AdvanceBio RP-mAb 色谱柱可实现更高的分离度与更短的运行时间, 从而为生物制药发现 开发和 QA/QC 应用提供快速 准确 可重现的单克隆抗体分析结果 色谱柱性能指标 键合相孔径温度限 * ph 范围 * 封端 AdvanceBio RP-mAb C4 色谱柱 45Å 9 C 是 AdvanceBio RP-mAb SB-C8 45Å 9 C 否 AdvanceBio RP-mAb 联苯柱 45Å 9 C 是 以上指标只代表典型仪器性能指标值 * 该色谱柱专为低 ph 条件下的应用而设计 所有硅胶基色谱柱在 ph 6-8 条件下, 采用 < 4 C 的柱温和较低的缓冲液浓度 (.1-.2 M), 可获得最高的柱稳定性 UHPLC/HPLC 35

38 一级结构分析 赫赛汀变体 IgG1 的高速 高分离度分离 色谱柱 : AdvanceBio RP-mAb C x 1 mm, 3.5 µm 流动相 : A:.1% TFA 溶于水 :IPA (98:2) B:IPA:ACN: 流动相 A (7:2:1) 流速 : 1. ml/min 梯度 : 4 min 内 B 由 1% 升至 58%, 以 95% B 淋洗 1 min, 并以 1% B 重新平衡 1 min 柱温 : 8 C 检测器 : 样品 : UV,254 nm 5 µl 完整人源化重组赫赛汀变体 IgG1, 购自 Creative Biolabs (1 mg/ml) 2 min 内即可完成表征 AdvanceBio RP-mAb C4 柱提供尖锐的峰形, 可在 2 min 内使分析物实现完美分离 36

39 一级结构分析 完整人源化重组赫赛汀 IgG1 的分离 色谱柱 : AdvanceBio RP-mAb C x 1 mm, 3.5 µm 流动相 : A: 含.1% TFA 的水 : 异丙醇 (98:2) B:IPA:ACN: 流动相 A (7:2:1) 流速 : 1. ml/min 梯度 : 4 min 内 B 由 1% 升至 58%, 以 95% B 淋洗 1 min, 并以 1% B 重新平衡 1 min 柱温 : 8 C 检测器 : 样品 : UV,254 nm 5 µl 完整人源化重组赫赛汀变体 IgG1, 购自 Creative Biolabs (1 mg/ml) mau 1 mau 1 mau 1 mau 1 优于其他蛋白质色谱柱 AdvanceBio RP-mAb C4 色谱柱 min 其他制造商的 C4 色谱柱,4Å, 3.4 µm min 其他制造商的 C4 色谱柱,2Å, 3.6 µm min 其他制造商的 C4 色谱柱,3Å, 2.6 µm min AdvanceBio RP-mAb 专为分离 mab 而设计, 其分离完整蛋白质的峰形和分离度均优于其他色谱柱 选择性联苯固定相色谱柱 : AdvanceBio RP-mAb 联苯柱 x 1 mm, 3.5 µm 流动相 : A: 含.1% TFA 的水溶液 :IPA (98:2) B:IPA:ACN: 流动相 A (7:2:1) 流速 : 1. ml/min 梯度 : 4 min 内 B 由 1% 升至 58%, 以 95% B 淋洗 1 min, 并以 1% B 重新平衡 1 min 柱温 : 8 C mau 分离更完全 检测器 : UV,254 nm -2 样品 : 5 µl 完整人源化重组赫赛汀变体 IgG1, 购自 Creative Biolabs (1 mg/ml) min 具有卓越选择性的 AdvanceBio RP-mAb 联苯柱可提供更为完全的分离 UHPLC/HPLC 37

40 一级结构分析 Poroshell 的优势 色谱柱 : 流动相 : 流速 : AdvanceBio RP-mAb SB-C x 1 mm, 3.5 µm A:.1% TFA 的水溶液 B: 正丙醇 : 乙腈 : 流动相 A (8:1:1).8 ml/min 梯度 : 5 min 内 B 由 5% 升至 4%, 以 95% B 淋洗 1 min, 并以 1% B 重新平衡 1 min 柱温 : 6 C 检测器 : 样品 : UV,22 nm 1 µl Fc/Fab, 由木瓜蛋白酶水解购自 Creative Biolabs 的人源化重组赫赛汀变体 IgG1 (2 mg/ml) 得到 mau 高准确性, 低背压柱压 :55 bar min 采用大孔径 Poroshell 技术的 AdvanceBio RP-mAb 色谱柱不仅柱效高 分析时间短 压力低, 而且温度也低于多数反相方法的一般温度 (8 C) AdvanceBio RP-mAb 粒径 (mm) 填料粒径 (µm) AdvanceBio RP-mAb C4 色谱柱 USP L26 AdvanceBio RP-mAb SB-C8 色谱柱 USP L7 AdvanceBio RP-mAb 联苯色谱柱 USP L x x x x x x x

41 一级结构分析 ZORBAX 3Å StableBond 空间位阻的 3StableBond 键合固定相 Agilent ZORBAX 3A StableBond 色谱柱是进行蛋白质和多肽的高重现性分离的理想之选, 其原因主要有两点 首先, 要高效地分离蛋白质和多肽 ( 或其他大分子 ), 必须使用大孔径的 3Å 色谱柱, 因为这样才能使这些分析物与键合相充分接触 第二, 3StableBond 柱对低 ph 条件具有无可比拟的耐受性, 如蛋白质和多肽分离中常用的含 TFA 的流动相 对于低 ph 条件下的 LC/MS 分离,3StableBond 色谱柱还可以使用甲酸和乙酸流动相改性剂 这类色谱柱有五种不同键合相可供选择 (C18 C8 C3 CN 和联苯 (DP)), 用于优化蛋白质和多肽分析的选择性与回收率 为了进一步提高样品回收率并改进难复杂蛋白质的分离效率,3StableBond 柱可以在高达 8 C 的温度下使用 StableBond 3SB-C18 和 3SB-C8 柱是分离复杂的蛋白质及蛋白质酶解产物的理想选择 这些色谱柱有毛细管柱 (.3 和.5 mm 内径 ) 和纳流柱 (.75 和.1 mm 内径 ) 规格, 适用于蛋白质酶解产物的反相 LC/MS 分离 毛细管柱和纳流柱既可以用于一维又可以用于二维蛋白质组学分离 UHPLC 色谱柱性能指标 AdvanceBio 键合相孔径温度上限 * ph 范围 * 封端 ZORBAX RRHD 3SB-C18 柱 3Å 9 C 无 ZORBAX RRHD 3SB-C8 色谱柱 3Å 8 C 无 ZORBAX RRHD 3SB-C3 色谱柱 3Å 8 C 无 ZORBAX RRHD 3- 联苯柱 3Å 8 C 有 ZORBAX 3SB-C18 3Å 9 C 无 ZORBAX 3SB-C8 3Å 8 C 无 ZORBAX 3SB-C3 3Å 8 C 无 ZORBAX 3SB-CN 3Å 8 C 无 指标只代表一般意义上的典型值 *3StableBond 柱专为低 ph 条件下的应用而设计 所有硅胶基色谱柱在 ph 6-8 条件下, 采用 <4 C 的柱温和较低的缓冲液浓度 (.1-.2 M), 可获得最高的柱稳定性 而在中等或高 ph 条件下, 我们推荐您使用 3Extend-C18 色谱柱 UHPLC/HPLC 39

42 一级结构分析 完整单克隆抗体的更高分离度 色谱柱 : 流动相 : 流速 : 梯度 : 柱温 : 8 C ZORBAX RRHD 3SB-C8 柱 x 5 mm, 1.8 µm A: 水 :IPA (98:2) +.1% TFA (v/v) B:IPA:ACN:H 2 O (7:2:1) +.1% TFA (v/v) 在.5 ml/min 和 1. ml/min 之间 多段线性洗脱 检测器 : 129 Infinity 液相色谱系统, 配备自动进样器 (ALS) 二元泵 柱温箱, 以及二极管阵列检测器 (DAD) 检测 : UV,225 nm mau 梯度 A.5 ml/min 优化的分离度 1 5 肩峰 已分离 min mau mau 梯度 B 1. ml/min 25 更高的灵敏度 6 高速分析时间 min 放大图 min 提示与工具 如需了解更多有关使用安捷伦 AdvanceBio 反相色谱柱优化生物分子表征的信息, 请参阅有关该内 容的白皮书 ( 出版号 EN) 提示与工具 蛋白质和多肽分离常用的流动相通常添加 TFA( 或其他酸 ) 形成极低 ph 值, 以溶解蛋白质 StableBond 柱在这种条件下具有极高的柱寿命 可提供 3Å 孔径柱, 适用于高达 1-5 kda 的蛋白质分离 4

43 一级结构分析 还原及烷基化 mab 分离轻链和重链异构体 色谱柱 : 流动相 : 流速 : 梯度 : ZORBAX RRHD 3SB-C8 柱 x 1 mm, 1.8 µm A: 水 +.1% TFA (v/v) B: 正丙醇 :ACN:H 2 O (8:1:1) +.1% TFA (v/v).5 ml/min 多片段 % 溶剂 B 时间 (min) 进样 : 3 µl( 来自 2.5 mg/ml 样品 ) 柱温 : 75 C 检测器 : 仪器 : UV,225 nm Agilent 129 Infinity 液相色谱系统, 配备自动进样器 (ALS) 二元泵 柱温箱, 以及二极管阵列检测器 (DAD) 为了连续进行色谱分析, 增加了 2 分钟的后运行程序对色谱柱进行再平衡 mau HC LC 15 HC1 1 LC 片段 min 更高的单克隆抗体分析重现性 色谱柱 : 流动相 : 流速 : ZORBAX RRHD 3SB-C8 柱 x 5 mm, 1.8 µm A: 水 :IPA (98:2),.1% TFA B:IPA:ACN:H 2 O (7:2:1),.1% TFA 1. ml/min 柱温 : 8 C 检测器 : 129 Infinity LC, 带二极管阵列检测器, 检测波长 225 nm 样品 : mab ma ma 7 第 1 次进样 第 15 次进样 min 15 次进样前后色谱柱空白运行叠加色谱图 bar 75 梯度 5 压力时间 ( 分钟 ) % 溶剂 B 梯度清洗和 再平衡区域 UV min 5 25 安捷伦 ZORBAX 3SB-C8 柱的优异重现性和蛋白回收率 UHPLC/HPLC 41

44 一级结构分析 针对 mab 的表征分析为您提供多种具有独特选择 性的色谱柱产品 色谱柱 : ZORBAX RRHD 3SB-C x 1 mm, 1.8 µm ZORBAX RRHD 3SB-C3 色谱柱 x 1 mm, 1.8 µm ZORBAX RRHD 3SB-C8 柱 x 1 mm, 1.8 µm ZORBAX RRHD 3- 联苯柱 x 1 mm, 1.8 µm 流动相 : 流速 : 梯度 : 柱温 : 8 C 检测器 : A: 水 (.1% TFA) (v/v) B:8% npa:1% ACN:1% H 2 O (.8% TFA) (v/v) 1. ml/min (3.5 µm*),1. ml/min (1.8 µm) 25-35% B,9% 清洗 UV,215 nm 进样量 : 3 µl( 来自 2.5 mg/ml 样品 ) * 低流速将导致峰变宽 DAD1 A, Sig=21,4 Ref=off (Z:\CHEM32\1\DATA\IGG2_\19.D) DAD1 A, Sig=21,4 Ref=off (Z:\CHEM32\1\DATA\IGG2_\34.D) Fc Fab SB-C DAD1 A, Sig=21,4 Ref=off (Z:\CHEM32\1\DATA\IGG2_\25.D) SB-C DAD1 A, Sig=21,4 Ref=off (Z:\CHEM32\1\DATA\IGG2_\38.D) SB-C 联苯

45 一级结构分析 多肽 / 蛋白质 : 温度升高的影响 色谱柱 : 流动相 : 流速 : 梯度 : ZORBAX 3SB-C x 15 mm, 5 µm A:5:95 乙腈 : 水, 含.1% TFA (v/v%) B:95:5 乙腈 : 水, 含.85% TFA (v/v%) 1. ml/min 2 min 内由 15% 升至 53%, 后运行时间 12 min 室温 45ºC , 5 1. 亮氨酸脑啡肽 2. 血管紧张素 II 3. 核糖核酸酶 A 4. 牛胰岛素 (BOV) 5. 细胞色素 C 6. 溶菌酶 7. 肌红蛋白 8. 碳酸酐酶 柱温 : 室温 - 6 C 检测器 : 样品 : UV,215 nm 多肽 35ºC 4 5 6ºC (min) (min) LCBP26 短链 ZORBAX 3SB-C3 填料在低 ph 和高温下 稳定 色谱柱 : ZORBAX 3SB-C x 15 mm, 5 µm 流动相 : 梯度 8 min 内 B 从 % 升至 1% A:.5% TFA 水溶液 B:.5% TFA 的乙腈溶液, 等度保留测试条件 : 1- 苯基庚烷 5% A,5% B 流速 : 1. ml/min 柱温 : 6 C 苯基庚烷剩余 % k ZORBAX 3 SB-C3 竞争厂商 C4 柱 4 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 流动相体积 (ml) LCSB5 UHPLC/HPLC 43

46 一级结构分析 四种不同的 3SB 键合固定相优化了大分子多肽 的分离 A 柱 : B 柱 : C 柱 : D 柱 : ZORBAX RRHD 3SB-C x 15 mm, 5 µm ZORBAX 3SB-C x 15 mm, 5 µm ZORBAX 3SB-C x 15 mm, 5 µm ZORBAX 3SB-CN x 15 mm, 5 µm 流动相 : 线性梯度,4 min 内 B 由 25% 升至 7% A:.1% TFA 水溶液 B: 含.9% TFA 的 8% 乙腈 :2% 水 A B C , , 核糖核酸酶 2. 胰岛素 3. 细胞色素 C 4. 溶菌酶 5. 小清蛋白 6. CDR 7. 肌红蛋白 8. 碳酸酐酶 9. S-1β 1. S-1α 流速 : 1. ml/min 柱温 : 6 C D 样品 : 每种蛋白质各 3 µg 3SB-C18 C8 C3 和 CN 键合固定相均为该组多肽提供了不同的分离 这为快速优化蛋白质分离增加了一个重要的参数 3SB-CN 色谱柱对亲水性较强的多肽提供独特选择性 (min) LCSB6 提示与工具 Agilent 129 Infinity LC 提供更快速的结果和更高的数据质量 确保在更短时间内作出更明智的决策 效率的提高使您更具竞争优势, 并获得更高的投资回报 亲自计算采用 129 Infinity 技术可以节省多少经费 在线方法转移工具和经费节省计算器, 帮助您转移您的 HPLC 方法, 以及计算您节省的经费, 请访问

47 一级结构分析 ZORBAX 3Å StableBond 标志 说明 规格 (mm) 填料粒径 (µm) 3SB-C18 USP L1 3SB-C8 USP L7 3SB-CN USP L1 3SB-C3 USP L56 3-Diphenyl USP L11 标准色谱柱 ( 无需配卡套 ) 半制备柱 9.4 x 分析柱 4.6 x 分析柱 4.6 x 分析柱 4.6 x 快速分离柱 4.6 x 快速分离柱 4.6 x 快速分离柱 4.6 x 增强型溶剂节省柱 3. x 增强型溶剂节省柱 3. x 窄径柱 2.1 x 窄径柱 2.1 x 快速分离窄径柱 2.1 x 快速分离窄径柱 2.1 x 快速分离窄径柱 2.1 x 窄径 Bore RRHD 2.1 x 窄径 RRHD 柱 2.1 x 微径柱 1. x 快速分离微径柱 1. x 快速分离微径柱 1. x 微径保护柱,3/ 包 1. x 保护柱芯,2/ 包 9.4 x 保护柱芯,4/ 包 4.6 x 保护柱芯,4/ 包 2.1 x 保护柱卡套 保护柱卡套 ( 接转下页 ) AdvanceBio 提示与工具 我们为您提供您所需的信息和工具, 助您将您的安捷伦仪器性能发挥至极致, 获得这些重要的生物制药资源, 请访问 : UHPLC/HPLC 45

48 一级结构分析 ZORBAX 3Å StableBond 标志说明规格 (mm) 填料粒径 (µm) PrepHT 卡套柱 ( 需要柱接头 ) 玻璃内衬毛细管柱 PrepHT 卡套柱 21.2 x PrepHT 卡套柱 21.2 x PrepHT 卡套柱 21.2 x PrepHT 卡套柱 21.2 x PrepHT 卡套柱 21.2 x PrepHT 柱端接头, 2/ 包 PrepHT 保护柱芯, 2/ 包 3SB-C18 USP L x 7, 保护柱卡套 毛细管柱.5 x 毛细管柱.5 x 毛细管柱.5 x 快速分离毛细管柱.5 x 快速分离毛细管柱.5 x 毛细管柱.3 x 毛细管柱.3 x 毛细管柱.3 x SB-C8 USP L7 快速分离毛细管柱.3 x 快速分离毛细管柱.3 x 快速分离毛细管柱.3 x 快速分离毛细管柱.3 x 纳流 (Nano) 色谱柱 (PEEK 熔融石英 ) 快速分离纳流柱,1 x 快速分离纳流柱.75 x 快速分离纳流柱.75 x 富集 / 保护柱,5/ 包.3 x 富集 / 保护柱卡套 SB-CN USP L1 3SB-C3 USP L56 3-Diphenyl USP L

49 一级结构分析 ZORBAX 3Å Extend-C18 在高和低 ph(ph ) 条件下, 稳定分离多肽 在高和低 ph 条件下, 可能具有不同的选择性 在高 ph 条件下, 柱效高并可良好地回收疏水性多肽 使用氢氧化铵 ( 改性的流动相 ) 的 LC/MS 的理想选择 Extend-C18 键合相采用的创新双齿 C18-C18 键 ZORBAX 3Extend C-18 是一种大孔径 HPLC 柱, 可以在 ph 范围内高效分离多肽 独特的 双齿键合固定相保证了色谱柱在高和低 ph 的条件下具有较长的使用寿命和出色的重现性 在高 ph 条件下, 由于分子电荷的变化, 导致多肽的保留和选择性发生显著变化 在室温和高 ph 条件下, 疏水性较强的多肽可以实现优异的回收率 在高 ph 条件下, 使用简单的含氢氧化铵的流动相还可以提高 LC/MS 分析多肽的灵敏度 UHPLC 色谱柱性能指标 键合相 孔径 温度上限 * ph 范围 封端 ZORBAX 3Å Extend-C18 色谱柱 3Å 6 C 双封端 指标只代表一般意义上的典型值 * 温度上限在 ph 8 以下时为 6 C,pH 时为 4 C 提示与工具 选择正确的色谱柱仅仅是总体解决方案中的一部分 不要忘记那些重要的消耗品, 如我们广泛的液相色谱灯 UHPLC/HPLC 47

50 一级结构分析 血管紧张素的 LC/MS 分析 色谱柱 : ZORBAX Extend-C x 15 mm, 5 µm 流动相 : 酸性条件 : A:.1% TFA 水溶液 B:.85% TFA 的 8% 乙腈 (ACN) 溶液碱性条件 : A:1 mm 氢氧化铵的水溶液 B:1 mm 氢氧化铵的 8% 乙腈溶液 流速 :.2 ml/min 梯度 : 柱温 : 35 C MS 条件 : 样品 : 15 分钟内 15-5% B 正离子 ESI;Vf 7 V,Vcap 4.5 kv, N 2,35 psi,12 L/min,325 C 血管紧张素 I II III,2.5 µl 样品 ( 每个样品 5 pmol) A: 血管紧张素 I 最大 :1889 低 ph TIC (2-15 m/z) 5.E6 4.E6 3.E6 2.E6 1.E6 AII + AIII AI (min) 5 1 m/z B: 血管紧张素 I 最大 : 高 ph TIC (2-15 m/z) 5.E7 4.E7 3.E7 2.E7 1.E AII AI AIII (min) m/z LC33 小分子肽和大分子肽在高 ph 和低 ph 条件下都显示出了选择性的变化 在高 ph 下, 由于电荷发生了改变, 所有三种血管紧张素都得以分离 此外, 在高 ph 下使用氢氧化铵流动相可以显著提高血管紧张素 I 的图谱清晰度 Extend-C18 柱也可用于在高 ph 条件下分析小分子肽 参考文献 :B.E. Boyes. Separation and Analysis of Peptides at High ph Using RP-HPLC/ESI-MS, 4th WCBP, San Francisco, CA Jan

51 一级结构分析 高 ph 条件下使用寿命更长 色谱柱 : ZORBAX Extend-C x 15 mm, 5 µm 流动相 : 2% 2 mm 氢氧化铵,pH 1.5 8% 甲醇流速 : 1.5 ml/min 柱温 : 老化 24 C 测试 4 C k 值 氯 -1- 硝基苯 曲米帕明 每 1 倍柱体积大约相当于一个工作月的使用量 流动相柱体积 LC31 利用 ZORBAX Extend-C18 在高 ph 条件下更改选择性 色谱柱 : 流动相 : 流速 : ZORBAX Extend-C x 15 mm, 5 µm A:.1% TFA 水溶液 B: 含.85% TFA 的 8% 乙腈溶液 A:2 mm 氢氧化铵的水溶液 B:2 mm 氢氧化铵的 8% 乙腈溶液.25 ml/min 梯度 : 2 min 内由 5% 升至 6% 柱温 : 25 C MS 条件 : 正离子 ESI;Vf 7 V,Vcap 4.5 kv, N 2,35 psi,12 L/min,3 C 4 µl( 每种多肽 5 ng) Extend 柱可用于高 ph 条件下多肽的分离 在高 ph 和低 ph 条件下, 选择性差异很大 只需改变 ph, 即可开发互补的方法, 用以判断是否所有峰都得到了分离 Extend 柱可以在高 ph 和低 ph 条件下使用, 因此使用一根色谱柱就可开发互补的分离方法 该样品在高 ph 下还获得了更高的质谱灵敏度 A 3E7 2.5E7 2E7 1.5E7 1E7 LLL-NH 2 LLL LHG.5E7 LHL LLVF B 3E7 LLL-NH 2 LLL 2.5E7 2E7 LHG LLVF 1.5E7 LHL 1E7.5E (min) LCBP17 UHPLC/HPLC 49

52 一级结构分析 ZORBAX 3Å Extend-C18 标志 说明 规格 (mm) 填料粒径 (µm) 部件号 分析柱 4.6 x 玻璃内衬毛细管柱 分析柱 4.6 x 快速分离柱 4.6 x 快速分离柱 4.6 x 快速分离柱 4.6 x 快速分离窄径柱 2.1 x 快速分离窄径柱 2.1 x 快速分离窄径柱 2.1 x 保护柱芯,4/ 包 4.6 x 保护柱芯,4/ 包 2.1 x 保护柱卡套 快速分离毛细管柱.3 x 快速分离毛细管柱.3 x 快速分离毛细管柱.3 x 快速分离毛细管柱.3 x 提示与工具 保护柱和过滤器有助于保护色谱柱和仪器不受颗粒的影响, 后者可能造成堵塞, 使系统压力增高并影响系统性能, 从而影响您的日常工作流程 安捷伦最新的快速保护柱可保护您的 UHPLC 色谱柱及生物液相色谱柱, 延长色谱柱使用寿命, 将工作流程所受的影响降至最低 如需了解更多信息, 请访问 : 5

53 一级结构分析 Poroshell 3 AdvanceBio 表面多孔的填料可实现生物分子的高速分离 3Å 的孔径能够为分子量高达 1 kda 的蛋白质提供高分离效率及高回收率 实心核,4.5 µm 直径 采用 Poroshell 3SB 可延长低 ph 条件下的色谱柱使用寿命 ; 采用 3Extend-C18 则能够延长高 ph 条件下的色谱柱使用寿命 提供四种不同的键合相 (3SB-C18 3SB-C8 3SB-C3 和 3Extend-C18) 供您选择, 以优化您的分析回收率和选择性 多孔壳,.25 µm 厚 Agilent Poroshell 3 柱非常适用于蛋白和多肽的快速分离, 因为其直径为 5 µm 的表面多孔填料允许采用较快的流速, 同时保持尖锐峰形和高柱效 采用 StableBond 键合相的 Poroshell 柱能够在以 TFA 和甲酸为流动相的分析中提供出色的稳定性和选择性 Poroshell 3Extend-C18 柱可在 ph 2-11 条件下进行独特的分离 这类色谱柱还可用于分析型蛋白质分离以及 LC/MS 分离 我们通常采用低流速和平缓的梯度以较慢的速度分离多肽和蛋白质, 这是为了减少此类低扩散分析物可能发生的峰展宽现象 Poroshell 色谱柱采用表面多孔填料颗粒, 通过在固体硅胶内核上涂覆.25 µm 的多孔硅胶薄层而制成 这可降低蛋白质的扩散距离, 从而能在 4/6 bar HPLC 系统 ( 包括 Agilent 126 Inifinity 生物惰性四元液相色谱系统 ) 中实现分子量高达 5-1 kda 的蛋白质的快速 HPLC 分离 UHPLC 色谱柱性能指标 Poroshell 3 柱 键合相 孔径 温度上限 * ph 范围 封端 Poroshell 3SB-C18, C8, C3 3Å 9 C 无 Poroshell 3Extend-C18 3Å 4 C,pH 8 以上 6 C,pH 8 以下 有 指标只代表一般意义上的典型值 *3StableBond 柱专为低 ph 条件下的应用而设计 所有硅胶基色谱柱在 ph 6-8 条件下, 采用 <4 C 的柱温和较低的缓冲液浓度 (.1-.2 M), 可获得最高的柱稳定性 而在中等或高 ph 条件下, 我们推荐您使用 3Extend-C18 色谱柱 UHPLC/HPLC 51

54 一级结构分析 Poroshell 3 色谱柱分离蛋白质和多肽耗时仅需几秒钟 色谱柱 : 流动相 : 流速 : 梯度 : 柱温 : Poroshell 3SB-C x 75 mm, 5 µm A:.1% TFA 的水溶液 B: 含.7% TFA 的乙腈溶液 3. ml/min 1. min 内 5-1% B 7 C,26 bar 血管紧张素 II 2. 神经降压素 3. 核糖核酸酶 4. 胰岛素 5. 溶菌酶 6. 肌红蛋白 7. 碳酸酐酶 8. 卵清蛋白 检测器 : UV,215 nm 样品 : 蛋白质和多肽 在不到 6 秒的时间内完成了八种多肽和蛋白质的分离 每个峰都尖锐且高效.5 1. (min) LCPO1 提示与工具 更多信息可参考下列出版物 : Characterization of Glycosylation in the Fc Region of Therapeutic Recombinant Monoclonal Antibody( 对治疗性重组单克隆抗体 Fc 区中的糖基化进行表征 ), 出版号 EN Use of Temperature to Increase Resolution in the Ultrafast HPLC Separation of Proteins with ZORBAX Poroshell 3SB-C8 HPLC Columns( 利用温度提高 ZORBAX Poroshell 3SB-C8 HPLC 柱用于蛋白质超快速液相色谱分离时的分离度 ), 出版号 EN Using the High-pH Stability of ZORBAX Poroshell 3Extend-C18 to Increase Signalto-Noise in LC/MS( 利用 ZORBAX Poroshell 3Extend-C18 色谱柱的高 ph 稳定性提高液质联用分析时的信噪比 ), 出版号 EN

55 一级结构分析 IgG 片段的高分离度快速分析 色谱柱 : Poroshell 3SB-C x 75 mm, 5 µm 流动相 : A: 水溶液 (5% AcOH 1.% FA.5% TFA) B:7/2/1 IPA:ACN: 水 (5% AcOH 1.% FA.5% TFA) 进样量 : 2 µl 流速 : 1. ml/min mau Fc min 梯度 : 分段 8 时间 (min) % B 6 2 Fc 区域 柱温 : 8 C 检测器 : UV,28 nm 仪器 : 配备自动进样器 ( 高性能自动进样器 ) 二元泵 柱温箱 (TCC) 和二极管阵列检测器 (DAD) 的 Agilent 12 Infinity 系列, 并与 Agilent 6224 精确质量数飞行时间质谱联用 Fab 放大的 Fc 糖型分离 ( 箭头所示 ) min IgG1 的木瓜蛋白酶酶解物的反相分离结果显示出两个主峰, 分别为 Fc 和 Fab 片段 插入图详细描绘了部分分离的峰, 这些峰代表 Fc 和 Fab 片段的异构体 ( 箭头所示 ) 提示与工具 安捷伦提供各种经认证的色谱样品瓶供您选择, 包括聚丙烯样品瓶 去活样品瓶及硅烷化玻璃样品瓶 如需了解更多信息, 请查看出版物 EN UHPLC/HPLC 53

56 一级结构分析 Poroshell 3 微径柱为 LC/MS 分析提供了最高的灵敏度 色谱柱 : 流动相 : 流速 : 梯度 : 柱温 : 8 C Poroshell 3SB-C x 75 mm, 5 µm A: 水 +.1% 甲酸 B: 乙腈 +.1% 甲酸 6 µl/min 5.5 min 内 2-1% B MS 条件 : LC/MS: 正离子模式 ESI;Vcap 6, V; 干燥气流速 : 12 L/min; 干燥气温度 : 35 C 雾化器 : 45 psi; 碎裂器电压 : 14 V; 扫描 : 6-25 步长 :.15 amu 峰宽 :.6 min 样品 : 1 µl 1EB (min) LCPO3 具有 2.1 mm 1. mm 和.5 mm 内径的 Poroshell 窄径柱适于与 LC/MS 联用 当样品量非常有限时,1. mm 或.5 mm 内径 Poroshell 柱是高灵敏度 LC/MS 分析的理想选择 使用 Poroshell 柱, 只需.5 到 5 pmol 蛋白质样品即可实现灵敏的 MS 分子量测定 Poroshell 柱还被用于完整蛋白质的快速 MS 鉴定, 甚至可以在稳定剂和组织培养液存在的条件下进行蛋白质分析 单克隆 IgG1 链色谱柱 : Poroshell 3SB-C x 75 mm, 5 µm 流动相 : 流速 : 梯度 : 柱温 : 7 C 样品 : 数据来源 : Novartis AG,Basel. Dr. Kurt Forrer Patrik Roethlisberger A:9% 水 :1% 乙腈 + 3 ml/l 分子量 3 PEG B:1% 水 :9% 乙腈 + 3 ml/l 分子量 3 PEG 1. ml/min 分钟 25% B 1 分钟 4% B 1.1 分钟 25% B 12 分钟 25% B 单克隆 IgG1 mau 12 重链轻链 8 用 DTT 处理的 IgG: 4 DTT min mau 12 糖基化? 未糖基化? 8 IgG 经 4 DTT 肽-N- 糖苷酶 F 处理 mau IgG 经 DTT 肽 -N- 糖苷酶 F 羧肽酶 -B 处理 min min IgG_Poroshell 54

57 一级结构分析 蛋白质洗脱模式 色谱柱 : 流动相 : 流速 : Poroshell 3SB-C x 75 mm, 5 µm A:.1% TFA 的水溶液 B:.1% TFA 的乙腈溶液 1. ml/min 梯度 : B 在 3 min 内从 2% 升至 7% 检测器 : UV,214 nm 柱温 4 C 响应 (mv) Time (s) 柱温 6 C 响应 (mv) 柱温 75 C 响应 (mv) Time(s) Time (s) Prot_Elution 1. 糖蛋白 X,MW 约 22 kda 2. 蛋白质 I,MW 约 4 kda 3. 胰高血糖素,MW 约 3.5 kda 4. 生物合成的人胰岛素,MW 约 6 kda 5. 蛋白质 J,MW 约 3 kda 6. 蛋白质 K,MW 约 6 kda 7. 糖蛋白 Y,MW 约 45 kda 8. 糖蛋白 Z,MW 约 3 kda Poroshell 3 标志 说明 规格 (mm) 填料粒径 (µm) Poroshell ( 多孔层填料色谱柱 ) 3SB-C18 Poroshell 3SB-C8 Poroshell 3SB-C3 Poroshell 3Extend-C18 窄径柱 2.1 x 微径柱 1. x 毛细管柱.5 x 保护柱芯,4/ 包 2.1 x 保护柱卡套 微径保护柱,3/ 包 1. x UHPLC/HPLC 55

58 一级结构分析 AdvanceBio 肽谱分析色谱柱 AdvanceBio 可靠性更高的分析结果 : 每批 AdvanceBio 肽谱分析柱填料均采用多肽混合物标样进行严格测试, 确保适用性和高重现性, 使其能鉴定复杂多肽谱谱中的重要多肽 节省时间 : 分析速度较全多孔 HPLC 色谱柱提高了 2-3 倍 出色的仪器性兼容性 : 内径 和 2.1mm 的色谱柱能在 - 6 bar 范围内稳定工作, 让您的 UHPLC 仪器性能发挥至极致 同时, 这些色谱柱用于 4 bar 的旧型号仪器 时也表现卓越 灵活性更高 : 可提高所有以甲酸为流动相的 HPLC 分析的灵敏度 这些先进的生物色谱柱具有 12Å 孔径及表面多孔 2.7 µm 填料 使用复杂的多肽混标对 这些色谱柱进行专门测试, 确保可靠的肽谱分析性能 此外,AdvanceBio 肽谱分析色谱 柱可在 UHPLC 中实现极佳的分离度和速度, 在常规 HPLC 中也能获得优异的结果 色谱柱性能指标 键合相 孔径 温度上限 ph 范围 封端 EC-C18 12Å 6 C 双封端 指标只代表一般意义上的典型值 M T H P D R A N P N A B I R N K L R T T A P D R A N B R 提示与工具您是否想知道科学家如何使用 AdvanceBio 肽谱分析色谱柱? 请参阅 : Amano, M. et al. Detection of Histidine Oxidation in a Monoclonal Immunoglobulin Gamma (IgG) 1 Antibody. Analytical Chemistry, 214, 86 (15): Leah G. Luna and Katherine Coady, Identification of X. laevis Vitellogenin Peptide Biomarkers for Quantification by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry. J. Anal Bioanal Tech, 214, 5:3 更多使用安捷伦产品的相关文献, 请参阅附录中的引文 56

59 一级结构分析 促红细胞生成素酶解物的高分离度肽谱分析 色谱柱 : 流动相 : 流速 : AdvanceBio 肽谱分析色谱柱 x 25 mm, 2.7 µm A: 水 +.1% 甲酸 (v/v) B: 乙腈 +.1% 甲酸 (v/v).4 ml/min 梯度 : 时间 (min) % B 柱温 : 55 C 进样 : µl (2 µg/µl) mau min IgG 的快速高效肽谱分析 色谱柱 : 流动相 : 流速 : 柱温 : 4 C 检测器 : 进样量 : 15 µl 仪器 : AdvanceBio 肽谱分析色谱柱 x 1 mm, 2.7 µm AdvanceBio 肽谱分析色谱柱 x 15 mm, 2.7 µm A: 水 +.1% FA (v/v) B:9% ACN +.1% FA (v/v) 多种 UV,215/22 nm Agilent 129 Infinity 液相色谱和 Agilent 653 精确质量四极杆飞行时间 (Q-TOF) 质谱 mau mau x 15 mm AdvanceBio 肽谱分析色谱柱 2.1 x 1 mm AdvanceBio 肽谱分析色谱柱 %B - 5% min %B - 5% min AdvanceBio 肽谱分析色谱柱分析条件经优化后还可实现更快的肽谱分析 梯度 1-4% B,DAD:215 nm,4 C 上图为 75 min 分离, 采用 2.1 x 15 色谱柱, 获得了 59 个多肽峰 ( 流速.2 ml/min,211 bar) 下图为优化后的 14 min 分离, 采用 2.1 x 1 mm 色谱柱, 获得了 57 个多肽峰 ( 流速.6 ml/min,433 bar) UHPLC/HPLC 57

60 一级结构分析 采用安捷伦多肽混标进行的质量保证测试 色谱柱 : 流速 : 进样 : 3 µl 梯度 : 柱温 : 55 C 检测器 : AdvanceBio 肽谱分析色谱柱 x 15 mm, 2.7 µm.5 ml/min A- 水 (.1% TFA),B-ACN (.1% TFA),-25 min 内 B 从 15% 升至 65%;25-26 min 内 B 从 65% 升至 95% 22 nm 舒缓肽片段 (1-7) 2. 舒缓肽醋酸盐 3. 血管紧张素 II 4. 神经降压素 5. 血管紧张素 I 6. 肾素 7. [Ace-F-3,-2 H-1] 血管紧张素 (1-14) 8. Ser/Thr 蛋白磷酸酶 (15-31) 9. [F14] Ser/Thr 蛋白磷酸酶 (15-31) 1. 二甲双胍 ( 蜂毒液 ) 样品 : 安捷伦肽谱分析混标 ( 每种多肽.5-1. µg/µl) 部件号 用于测试每批 AdvanceBio 肽谱分析色谱柱填料的混标 该混标含 1 种分子量在 Da 范围内的亲水 疏水和碱性多肽 另外我们还采用小分子探针对每根色谱柱进行测试以确保其分析效率

61 一级结构分析 2 次进样后的批次间重现性 色谱柱 : 流速 : AdvanceBio 肽谱分析色谱柱 x 25 mm, 2.7 µm.5 ml/min 梯度 : A - 水 (.1% TFA),B - 乙腈 (.8% TFA),-8 min, 1%-6% B;8.1-9 min 保持 95% B 柱温 : 55 C 检测器 : 22 nm 进样 : 1 µl 样品 : Sigma HPLC 多肽标样 硅胶柱, 批次 PEP 进样 1 (395 bar) 进样 2 (388 bar) Norm Gly-Tyr 2. Val-Tyr-Val 3. Met Enk 4. Angio II 5. Leu Enk 进样 RT2 (min) RT3 (min) RT4 (min) RT5 (min) 进样 PW2 PW3 PW4 PW 硅胶柱, 批次 B12169 进样 1 (397 bar) 进样 2 (45 bar) 进样 RT2 (min) RT3 (min) RT4 (min) RT5 (min) 进样 PW2 PW3 PW4 PW 不同批次间及不同运行次数间均具有出色的重现性 使用 2.1 x 25 mm AdvanceBio 肽谱分析色谱柱实现最大分离度 UHPLC/HPLC 59

62 一级结构分析 AdvanceBio 肽谱分析色谱柱 说明 部件号 4.6 x 15 mm,2.7 µm x 15 mm,2.7 µm x 25 mm,2.7 µm x 15 mm,2.7 µm x 1 mm,2.7 µm x 5 mm, 快速保护柱 * x 5 mm, 快速保护柱 * x 5 mm, 快速保护柱 * *, 快速保护柱可在不影响分离速度或分离度的情况下有效延长色谱柱寿命 安捷伦多肽质量控制标样 使用安捷伦的十肽质量控制标样 ( 与安捷伦用于色谱柱质量控制的标样相同 ) 在色谱柱 使用过程中评估其性能 其可用于 HPLC 或 LC/MS 每瓶标样可进样约 2 次 安捷伦多肽质量控制标样 说明 部件号 多肽质量控制标样,71 µg 于 2 ml 样品瓶 提示与工具 肽谱分析是一项非常强大的技术, 广泛用于蛋白质的鉴定测试, 尤其适用于通过重组生成的蛋白质 要实现高度准确且可重现的肽谱分析, 我们不仅要选择适合的色谱柱, 还需要考虑蛋白质酶解 样品前处理 方法优化等诸多其他因素 有关肽谱分析流程的基本技术及优化肽谱分离以获取最佳结果时需要考虑的关键因素, 请参阅 最优化肽段表征的要点 : 肽谱分析指南, 出版号 CHCN 6

63 一级结构分析 1 µm 1 µm 1 µm A B C PLRP-S 1 µm 填料的扫描电镜图 (SEM) 可清楚地看出孔径差别 A 为小孔径 1Å B 为较大孔径 3Å C 为超大孔径 4Å PLRP-S 色谱柱 耐用的弹性聚合物填料可提供可重现的结果, 且色谱柱寿命更长 热稳定性和化学稳定性高 遵循 USP L21 标准 适用领域包括生命科学 化学 临床研究 能源 环境 食品和农业 材料科学和制药行业 多种孔径可供选择 (1Å-4Å), 可用于从小分子物质到大分子复杂化合物及多聚核苷酸的各种分离分析 PLRP-S 系列色谱柱包括各种孔径和填料尺寸, 所有填料都具有相同的化学性质和基本吸附特性 填料本身具有疏水性 因此, 无需键合相或烷基配体即可进行反相分离 这也使得这些填料成为了不含硅醇和重金属离子的高重现性填料 该色谱柱拥有多种产品系列, 适用于纳流 / 微量分离, 包括自下而上和自上而下的蛋白质组学 分析型分离以及制备纯化 此外,Process 色谱柱可以用散装填料进行装填 UHPLC/HPLC 61

64 一级结构分析 色谱柱性能指标 ph 范围 1-14 缓冲液成分 无限制 有机改性剂 1-1% 温度上限 2 C 最高压力 5-8 µm:3 psi (21 bar) 3 µm:4 psi (3 bar) PLRP-S 柱的应用 孔径 1Å 3Å 1Å 4Å 应用小分子 / 合成重组多肽 / 蛋白质大分子蛋白 DNA/ 高速 62

65 一级结构分析 25 bp DNA 标记物的 HPLC 分析 色谱柱 : PLRP-S,2.1 x 15 mm HPLC 流动相 : 流速 : A:1 mm TEAA B:1 mm TEAA 溶于 5% 水 :5% ACN 2 µl/min PLRP-S 1Å 梯度 : B 在 15 分钟内由 12.5% 升至 5% 响应,UV,26 nm PLRP-S 3Å PLRP-S 1Å PLRP-S 4Å Time VLCPLRPSResp 聚乙二醇 色谱柱 : PLRP-S 1Å PL x 15 mm, 5 µm PEG 4 流动相 : A: 水 B:ACN 梯度 : 在 12 分钟的时间内 B 由 1% 升至 3%, 然后保持 3 分钟 流速 : 进样量 : 1 µl 1. ml/min min 15 PEG 18 浓度 : 1 mg/ml 检测器 : ELS( 雾化温度 =5 C, 蒸发温度 =7 C, 气体流速 =1.6 SLM) min 15 VLC48 化学稳定性的作用 三氟乙酸浓度 色谱柱 : PLRP-S 1Å PL x 25 mm, 5 µm 流动相 : A: 含三氟乙酸 ( 多个浓度 ) 的水溶液 B: 含三氟乙酸 ( 多个浓度 ) 的乙腈溶液梯度 : 15 分钟内 B 由 12% 线性升至 4% 流速 : 检测器 : 1. ml/min ELS( 雾化温度 =75 C, 蒸发温度 =85 C, 气体流速 =1. SLM).25%.2%.1% 1 min VLC68 1. 血管紧张素 2. 血管紧张素 3. 血管紧张素 UHPLC/HPLC 63

66 一级结构分析 化学稳定性研究 NH 4 OH 浓度 色谱柱 : PLRP-S 1Å PL x 25 mm, 5 µm 1 mm 血管紧张素 II 2. 血管紧张素 I 3. 血管紧张素 III 流动相 : A:NH 4 OH ( 各种 mm) 水溶液 B:NH 4 OH ( 各种 mm) 乙腈溶液 1 mm 梯度 : 在 15 分钟的时间内 B 由 1% 线性升至 1% 流速 : 检测器 : 1. ml/min ELS( 雾化温度 =8 C, 蒸发温度 =85 C, 气体流速 =1. SLM) 1 mm min 1 VLC49 阿尔伯塔多肽研究所测试混标 色谱柱 : PLRP-S 1Å PL x 25 mm, 5 µm 5 流动相 : A: 含.1% TFA 的水 : 乙腈 =99:1 溶液 B: 含.1% TFA 的水 : 乙腈 =7:3 溶液梯度 : B 在 3 分钟内由 升至 1% 流速 : 检测器 : 1. ml/min UV,22 nm Ala 3 -Gly 4 ( 游离氨基 ) 2. Gly 3 -Gly 4 (Nα- 乙酰化 ) 3. Val 3 -Gly 4 (Nα- 乙酰化 ) 4. Val 3 -Gly 4 (Nα- 乙酰化 ) 5. Val 3 -Val 4 (Nα- 乙酰化 ) min 3 VLC5 64

67 一级结构分析 奶类样品中的乳清蛋白 牛奶 色谱柱 : PLRP-S 3Å PL x 15 mm, 8 µm 流动相 : A: 含.1% TFA 的 99% 水 :1% 乙腈溶液 B: 含.1% TFA 的 1% 水 :99% 乙腈溶液梯度 : B 在 -24 分钟的时间内由 36% 升至 48%, 然后在 24-3 分钟的时间内由 48% 升至 1% 然后在 3-35 分钟的时间内保持比例不变, 最后在 35-4 分钟的时间内由 1% 降至 36% 流速 : 进样量 : 1 µl 1. ml/min 1 min VLC74 1. α- 乳清蛋白 2. β- 乳球蛋白 (B 链 ) 3. β- 乳球蛋白 (A 链 ) 检测器 : UV,22 nm 在离子对反相 HPLC 中, 温度可以作为一个加快传质 和改善寡核苷酸分离度的方法 色谱柱 : PLRP-S 1Å PL x 5 mm, 3 µm 流动相 : A:1 mm TEAA B: 含 1 mm TEAA 的 25% 乙腈溶液梯度 : 5 min 内缓冲液 B 升至 5% mv 25 min C mer 2. 3 mer 流速 : 1. ml/min 柱温 : 35 C,6 C 或 8 C 检测器 : UV,254 nm mv 6 C 25 min mv 8 C min 12.5 VLC72 UHPLC/HPLC 65

68 一级结构分析 大分子纤维蛋白 色谱柱 : 色谱柱 : 流动相 : 流速 : PLRP-S 3Å PL x 15 mm, 8 µm PLRP-S 1Å PL x 15 mm, 8 µm A: 含.25% TFA 的水溶液 B: 含.25% TFA 的水 : 乙腈 =5:95 溶液 1. ml/min 胶原蛋白 ( 分子量 12) 2. 纤维蛋白原 ( 分子量 34) 梯度 : B 在 15 分钟内由 2% 升至 6% 检测器 : UV,22 nm PLRP-S 3Å PLRP-S 1Å min 12 min 18 VLC

69 一级结构分析 PLRP-S HPLC 柱 标志 PLRP-S 1Å USP L21 PLRP-S 3Å USP L21 PLRP-S 1Å USP L21 PLRP-S 4Å USP L21 填料粒径 规格 (mm) (µm) 4.6 x 25 8 PL PL PL x 15 8 PL PL PL PL x 5 8 PL PL PL x 25 5 PL PL x 15 5 PL PL x 5 5 PL PL PL PL x 15 3 PL PL x 5 3 PL PL x 25 8 PL x 15 8 PL PL PL x 5 8 PL PL PL x 25 5 PL PL x 15 5 PL PL x 5 5 PL PL PL PL x 15 3 PL PL x 5 3 PL PL x 5 8 PL x 5 5 PL PL x 1 5 PL1C x 15 3 PL x 5 3 PL PL PL PL PL PLRP-S 保护柱芯, 适用于 5 x 3 mm,2/ 包 保护柱卡套, 适用于 3. x 5. mm 柱芯 PL PL PL PL 提示与工具 如需了解微径柱的订购信息, 请参见 143 页 如需了解制备柱和填料的订购信息, 请参见 157 页 UHPLC/HPLC 67

70 一级结构分析 氨基酸分析 (AAA) 柱和备件 ZORBAX Eclipse 氨基酸分析 (AAA) 柱 经过专门测试, 适用于氨基酸分析 使用众所周知效果出色的 OPA 及 FMOC 柱前衍生化方法 使用 Agilent 11/12 Inifinity 系列, 采用详细的在线衍生化方案即可轻松实现自动化 Agilent ZORBAX Eclipse AAA 柱采用优化的改进方案分离氨基酸 采用较短的 75 mm 色谱柱, 前一次进样到下一次进样间的总时间可缩短至 14 min( 其中分析时间为 9 min), 而采用 15 mm 的色谱柱则为 24 min( 其中分析时间为 18 min) 使用 Agilent 11/12 Inifinity 系列液相色谱仪, 采用 OPA 和 FMOC 衍生化反应, 进行全自动化分析, 可获得卓越的灵敏度 (DAD FLD 的灵敏度为 5-5 pmol) 和可靠性 ZORBAX Eclipse Plus C µm 色谱柱可在 UHPLC 系统中获得出色的快速氨基酸分析结果 ZORBAX Eclipse 氨基酸分析 (AAA) 柱 标志说明规格 (mm) 填料粒径 (µm) 部件号 分析柱, 常规灵敏度 4.6 x 使用 FLD 可达到常规分析灵敏度 高分离度 4.6 x 常规分析灵敏度 高通量 4.6 x 节省溶剂, 高灵敏度 高分离度 3. x 保护柱芯,4/ 包 4.6 x 保护柱卡套 提示与工具 更多信息可参考下列出版物 : Automatic Precolumn Derivatization of Amino Acids and Analysis by Fast LC using the Agilent 129 Infinity LC System( 采用自动化柱前衍生以及 Agilent 129 Inifinity 液相色谱系实现氨基酸的快速液相色谱分 ZORBAX Eclipse Plus Eclipse 说明 规格 (mm) 填料粒径 (µm) Plus C18 USP L1 超高压快速高分离度 (RRHD) 窄径柱,12 bar 2.1 x 快速分离高通量窄径柱,6 bar 2.1 x 析 ), 出版号 EN

71 一级结构分析 氨基酸标准品 每种氨基酸标准品含下列氨基酸 : 甘氨酸 L- 半胱氨酸 L- 组氨酸 L- 酪氨酸 L- 亮氨酸 L- 蛋氨酸 L- 丝氨酸 L- 丙氨酸 L- 苯丙氨酸 L- 谷氨酸 L- 脯氨酸 L- 异亮氨酸 L- 精氨酸 L- 苏氨酸 L- 缬氨酸 L- 赖氨酸 L- 天门冬氨酸 氨基酸标准品,1 x 1 ml 安瓿 * 说明 部件号 1 nmol/µl pmol/µl pmol/µl pmol/µl pmol/µl 氨基酸补充试剂盒 包括正缬氨酸 肌氨酸 天门冬酰胺 谷氨酰胺 色氨酸和 4- 羟基脯氨酸各 1g * 购买时请注意保存期限并少量购买, 部件号 ,1 g 储存于安瓿瓶中 氨基酸分离试剂 说明 OPA 试剂, 邻苯二甲醛 (OPA) 和 3- 巯基丙酸溶于.4 M 硼酸盐缓冲液中, 每种 1 mg/ml,6 x 1 ml 安瓿 部件号 FMOC 试剂,9- 芴甲基氯甲酸酯的乙腈溶液,2.5 mg/ml,1 ml,1 安瓿 硼酸盐缓冲液,1 ml DTDPA( 二硫代二丙酸 ) 试剂, 用于分析半胱氨酸,5 g UHPLC/HPLC 69

72 一级结构分析 24 种氨基酸的高分离度分离 色谱柱 : ZORBAX Eclipse AAA x 15 mm, 3.5 µm 流动相 : A:4 mm Na 2 HPO 4,pH 7.8 B: 乙腈 : 甲醇 : 水,45:45:1 v/v 流速 : 2 ml/min 柱温 : 4 C 检测器 : 样品 : 荧光检测器 24 种氨基酸 Asp 2. Glu 3. Asn 4. Ser 5. Gln 6. His 7. Gly 8. Thr 9. Cit 1. Arg 11. Ala 12. Tyr 13. Cys 14. Val 15. Met 16. Nva 17. Trp 18. Phe 19. Ile 2. Leu 21. Lys 22. Hyp 23. Sar 24. Pro 24 种氨基酸在 18 min 内即可实现高分离度分离 如果采用快速分离 4.6 x 75 mm Eclipse AAA 色谱柱, 在 9 min 内即可完成这些氨基酸的分离 (min) 2 25 LCPAH1 提示与工具 快速参考指南列出了使您的 Agilent 12 Infinity 系列液相色谱仪保持最佳状态所必需的常用消耗品 请访问 下载免费副本 7

73 电荷异构体分析 电荷异构体分析 纯化蛋白质和其他带电荷分子 离子交换色谱 (IEX) 是一种高灵敏度的技术, 可以基于电荷的差异分离离子和极性分子 和 SEC 一样, 用 IEX 也可以分离天然状态的蛋白质 将 IEX 用于电荷异构体的分析 由于抗体在生产和纯化过程中发生了氨基酸取代 糖基化 磷酸化和其他翻译后修饰或化学修饰, 其电荷异质性可能发生改变 由于这类变化可能影响稳定性和活性 ( 或引发免疫副反应 ), 因此, 单克隆抗体 (MAb) 制备过程中电荷异质性的分析对生物药物非常重要 蛋白质分析中, 在给定 ph 下蛋白质发生电荷变异, 说明其分子一级结构发生了改变, 从而导致额外的蛋白构象产生 这些称为异形体 ( 或电荷异构体 ), 可以用 IEX 色谱进行分离 IEX 也可以用作制备技术 由于这类变化可能影响稳定性和活性 ( 或引发免疫副反应 ), 因此, 电荷异构体的分析对生物药物非常重要 作为生物制药行业的领先供应商, 安捷伦深知产品的高质量和一致性是实现安全 高效治疗的关键 安捷伦离子交换 BioHPLC 色谱柱可提供用户所需的高速 高分离度和优异的重现性, 使得用户能够以较低的成本快速推出能够改善目标群体生活质量的产品 UHPLC/HPLC 71

74 电荷异构体分析 这几页将介绍安捷伦弱和强离子交换剂 ( 阴离子和阳离子 ) 产品系列 安捷伦无孔 Bio IEX 色谱柱专为高分离度 高回收率的高效分离而设计 Agilent Bio MAb 色谱柱针对单克隆抗体电荷异构体的分离进行了优化 安捷伦多孔 IEX 柱 (PL-SAX 和 PL-SCX) 化学稳定, 有两种孔径可供选择, 可用于分离多肽 寡核苷酸和极大的蛋白质 Bio-Monolith IEX 柱非常适合用于分离抗体 病毒和 DNA 缓冲液顾问软件是利用离子强度梯度实现自动化蛋白质分离的理想解决方案 提示与工具 更多有关安捷伦缓冲液顾问软件的信息, 请参阅出版物 CHCN

75 电荷异构体分析 离子交换柱的选择 应用安捷伦色谱柱说明 单克隆抗体 Bio MAb 单克隆抗体的全面表征, 包括酸性和碱性异构体的鉴别和监测 Agilent Bio MAb 液相色谱柱填充了专为单克隆抗体基于带电量的高分离度分离而设计的特殊树脂 多肽和蛋白质 Bio IEX Agilent Bio IEX 色谱柱填充了聚合物型无孔离子交换填料 Bio IEX 色谱柱专为高分 离度 高回收率的高效分离而设计 蛋白质 多肽和脱保护寡核苷酸 PL-SAX 色谱柱 强阴离子交换官能团共价连接到化学稳定的全多孔聚合物, 拓展了可操作的 ph 范 1Å 4Å 围 此外, 阴离子交换能力与 ph 值无关 分析合成寡核苷酸时, 可以使用温度 有机溶剂和高 ph 等变性条件进行分离 5 µm 填料可达到更高的分离度, 而 球蛋白和多肽 PL-SAX 1Å 3 µm 填料则适用于中压液相色谱分析 极大的生物分子 / 高速 PL-SAX 4Å 小肽到大蛋白 PL-SCX 色谱柱 PL-SCX 是一种具有强亲水性涂层和强阳离子交换官能团的大孔 PS/DVB 填料 其 1Å 4Å 生产工艺严格控制, 具有最佳的强阳离子交换官能团密度, 适合用于分析 分离和纯化各种生物分子 5 µm 填料可达到更高的分离度, 而 3 µm 填料则适合用于 球蛋白 PL-SCX 1Å 中压液相色谱分析 极大的生物分子 / 高速 PL-SCX 4Å 抗体 (IgG IgM) 质粒 DNA Bio-Monolith 色谱柱 强阳离子交换 强阴离子交换和弱阴离子交换固定相 Bio-Monolith 液相色谱柱与 病毒 噬菌体和其他生物大分子 Bio-Monolith QA Bio-Monolith DEAE Bio-Monolith SO 3 制备型液相色谱系统兼容, 包括安捷伦 Agilent 11 和 12 Inifinity 系列 病毒 DNA 大蛋白质粒 DNA 噬菌体 Bio-Monolith QA Bio-Monolith DEAE 蛋白质 抗体 Bio-Monolith SO 3 UHPLC/HPLC 73

76 电荷异构体分析 Agilent Bio MAb 液相柱 填料单体为高度交联的硬质球形聚苯乙烯 / 二乙烯基苯 (PS/DVB) 无孔微球 填料表面结合了亲水聚合物层, 可有效避免抗体蛋白的非特异性结合 采用特殊工艺将弱阳离子交换固定相层涂覆于填料, 使其相比 Agilent Bio WCX 色谱柱填料的密度更高 专为单克隆抗体的电荷异构体分离而设计 单克隆抗体的全面表征, 包括酸性和碱性异构体的鉴别和监测 Agilent Bio MAb HPLC 色 谱柱填充了专为单克隆抗体基于带电量的高分离度分离而设计的特殊树脂 这些色谱柱 可兼容水性缓冲液 乙腈 / 丙酮 / 甲醇, 以及水混合溶液 常用的缓冲液包括磷酸盐 tris MES 和乙酸盐 Bio MAb 柱有 和 1 µm 粒径可供选择, 粒径越小, 可达到的分离度越高 色谱柱性能指标 键合相内径填料粒径 弱阳离子交换 ( 羧酸型 ) 2.1 和 4.6 mm 和 1 µm ph 稳定性 操作温度上限 流速 C.1-1. ml/min 提示与工具 您是否希望提高单克隆抗体电荷异构体分析的通量? 如果是, 请参阅 : Reducing Cycle Time for Charge Variant Analysis of Monoclonal Antibodies Alternating Column Regeneration Using an Agilent 12 Infinity Series Quick-Change Bio-inert 2-position/1-port Valve( 采用 Agilent 12 Inifinity 系列快速切换生物惰性 2 位 /1 通阀进行交互柱再生缩短单克隆抗体电荷异构体分析的循环时间 ), 出版号 EN

77 电荷异构体分析 一致的离子交换 MAb 分离 色谱柱 : Bio MAb, PEEK x 25 mm, 5 µm 流动相 : A:1 mm 磷酸钠,pH 5.5 B:A +.5 M 氯化钠流速 :.85 ml/min 梯度 : 从 到 25 min,b 从 1 % 增加到 35 % ( 除非另有说明 ) 检测器 : 样品 : 仪器 : UV,225 nm 5 µg 1 mg/ml 完整或羧基端消解的 IgG1 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱或 Agilent 11 系列液相色谱 mau 峰面积 : 完整的 IgG1 羧基端 峰总面积 = min Acidic 主峰 碱性异构体 variants 羧基端消解的 IgG1 mau min 峰面积 : Acidic 主峰 碱性异构体 variants 峰总面积 = 在 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统上使用 Agilent Bio MAb 5 µm 色谱柱分析羧基端消解的 IgG1 的计算数据 UHPLC/HPLC 75

78 电荷异构体分析 ph 梯度 用于电荷异构体分析的另一强大技术 色谱柱 : 梯度 : 样品 : Bio MAb PEEK x 5 mm, 5 µm 6.5 到 7.5 (-2 min),5 mm IgG 单克隆抗体 IgG 单克隆抗体的分析 min 重现性及精密度 使用 Bio MAb 色谱柱获得 精确定量的可靠方法 色谱柱 : Bio MAb, PEEK x 25 mm, 5 µm 流动相 : A:1 mm 磷酸钠缓冲液,pH 6. B:1 mm 碳酸氢钠缓冲液,pH 9.5 流速 : 1. ml/min 梯度 : 时间 (min) %B 25 1 mau 主峰 碱性异构体 进样量 : 1 µl( 洗针进样, 针冲洗口启动 7 s) 2 酸性异构体 数据采集 : 214 和 28 nm 采集速率 : 流通池 : 2 Hz 6 mm 光程 Time (min) 24 柱温 : 3 C 样品恒温箱 : 5 C 后运行时间 : 5 min 76

79 电荷异构体分析 赫赛汀 Fab 和 Fc 片段的 WCX 分离 色谱柱 : Bio MAb,PEEK x 25 mm, 5 µm 流动相 : A:2 mm MES,pH 5.6 B:2 mm MES,pH mm NACl 流速 : 进样量 : 16 µl 17 µl/min 梯度 : 时间 (min) %B 柱温 : 3 C mau Fab Fab (-KTH) Fc Fab (deam) min 仪器 : Agilent 11 系列 UHPLC/HPLC 77

80 电荷异构体分析 使用缓冲液顾问软件进行方法开发 最佳 ph 值的确定 色谱柱 : 仪器 : 缓冲液 : Bio MAb, PEEK x 25 mm, 5 µm Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱 A: 水 B:3 M NaCl C:6 mm MES(2-(N- 吗啉 ) 乙磺酸水合物 ) D:35 mm MES-Na(2-(N- 吗啉 ) 乙磺酸钠盐 ) 样品 : 三种蛋白质混合物, 溶于 PBS( 磷酸盐缓冲盐水 ),ph 7.4 流速 : 核糖核酸酶 A:137 Da,pI 9.6 细胞色素 c:12384 Da,pI 溶菌酶 :1437 Da,pI ml/min 梯度 : 进样量 : 1 µl 恒温器 : 4 C min 2 mm NaCl 5 min 2 mm NaCl 3 min 5 mm NaCl 35 min 1 mm NaCl 36 min 2 mm NaCl TCC 温度 : 25 C DAD: 28 nm/4 nm, 参比波长 : 关闭 峰宽 : >.5 min(1. s 响应时间 )(5 Hz) 1. 核糖核酸酶 A 2. 细胞色素 c 3. 溶菌酶 mau ph 5.8 ph 6 ph 6.2 ph 6.4 ph 6.6 ph 6.8 利用动态混合四元梯度进行三种蛋白质混合物分离的 ph 筛选 min 78

81 电荷异构体分析 几乎没有保留时间变化 色谱柱 : Bio MAb, 不锈钢 x 25 mm, 1 µm 批次 A 细胞色素 c 2. 溶菌酶 3. 核糖核酸酶 A 流动相 : A:1 mm 磷酸钠,pH 6. B:A + 1. M 氯化钠 流速 : 1. ml/min 梯度 : B 在 42 分钟内由 变至 1% 批次 B 柱温 : 25 C 检测器 : UV,214 nm 批次 C min 将优质的树脂 优异的柱表面化学以及先进的色谱柱装填技术结合, 几乎消除了柱间及批次间保留时间的变化 Agilent Bio MAb 液相柱 规格 (mm) 填料粒径 (µm) Bio MAb PEEK 压力限 Bio MAb 不锈钢 压力限 21.2 x bar, 4 psi 1 x bar, 4 psi 4.6 x bar, 4 psi bar, 4 psi 4.6 x bar, 4 psi 4.6 x bar, 58 psi bar, 58 psi 4.6 x bar, 58 psi 4.6 x bar, 8 psi 4.6 x bar, 87 psi 4. x 1, 保护柱 bar, 4 psi 4. x 1, 保护柱 bar, 6 psi 4. x 1, 保护柱 bar, 8 psi 4. x 1, 保护柱 bar, 87 psi 2.1 x bar, 4 psi 2.1 x bar, 4 psi 2.1 x bar, 58 psi 2.1 x bar, 58 psi UHPLC/HPLC 79

82 电荷异构体分析 Agilent Bio IEX 液相柱 高度交联的无孔聚 ( 苯乙烯 / 二乙烯基苯 )(PS/DVB) 硬质填料表面结合亲水聚合物层, 可避免非特异性结合 均一 致密填装的离子交换官能团化学键合到亲水层上 ( 每个结合位点连接多个离子交换基团 ), 可提高色谱柱容量 填料 涂层和键合能够耐高压, 有助于实现更高的分离度和更快速的分离 多个离子交换基团固定连接在一个结合位点上, 以增加色谱柱容量 Agilent Bio IEX HPLC 色谱填充了聚合型无孔离子交换填料, 专门用于多肽 寡核苷酸和蛋白质的高分离度 高回收率和高效分离 Bio IEX 系列包括强阳离子交换 (SCX) 弱阳离子交换 (WCX) 强阴离子交换 (SAX) 和弱阴离子交换 (WAX) 填料 所有固定相均有 和 1 µm 无孔填料规格可供选择 色谱柱性能指标键合相 内径 填料粒径 ph 稳定性 操作温度上限 流速 SCX( 强阳离子交换 ) SO 3 H 2.1 和 4.6 mm 和 C.1-1. ml/min WCX( 弱阳离子交换 ) COOH SAX( 强阴离子交换 ) N(CH 3 ) 3 WAX( 弱阴离子交换 ) N(C 2 H 5 ) 2 1 µm 提示与工具 更多有关优化电荷异构体分析的信息, 请参阅 : Ion-exchange chromatography for biomolecule analysis: a "how-to" guide( 用离子交换色谱分析生物分子 : 操作指南 ), 出版号 EN, 以及安捷伦离子交换 BioHPLC 色谱柱 满怀信心地快速表征蛋白质电荷异构体, 出版号 CHCN 8

83 电荷异构体分析 简化的电荷异构体分析工作流程 色谱柱 : 流动相 : 流速 : Agilent Bio WCX, 不锈钢 x 5 mm, 3 µm Agilent Bio SCX, 不锈钢 x 5 mm, 3 µm A: 水 B:1.5 M 氯化钠 C:4 mm 磷酸二氢钠 D:4 mm 磷酸氢二钠按照由缓冲液顾问软件预先确定的比例混合 C 和 D, 得到具有所需 ph 范围和强度的缓冲液 1. ml/min 梯度 : 获取右侧色谱图采用的色谱条件为 : ph 5. 到 7., 缓冲液强度 1 到 25 mm 磷酸钠 到 5 mm( min 至 15 min) 磷酸钠保持 5 mm(15 min 至 2 min) DOE 实验 ph 5. 到 7. 到 2 mm, 到 25 mm, 以及 到 3 mm 柱温 : 室温 1 mm 15 mm 2 mm 25 mm min 检测器 : UV,22 nm 样品 : IgG 单克隆抗体 样品浓度 : 2 mg/ml( 溶于磷酸钠缓冲液 2 mm,ph 6.) 仪器 : Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱 优化电荷异构体分离的自动化方法开发 从单克隆 IgG 分离的筛选色谱图中, 在 ph 6.5 条件下优化缓冲液强度 UHPLC/HPLC 81

84 电荷异构体分析 利用更小粒径的填料和更短的色谱柱实现更快分 析 分离速度提高 3% 色谱柱 : 色谱柱 : Agilent Bio WCX, 不锈钢 x 25 mm, 5 µm Agilent Bio WCX, 不锈钢 x 5 mm, 3 µm mm NaCl 1. 卵清蛋白 2. 核糖核酸酶 A 3. 细胞色素 c 4. 溶菌酶 流动相 : A:2 mm 磷酸钠,pH 6.5 B:A M 氯化钠梯度 : - 5% B 3 4 Bio WCX 3 µm,4.6 5 mm 柱温 : 室温 进样量 : 1 µl mm NaCl 检测器 : 样品浓度 : 仪器 : UV,22 nm.5 mg/ml Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱 min mm NaCl 3 4 Bio WCX 5 µm, mm mm NaCl min 使用 Agilent Bio WCX 4.6 x 5 mm (3 µm) 色谱柱和 Agilent Bio WCX 4.6 x 25 mm (5 µm) 色谱柱分离蛋白质的色谱图对比 ( 流速 1. ml/min) 通过更小填料粒径和更短色谱柱实现了更快的分析 样品从较长的色谱柱中流出需 17 min, 而从较短色谱柱中流出仅需 12 min 82

85 电荷异构体分析 较小粒径填料显著提高分离度 色谱柱 : 色谱柱 : Agilent Bio WCX, 不锈钢 x 5 mm, 3 µm Agilent Bio WCX, 不锈钢 x 5 mm, 1.7 µm 流动相 : A:2 mm 磷酸钠,pH 6.5 B:A M 氯化钠梯度 : - 5% B 柱温 : 室温 进样量 : 1 µl 检测器 : 样品浓度 : 仪器 : UV,22 nm.5 mg/ml Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱 1. 卵清蛋白 2. 核糖核酸酶 A 3. 细胞色素 c 4. 溶菌酶 mm NaCl mm NaCl mm NaCl Bio WCX 3 µm Bio WCX 1.7 µm Bio WCX 1.7 µm mm NaCl mm NaCl mm NaCl min min min 左侧和中间 : 在 Agilent Bio WCX 3 µm 色谱柱与 Agilent Bio WCX 1.7 µm 色谱柱上进行蛋白质分离 ( 流速 1. ml/min) 右侧 : 将流速提高到 1.7 ml/min, 分离时间缩短到 3 min 以内 ( 使用 Agilent Bio WCX 色谱柱 ) 通过提高流速减少分析时间 ( 无损峰形和分离度 ) UHPLC/HPLC 83

86 电荷异构体分析 使用 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色 谱系统, 以及阴离子交换色谱柱进行蛋白质分析 色谱柱 : Agilent Bio WAX, PEEK x 25 mm, 5 µm 缓冲液 : A:2 mm tris,ph 7.6 B:2 mm tris,ph M NaCl, 1 M KCl,1 M CH 3 COONa, 1 M [(CH 3 ) 4 N]Cl 梯度 1 M: 梯度 2 M: 停止时间 : 后运行时间 : 5 min 1% A 2 min 7% B 25 min 1% B 5 min 1% A 2 min 35% B 25 min 5% B 25.1 min 1% B 3 min 2 min 柱温 : 25 C 流速 :.5 ml/min 进样量 : 5 µl DAD: 28 nm 峰宽 :.25 min ( 响应时间.5 s) (1 Hz) 更多信息请参见应用简报 CHCN ( mau 肌红蛋白,pl 伴清蛋白异构体 A,pl 伴清蛋白异构体 B,pl α- 乳清蛋白,pl 胰蛋白酶抑制剂,pl 图 1. 线性梯度条件下蛋白质的 AEX 分离色谱图, 采用 2 M NaCl 作为洗脱盐 mau 图 2. 线性梯度条件下蛋白质的 AEX 分离色谱图, 采用 1 M KCl 作为洗脱盐 5 RSD (%) 峰面积 RSD (%) 肌红蛋白 伴清蛋白异构体 A.8.89 伴清蛋白异构体 B.66 不适用 α- 乳清蛋白.81 不适用 胰蛋白酶抑制剂 min min RSD (%) 峰面积 RSD (%) 肌红蛋白 伴清蛋白异构体 A.27 不适用 伴清蛋白异构体 B.15 不适用 α- 乳清蛋白 胰蛋白酶抑制剂 RSD (%) 峰面积 RSD (%) mau 肌红蛋白 伴清蛋白异构体 A.35 不适用 伴清蛋白异构体 B.33 不适用 α- 乳清蛋白 胰蛋白酶抑制剂 图 3. 线性梯度条件下蛋白质的 AEX 分离色谱图, 采用 1 M [(CH 3 ) 4 N]Cl) 作为洗脱盐 84

87 电荷异构体分析 Agilent Bio IEX 液相柱,PEEK 规格 (mm) 填料粒径 (µm) 压力限 Bio SCX 部件号 Bio WCX 部件号 Bio SAX 部件号 Bio WAX 部件号 4.6 x bar, 4 psi x bar, 4 psi x bar, 58 psi x bar, 58 psi x bar, 4 psi x bar, 4 psi x bar, 58 psi x bar, 58 psi Agilent Bio IEX 液相柱, 不锈钢 规格 (mm) 填料粒径 (µm) 压力限 Bio SCX 部件号 Bio WCX 部件号 Bio SAX 部件号 Bio WAX 部件号 21.2 x x x bar, 4 psi x bar, 6 psi x x bar, 8 psi x bar, 87 psi x 1, 保护柱 bar, 4 psi x 1, 保护柱 bar, 6 psi x 1, 保护柱 bar, 8 psi x 1, 保护柱 bar, 87 psi 提示与工具 更多信息请参阅 : 利用安捷伦弱阳离子交换色谱柱优化蛋白质的分离, 出版号 CHCN 使用安捷伦弱阳离子交换柱进行快速分离, 出版号 EN ph 梯度洗脱用于改善单克隆抗体电荷异构体的分离, 出版号 CHCN 使用安捷伦缓冲液顾问软件优化阳离子交换色谱法的蛋白质分离, 出版号 CHCN UHPLC/HPLC 85

88 电荷异构体分析 PL-SAX 强阴离子交换柱 小粒径填料提供了卓越的色谱性能 提供广泛的填料粒径及两种孔径, 适合灵活的分析方法及纯化放大 出色的稳定性, 色谱柱寿命长 PL-SAX -N(CH 3 ) + 3 色谱柱非常适用于蛋白质 多肽和去保护合成寡核苷酸在变性条件下的阴离子交换 HPLC 分离 强阴离子交换官能团共价连接到化学稳定的全多孔聚合物, 拓展了可操作的 ph 范围 此外, 阴离子交换能力与 ph 值无关 分析合成寡核苷酸时, 可以使用温度 有机溶剂和高 ph 等变性条件进行分离 PL-SAX 色谱柱改善了分析可能产生聚集或发夹结构的自补序列或富含 G 的序列时的色谱性能 5 µm 填料可高效分离 n 和 n-1 序列 填料粒径和色谱柱尺寸范围广泛, 可将分析级方法轻松放大至纯化级 填充材料的强阴离子交换官能团提供了独特的化学和热稳定性, 甚至可以使用氢氧化钠作为洗脱剂, 从而延长了柱寿命 色谱柱性能指标 键合相内径 (mm) 粒径 (µm) 孔径 ph 稳定性操作温度上限 强阴离子交换 和 和 3 1Å 和 4Å C 86

89 电荷异构体分析 标准离子交换蛋白质分离 色谱柱 : PL-SAX 1Å PL x 5 mm, 5 µm 流动相 : A:1 mm tris HCI,pH 8 B:A + 35 mm 氯化钠,pH 肌红蛋白 2. 牛碳酸酐酶 3. 卵清蛋白 4. 大豆胰蛋白酶抑制剂 梯度 : B 在 2 分钟内由 升至 1% 流速 : 检测器 : 1. ml/min UV,22 nm min 25 VLC7 胆碱激酶分析色谱柱 : PL-SAX 4Å PL x 5 mm, 8 µm %B 1 流动相 : A:2 mm tris 5% 乙二醇溶液,pH 7.5 ( 添加下述物质用于维持酶活性 ) 1. mm 乙二醇四乙酸 2. mm ß- 巯基乙醇.2 mm 苯甲基磺酰氟 B:A + 1 M 氯化钾 酶活性 流速 : 检测器 : 3. ml/min UV,28 nm 分离数据由美国普渡大学的 T Porter 提供 min 4 UHPLC/HPLC 87

90 电荷异构体分析 典型乳清蛋白的分析 色谱柱 : PL-SAX 1Å PL x 5 mm, 8 µm 流动相 : A:2 mm tris HCI,pH 7 B:A + 5 mm 乙酸钠,pH 7 流速 : 1. ml/min 梯度 : 1 min 内 B 由 % 线性变化至 5% 碳酸酐酶 2. α- 乳清蛋白 3. β- 乳球蛋白 B 4. β- 乳球蛋白 A 检测器 : UV,28 nm 3 min 18 合成寡核苷酸的可靠分离 多聚 -T- 寡核苷酸分子量 标准品的高分离度分离, 其中加标大小为 1 mer 15 mer 3 mer 和 5 mer( 主峰 ) 的标准片段 色谱柱 : PL-SAX 1Å PL x 5 mm, 8 µm 流动相 : A:7:93 v/v ACN:1 mm TEAA,pH 8.5 B:7:93 v/v ACN:1 mm TEAA,1 M 氯化铵,pH 8.5 梯度 : 流速 : 在 1 分钟的时间内 B 由 逐渐变至 4%, 然后在 14 分钟的时间内逐渐变至 7%, 之后在 25 分钟的时间内逐渐变至 1% 1.5 ml/min 柱温 : 6 C 检测器 : UV,22 nm min 5 VLC45 多聚 -T- 寡核苷酸的高分离度分离 采用该梯度很容易实现 15 mer 以内 n mer 与 n-1 mer 的基线分离 88

91 电荷异构体分析 PL-SAX 强阴离子交换柱 规格 (mm) 填料粒径 (µm) 压力限 PL-SAX 1Å PL-SAX 4Å 1 x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL PL-SAX 强阴离子交换柱散装填料 规格 填料粒径 (µm) PL-SAX 1Å PL-SAX 4Å 1 g 3 PL PL g 1 PL PL UHPLC/HPLC 89

92 电荷异构体分析 PL-SCX 强阳离子交换柱 采用了能够为生物分子提供有效分离的优化设计 孔径适用于不同大小的溶质 独特的稳定性延长了柱寿命 PL-SCX -SO - 3 是一种具有强亲水性涂层和强阳离子交换官能团的大孔 PS/DVB 填料 其生产工艺严格控制, 具有最佳的强阳离子交换官能团密度, 适合用于分析 分离和纯化各种生物分子 ( 从小分子量的多肽到高分子量的蛋白质 ) 提供两种孔径 (1Å 和 4Å) 供您选择, 为不同大小的溶质提供良好的传质性能 5 µm 填料可达到更高的分离度, 而 3 µm 填料则适合用于中压液相色谱分析 色谱柱性能指标 键合相内径 (mm) 粒径 (µm) 孔径 ph 稳定性操作温度上限 强阳离子交换 和 和 3 1Å 和 4Å C 标准蛋白分离 色谱柱 : PL-SCX 1Å PL x 5 mm, 5 µm 流动相 : A:2 mm 磷酸二氢钾,pH 6. B:A + 1 M 氯化钠梯度 : B 在 2 分钟内由 升至 1% 肌红蛋白 2. 糜蛋白酶原 A 3. 细胞色素 C 4. 溶菌酶 流速 : 1. ml/min 检测器 : UV,28 nm min 25 VLC46 9

93 电荷异构体分析 PL-SCX 强阳离子交换柱 规格 (mm) 填料粒径 (µm) 压力限 PL-SCX 1Å PL-SCX 4Å 1 x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL x bar, 3 psi PL PL PL-SCX 强阳离子交换散装填料 规格 填料粒径 (µm) PL-SCX 1Å PL-SCX 4Å 1 g 3 PL PL g 1 PL PL 提示与工具 还提供用于 Prep to Process( 制备到生产级别 ) 的 PL-SAX 和 PL-SCX 色谱柱和散装填料 转到第 页 UHPLC/HPLC 91

94 电荷异构体分析 Agilent Bio-Monolith 离子交换液相柱 基于聚合物的整体式 HPLC 色谱柱, 专为分离生物大分子而设计 分离不依赖流速 ; 无扩散 无微孔 无死体积, 使得流动相和固定相之间的传质非常迅速 整体盘为 5.2 mm x 4.95 mm(1 µl 柱体积 ), 带连续通道, 消除了传质扩散 Agilent Bio-Monolith 离子交换液相柱 极快速的分离加速了方法开发, 降低了成本 ; 锁定方法开发参数显著缩短了时间, 节省了缓冲液 安捷伦 Bio-Monolith 离子交换液相色谱柱为抗体 (IgG, IgM) 质粒 DNA 病毒 噬菌体以及其他生物大分子提供了高分离度的快速分离 该列产品提供有强阳离子交换 强阴离子和弱阴离子交换以及 Protein A 固定相 Bio-Monolith 液相色谱柱与 HPLC 和制备型液相色谱系统兼容, 包括 Agilent 11 和 12 Inifinity 系列 安捷伦 Bio-Monolith HPLC 柱选择指南 色谱柱说明主要应用部件号 Bio-Monolith QA Bio-Monolith DEAE Bio-Monolith SO 3 季铵键合相 ( 强阴离子交换 ) 在 ph 2-13 的操作范围内完全带电荷, 可结合带负电荷的生物大分子 二乙氨乙基键合相 ( 弱阴离子交换 ) 在 ph 3-9 的操作范围内提高了对带负电荷的生物大分子的选择性 磺酰基键合相 ( 强阳离子交换 ) 在 ph 2-13 操作范围内完全带电荷, 可结合带正电荷的生物大分子 腺病毒的过程监测和质量控制 IgM 纯化监测和质量控制 监测 DNA 杂质的去除 监测内毒素的去除 HSA 纯度 细菌噬菌体生产和纯化的监测和质量控制 质粒 DNA 纯化的监测和质量控制 大分子 ( 如蛋白质和抗体 ) 的快速 高分离度分析分离 血红素 A1c 的快速分析

95 电荷异构体分析 色谱柱性能指标 尺寸 柱体积 1 µl 最高耐压 5.2 mm x 4.95 mm 15 bar (15 MPa, 22 psi) 最低 / 最高温度工作温度 :2-4 C 贮存温度 :2-8 C 推荐 ph 工作范围 :2-13 冲洗顺序 :1-14 柱管材料硬件 : 不锈钢填料 : 聚 ( 甲基丙烯酸甘油酯 - 二甲基丙烯酸乙二醇酯 ) 高孔隙率整体柱色环识别标记 Bio-Monolith QA: 蓝色 Bio-Monolith DEAE: 绿色 Bio-Monolith SO 3 : 红色保存期 / 有效期 SO 3,QA,DEAE:24-36 个月 提示与工具 用安捷伦的方法转换工具软件将您的方法轻松转移到不同粒径或不同尺寸的色谱柱上 还可以计算时间和溶剂的节省情况, UHPLC/HPLC 93

96 电荷异构体分析 蛋白质标准品分离的基线展开 色谱柱 : 安捷伦 Bio-Monolith CM15, 5.5 x 15 mm 流动相 : A:1 mm 磷酸氢二钠 ph 6. B:A + 5 mm 氯化钠或仅使用 5 mm 磷酸氢二钠,pH 6. 流速 : 梯度 : 检测器 : 样品 : 仪器 : 2 ml/min 用流动相 A 洗脱.5 min, 然后采用线性梯度在 15 min 内洗脱至 45% B( 运行时间为 15.5 min), 然后于 15.6 min 时升至 6% B, 维持 6% B 至 2 min 在为下次进样重新平衡前用 1% B 冲洗色谱柱 15 min ph 梯度 :A:5 mm 磷酸氢二钠缓冲液,pH 调至 5.5;B:4 mm 磷酸氢二钠溶液 ( 不调整 ph, ph 8.9) 以 2% B/min 的线性梯度采用 1 ml/min 的流速洗脱 15 分钟, 然后用 9% B 冲洗色谱柱 5 min UV,22 nm 各 1 mg/ml, 用流动相 A 溶解 1. 从牛胰腺提取的核糖核酸酶 (pi 9.6) 2. 从牛心脏提取的细胞色素 c (pi ) 3. 从鸡蛋中提取的溶菌酶 (pi 11.35) (.5 mg) Agilent 12 Infinity 系列, 带二极管阵列检测器 mau mau min min B 的蛋白质污染物分离度更佳 A 采用 NaCl 的梯度 B 采用 Na 2 HPO 4 的梯度

97 电荷异构体分析 监测发酵过程中噬菌体的产生 色谱柱 : Bio-Monolith DEAE x 4.95 mm 流动相 : A:125 mm 磷酸钠缓冲液,pH 7. B:125 mm 磷酸钠缓冲液 + 1 M NaCl,pH 7. 流速 : 1 ml/min 梯度 : 1% 缓冲液 A (2.5 分钟 ) -1% 缓冲液 B (1 分钟 ) 1% 缓冲液 A (2 分钟 ) 检测器 : 仪器 : UV,28 nm 高压梯度液相色谱系统,Agilent 12 Infinity 系列 相对吸收值 (mau) 噬菌体和其他组分 时间 :36 min 时间 :158 min 时间 :191 min % 缓冲液 B % 梯度 min 在噬菌体增殖过程中, 基因组 DNA (gdna) 的浓度随宿主细胞的溶解而增加 gdna 在发酵后期开始降解成片段 纯化介质不能轻易去除这些 gdna 片段, 所以在这些基因组 DNA 降解前停止发酵循环非常重要 以上色谱图分别代表在 36 分钟 158 分钟和 191 分钟从生物反应器中取出的样品 峰 1 为噬菌体 介质和宿主细胞, 峰 2 是完整 gdna, 峰 3 为降解的 gdna 片段 UHPLC/HPLC 95

98 聚集体和片段分析 聚集体和片段分析 精确测定生物分子聚集 断裂和化学配基 / 修饰 体积排阻色谱 (SEC) 是一项使用水相洗脱液基于尺寸分离蛋白质 寡核苷酸和其他复杂生物聚合物的技术 尤其它还是对蛋白质生物治疗药物中的聚集体进行定量分析的重要工具 生物药物 ( 如单克隆抗体 ) 的生产是一个复杂的过程, 而蛋白质聚集是细胞培养 分离 纯化和制剂过程中都可能会出现的一个问题 二聚体和更高级的聚集体会影响最终产品的药效和安全性 ; 因此我们必须在工艺开发过程中对聚集体含量进行定量分析, 以建立产品的关键质量属性 (CQA), 进行最终产品表征时也应进行此项分析, 以确保聚集含量降至最低并将其控制在安全水平 采用 SEC 进行聚集体分析研究 蛋白质生物药物中存在的聚集体的尺寸 类型和数量, 会影响产品的药效和制剂过程 更坏情况下, 可引起免疫反应 聚集体的形成有各种机制, 包括形成二硫键和发生非共价相互作用 由于蛋白聚集体, 包括二聚体的尺寸与蛋白质单体有很大区别, 所以, 我们可以用 SEC 分离这些不同形式的蛋白质 实际上,SEC 结合 UV 或光散射检测是定量检测蛋白质聚集体的标准技术 96

99 聚集体和片段分析 采用 SEC 进行定量分析和分子量测定 对于蛋白质和其他分子量离散的分子, 可采用 SEC 对单体 二聚体 聚合体和片段进行 检测和定量 SEC 还可以分离寡核苷酸混合物 对于包含各种链长的生物聚合物 ( 如淀粉和其他多糖 ),SEC 可以提供其分子量分布和支 链 ( 使用适合的检测器 ) 方面的数据 安捷伦作为有 3 多年 SEC 色谱柱和仪器生产经验的领先企业, 正不断开发能够提供更高分离度和更快分离速度的新的 SEC 产品 本节将着重介绍用于蛋白质生物聚合物分析的各种安捷伦 SEC 系列色谱柱 : Bio SEC-3 和 Bio SEC-5 色谱柱有多种孔径可选, 非常适合用于蛋白质分析 尤其适合测定治疗性生物分子中的二聚体和聚集体 请注意,3 µm Bio SEC-3 色谱柱与行业标准的 5 µm Bio SEC-5 色谱柱相比, 能提供更高的分离度 ProSEC 3S 柱可在高盐条件下很好地分离球蛋白 ZORBAX GF-25 和 GF-45 柱是采用仍要求使用 USP 指定产品 L35 的方案时需要使用的传统产品 另外, 我们建议使用 Bio SEC 柱以改善性能 PL aquagel-oh 柱可用于分析宽分子量范围的生物聚合物, 例如 PEG 寡糖和多糖 淀粉和胶类 请参阅 水相和极性 GPC/SEC 色谱柱产品指南, 出版号 CHCN 体积排阻色谱 (SEC) 应用 安捷伦色谱柱 说明 USP 指定产品 多肽 蛋白质 聚集体分析 安捷伦 Bio SEC-3 色谱柱 采用 3 µm 填料,1Å 15Å 和 3Å 孔径可选, 能够提供更高的分离度和更快的分离速度 L33 或 L59 生物大分子和含多种分子量组分的样品 安捷伦 Bio SEC-5 色谱柱 有更多孔径可供选择 (1Å 15Å 3Å 5Å 1Å 及 2Å), 能够覆盖更宽的分析物范围 球蛋白 抗体 ProSEC 3S 色谱柱 可通过单柱在高盐浓度条件下分析蛋白质 L33 蛋白质, 球蛋白 ZORBAX GF-25/ 采用仍要求使用 USP 指定产品 L35 的方案时需要使用的传统产品 L35 45 色谱柱 L33 或 L59 UHPLC/HPLC 97

100 聚集体和片段分析 哪一种体积排阻色谱柱适合您的应用? 您可以基于分析物和方法参数, 从安捷伦的多种体积排阻色谱柱中, 选出可助您实现完美分离的产品 本图为您提供了要获得常见 分子类型的最佳分离结果所需的孔径范围概览 我们建议您使用 Agilent Bio SEC-3 和 Bio SEC-5 色谱柱进行初次方法开发 胰岛素 肌红蛋白 卵清蛋白 BSA IgG 甲状腺球蛋白 Agilent Bio SEC 1Å Agilent Bio SEC 15Å Agilent Bio SEC 3Å Agilent Bio SEC 5Å 从这里开始进行您的 mab 方法开发 Agilent Bio SEC 1Å ProSEC 3S Agilent Bio SEC 2Å ZORBAX GF-25 ZORBAX GF-45 1 Da 1 kda 1 kda 1 kda 1 kda 1 kda 1 kda 多肽球蛋白蛋白偶联物和生物大分子 98

101 聚集体和片段分析 安捷伦 Bio SEC-3 色谱柱 为多肽和蛋白质的快速分离提供更高的分离度 Agilent Bio SEC-3 色谱柱因其填料尺寸小且高效, 在速度和分离度方面比其他体积排阻色谱柱更有优势 比大粒径 SEC 色谱柱分离速度更快 高分离度 : 更尖锐的色谱峰及更好的蛋白回收率 优异负载能力和回收率 : 得益于其专利亲水层 灵活的方法开发 : 与大多数水相缓冲液兼容 在高盐和低盐条件下都具有出色的稳定性 性能可靠一致 : 填料分散窄 ; 专利亲水层最大限度地减少了次级相互作用 高稳定性填料 : 与包括蒸发光散射在内的多种检测器兼容 Bio SEC-3 色谱柱帮助您获得一致性更高的 SEC 分离 每根色谱柱都填充了球形 粒径分散窄的 3 µm 硅胶颗粒, 其表面涂覆专利亲水聚合物层, 可确保高回收率, 并最大限度地减少次级相互作用 提供一致性更好的分离 这层很薄的聚合物层在控制条件下化学键合到机械稳定的纯硅胶表面, 以确保得到高效的体积排阻填料 色谱柱性能指标 孔径填料粒径分子量范围 ph 范围最高压力流速 1Å 3 µm bar, 2 psi ml/min(21.2 mm 内径 ) ml/min(7.8 mm 内径 ).1-.4 ml/min(4.6 mm 内径 ) 15Å 3 µm bar, 2 psi ml/min(21.2 mm 内径 ) ml/min(7.8 mm 内径 ).1-.4 ml/min(4.6 mm 内径 ) 3Å 3 µm bar, 2 psi ml/min(21.2 mm 内径 ) ml/min(7.8 mm 内径 ).1-.4 ml/min(4.6 mm 内径 ) 提示与工具 去活性 / 硅烷化样品瓶拥有不与金属 生物分子或蛋白质发生相互作用, 也不会引起 ph 值偏移的惰性表面 生物分子或光敏 化合物禁止使用标准的聚丙烯样品瓶 UHPLC/HPLC 99

102 聚集体和片段分析 校正曲线 Bio SEC-3 色谱柱 : Bio SEC x 3 mm, 3 µm 流动相 : 15 mm 磷酸钠缓冲液,pH 7. 流速 : 检测器 : 1. ml/min UV 1,, 1, 3Å 15Å 1Å 蛋白质 分子量 3Å 15Å 1Å 甲状腺球蛋白 γ 球蛋白 BSA 卵清蛋白 肌红蛋白 核糖核酸酶 A 维生素 B 分子量 1, 1, 保留体积 (ml) 完整 Mab 单体和二聚体的分离色谱柱 : Bio SEC-3, 3Å x 3 mm, 3 µm 缓冲液 : 15 mm 磷酸钠缓冲液,pH 7. 流速 : 样品 : 进样 : 5 µl 检测器 : 柱温 : 1. ml/min CHO- 人源化 MAb,5 mg/ml 完整 UV,22 nm 室温 mau 二聚体 单体 min VLC_MD_Mab 1

103 聚集体和片段分析 安捷伦 Bio SEC-3 色谱柱和竞争厂商色谱柱分析 单克隆抗体的比较 色谱柱 : 色谱柱 : Bio SEC-3, 3Å x 3 mm, 3 µm 竞争厂商色谱柱 7.8 x 3 mm 流动相 : 15 mm 磷酸钠 + 1 mm 硫酸钠 ( 含盐 ) 15 mm 磷酸钠 ( 不含盐 ) mau 含盐 单体二聚体 mau 含盐 单体 二聚体 流速 : 检测器 : 样品 : 1. ml/min UV,22 nm mab (2 mg/ml) 1 不含盐安捷伦 Bio SEC-3 8 minutes 1 不含盐 竞争厂商色谱柱 8 minutes Agilent Bio SEC-3 色谱柱分离出了竞争厂商色谱柱没有发现的 mab min min Mono_Dimer1 用安捷伦 Bio SEC-3 和竞争厂商色谱柱对单克隆抗体单体和二聚体进行分析 洗脱液 色谱柱 单体 : 二聚体分离比率 单体效率 二聚体百分比 含盐 安捷伦 2.4 7, 含盐 竞争厂商 , 不含盐 安捷伦 2.8 7,942.6 不含盐 竞争厂商 , 提示与工具更多信息可参考 : 采用 Agilent BioHPLC 体积排阻色谱柱, 快速可靠地分离蛋白质聚集体和降解产物, 出版号 CHCN UHPLC/HPLC 11

104 聚集体和片段分析 孔径选择填料孔径的选择将影响 SEC 的分离度 由于分离是基于溶液中分子尺寸的差异, 所以样品必须能够进入到填料的多孔结构中 如果孔径太小, 样品组分都被排阻在孔隙之外, 组分将在色谱柱空隙体积内被洗脱, 如果太大, 则各组分都能完全渗透到填料孔隙中, 将很难实现分离 孔径选择 : 蛋白质 A 柱 : B 柱 : C 柱 : Bio SEC-3, 1Å x 3 mm, 3 µm Bio SEC-3, 15Å x 3 mm, 3 µm Bio SEC-3, 3Å x 3 mm, 3 µm 流动相 : 1 mm 磷酸钠 + 15 mm 氯化钠,pH 6.8 mau Å 甲状腺球蛋白聚集体 2. 甲状腺球蛋白 3. IgA 4. γ- 球蛋白 5. 卵清蛋白 6. 肌红蛋白 7. 维生素 B12 7 流速 :.35 ml/min 15 检测器 : 样品 : UV,22 nm Bio-Rad 凝胶过滤混合标准品 1 15Å 5 1Å PoreSz_Proteins 孔径选择 : 小鼠 IgG A 柱 : Bio SEC-3, 1Å x 3 mm, 3 µm B 柱 : C 柱 : Bio SEC-3, 15Å x 3 mm, 3 µm Bio SEC-3, 3Å x 3 mm, 3 µm 流动相 : 1 mm 磷酸钠 + 15 mm 氯化钠,pH 6.8 流速 : 检测器 : 样品 :.35 ml/min UV,22 nm 小鼠 IgG mau 二聚体 2. 单体 3. 单体片段 4. 叠氮化物 3Å 15Å 1Å PoreSz_Mouse 12

105 聚集体和片段分析 柱长 当缩短分离时间很重要时, 使用填充更高柱效的 3 µm 填料的短柱 短柱采用更高流速, 缩短了分析时间, 但对数据质量没有影响, 适合单克隆抗体单体和二聚体的定量分析 安捷伦 Bio SEC-3 柱长比较, 15 mm 色谱柱 : 流动相 : 流速 : 检测器 : 样品 : Bio SEC-3, 3Å x 15 mm, 3 µm 15 mm 磷酸钠 1. ml/min (56 bar), 1.5 ml/min (75 bar) UV,22 nm mab (2 mg/ml) 安捷伦 Bio SEC-3 柱长比较, 3 mm 色谱柱 : Bio SEC-3, 3Å x 3 mm, 3 µm 流动相 : 15 mm 磷酸钠 + 1 mm 硫酸钠 ( 含盐 ) 15 mm 磷酸钠 ( 不含盐 ) 流速 : 检测器 : 样品 : 1. ml/min UV,22 nm mab (2 mg/ml) 15 mm 3 mm 1.5 ml/min 1. ml/min 单体 单体 二聚体 含盐 二聚体 单体 二聚体 不含盐 4 min 8 min UHPLC/HPLC 13

106 聚集体和片段分析 安捷伦 Bio SEC-3 色谱柱 规格 (mm) 填料粒径 (µm) Bio SEC-3 1Å USP L33 Bio SEC-3 15Å USP L33 Bio SEC-3 3Å USP L x x 5, 保护柱 x x x 5, 保护柱 x x x 5, 保护柱 与传统 SEC 分析比较色谱柱 : Bio SEC-3, 3Å x 3 mm, 3 µm 流动相 : PBS,pH 7.4 流速 :.75 ml/min 检测器响应 (mv) A MW = 1532 Da 6 1e e e1 1 1e Time (min) 1e6 1e5 1e4 Log MW (Da) 12 B 11 MW = Da 1e5 1 1e4 检测器响应 (mv) 9 1e e2 6 1e e Time (min) Log MW (Da) 采用传统 SEC 分析方法 ( 使用 UV 检测并经色谱柱校准, 图 A) 以及在 9 C 下采用 IS 方法 (B) 分析抗 dykddddk 抗体的结果对比 两种分析方法所得结果的分子量范围相同, 均为约 153 da 提示与工具更多有关采用 Agilent 126 Infinity 多检测器 Bio-SEC 解决方案和 Agilent BioSEC-3 色谱柱进行分子量测定和聚集体分析的信息, 请参阅 : Detailed Aggregation Characterization of Monoclonal Antibodies Using the Agilent 126 Infinity Multi-Detector Bio-SEC Solution with Advanced Light Scattering Detection( 使用 Agilent 126 Infinity 多检测器 Bio-SEC 解决方案和先进的光散射检测方法对单克隆抗体的聚集体进行详细的表征分析 ), 出版号 EN 以及 Determination of Protein Molecular Weight and Size Using the Agilent 126 Infinity Multi-Detector Bio-SEC Solution with Advanced Light Scattering Detection( 使用 Agilent 126 Infinity 多检测器 Bio-SEC 解决方案和先进的光散射检测方法测定蛋白质的分子量和分子大小 ), 出版号 EN

107 聚集体和片段分析 Agilent Bio SEC-5 色谱柱 良好的分离度 : 适用于大分子 高稳定性和效率 : 得益于专利的中性亲水聚合物层 改善的峰容量和分离度 : 为增加孔容量而特别设计的填料 优异的性能 : 卓越的重现性和色谱柱寿命 即使在高 ph 高盐和低盐条件下, 也具有卓越的稳定性 灵活的方法开发 : 与大多数水相缓冲液兼容 用途广泛 : 孔径高达 2 Å, 适用于疫苗和高分子量生物分子的分离分离含多种分子量组分的生物大分子和样品时,Agilent Bio SEC-5 色谱柱是理想的选择 该柱使用 5 µm 硅胶颗粒填充, 涂覆有确保最高柱效和稳定性的专利中性亲水聚合物层, 有 6 种不同孔径, 以便在不同分子量范围内优化分离度 色谱柱性能指标 孔径填料粒径分子量范围 ph 范围最高压力流速 1Å 5 µm bar, 2 psi ml/min(21.2 mm 内径 ) ml/min(7.8 mm 内径 ).1-.4 ml/min(4.6 mm 内径 ) 15Å 5 µm bar, 2 psi ml/min(21.2 mm 内径 ) ml/min(7.8 mm 内径 ).1-.4 ml/min(4.6 mm 内径 ) 3Å 5 µm bar, 2 psi ml/min(21.2 mm 内径 ) ml/min(7.8 mm 内径 ).1-.4 ml/min(4.6 mm 内径 ) 5Å 5 µm bar, 2 psi ml/min(21.2 mm 内径 ) ml/min(7.8 mm 内径 ).1-.4 ml/min(4.6 mm 内径 ) 1Å 5 µm bar, 2 psi ml/min(21.2 mm 内径 ) ml/min(7.8 mm 内径 ).1-.4 ml/min(4.6 mm 内径 ) 2Å 5 µm > bar, 2 psi ml/min(21.2 mm 内径 ) ml/min(7.8 mm 内径 ).1-.4 ml/min(4.6 mm 内径 ) UHPLC/HPLC 15

108 聚集体和片段分析 Agilent Bio SEC-3 和 Agilent Bio SEC-5 比较 单克隆抗体分析 色谱柱 : 色谱柱 : Bio SEC-3, 3Å x 3 mm, 3 µm Bio SEC-5, 3Å x 3 mm, 5 µm 流动相 : 15 mm 磷酸钠,pH 7. 流速 : 检测器 : 样品 : 1 ml/min UV,22 nm 人源化单克隆抗体 mau µm 5 µm 1. 二聚体 2. 单体 3. 单体碎片 min 3 µm 柱能够进行分离度更高的碎片分离 Mono_Antibody 提示与工具 在开发蛋白质聚集体的分析方法时, 我们需要考虑许多因素 : 溶质大小和分子量的影响 色谱柱选择 流动相选择重要注意事项等等 有关上述所有考虑因素的指南, 请参阅 使用体积排阻色谱法分析生物分子: 操作指南, 出版号 CHCN

109 聚集体和片段分析 校正曲线 Bio SEC-5 色谱柱 : Bio SEC x 3 mm, 5 µm 流动相 : 15 mm 磷酸钠,pH 7. 流速 : 检测器 : 1. ml/min UV,214 nm 蛋白质 分子量 保留体积 1Å 5Å 3Å 15Å 1Å 甲状腺球蛋白 γ- 球蛋白 BSA 卵清蛋白 肌红蛋白 核糖核酸酶 A 维生素 B 尿嘧啶 ( 总渗透标志物 ) 分子量 Å 5Å 3Å 15Å 1Å 保留体积 (ml) 并列比较 色谱柱 : Bio SEC x 3 mm, 5 µm 流动相 : 15 mm 磷酸钠,pH 7. 流速 : 检测器 : 1. ml/min UV,214 nm Agilent Bio SEC-5, 15Å 1. 甲状腺球蛋白,5.43 min 2. BSA 二聚物,6.19 min 3. BSA 单体,6.93 min 4. 核糖核酸酶 A, 8.74 min 5. Poly-DL- 丙氨酸 (1-5 kda),9.9 min 6. 尿嘧啶,12.13 min 用 Agilent Bio SEC-5 色谱柱和 Tosoh TSK-Gel 色谱柱分离蛋白质混合物 可以看出 Agilent Bio SEC-5 色谱柱的峰形更尖锐并且分离度更高 TSK G2SW xl 1. 甲状腺球蛋白,5.64 min 2. BSA 二聚物,6.23 min 3. BSA 单体,7.2 min 4. 核糖核酸酶 A,9.22 min 5. Poly-DL- 丙氨酸 (1-5 kda),1.2 min 6. 尿嘧啶,11.81 min UHPLC/HPLC 17

110 聚集体和片段分析 无与伦比的批次间重现性 色谱柱 : Bio SEC-5, 15Å x 3 mm, 5 µm 流动相 : 15 mm 磷酸钠,pH 7. 这四种蛋白质混合物在三支不同生产批次色谱柱上经过 3 次进样后, 保留时间重现性非常出色 AU min 4 第 3 次运行 3 次进样以后 1. 甲状腺球蛋白 2. BSA 3. 核糖核酸酶 A 4. 脲嘧啶 Lot 1 Lot 2 Lot min Agilent Bio SEC-5 色谱柱 规格 (mm) 填料粒径 (µm) Bio SEC-5 1Å USP L33 Bio SEC-5 15Å USP L33 Bio SEC-5 3Å USP L33 Bio SEC-5 5Å USP L33 Bio SEC-5 1Å USP L33 Bio SEC-5 2Å USP L x x 5, 保护柱 x x x 5, 保护柱 x x x 5, 保护柱

111 聚集体和片段分析 ProSEC 3S 性能稳定 : 机械性能稳定的硅胶填料, 在使用过程中不会流失 简单快捷的方法开发 : 扩展了线性分离范围, 无需进行孔径选择 可使用单柱分析大多数球蛋白 多种选择助您优化分离 :2 种色谱柱内径适用于多检测器 SEC 与光散射检测器一起使用时灵敏度更高, 可鉴定二聚体 三聚体和聚集体 安捷伦 ProSEC 3S 柱是为球蛋白分析而专门设计的单柱解决方案 孔径的选择和优化扩展了线性分离范围, 从而可以用这一根色谱柱分离全范围的球蛋白 填料极为稳定耐用, 不会在使用过程中碎裂而渗漏出颗粒 这确保了极其稳定的基线, 使这种色谱柱成为使用光散射检测器时的首选 7.5 mm 内径和 4.6 mm 内径两种规格, 适用于多检测器体积排阻色谱, 为小质量分子的分析提供了一种选择 ProSEC 3S 色谱柱性能指标 键合相孔径填料粒径 ProSEC 3S 3Å 5 µm 15-8 蛋白质分 子量范围 ph 范围 流速 最高压力 <1.5 ml/min (7.5 mm 内径 ) <.5 ml/min (4.6 mm 内径 ) 25 bar, 37 psi ProSEC 3S 规格 (mm) 填料粒径 (µm) 部件号 7.5 x 6 5 PL x 3 5 PL x 25 5 PL 保护柱 7.5 x 5 5 PL x 5 5 PL UHPLC/HPLC 19

112 聚集体和片段分析 用球蛋白校正 ProSEC 3S 柱 流动相 : 5 mm 磷酸钾,3 mm 氯化钠,pH 6.8 流速 : 1. ml/min 检测器 : UV,28 nm 样品 : 蛋白样品 6 分子量 / 道尔顿 蛋白质 67 甲状腺球蛋白 155 γ 球蛋白 6643 牛血清白蛋白 卵清蛋白 29 碳酸酐酶 167 肌球蛋白 细胞色素 C 1423 杆菌肽 log M 保留时间 ( 分钟 ) 13 PSEC3Sglob 使用光散射检测分析牛血清白蛋白 色谱柱 : ProSEC 3S PL x 3 mm, 5 µm 流动相 : 磷酸盐缓冲生理盐水,pH 7.4 单体 流速 : 1. ml/min 检测器 : 样品 : 示差折光 Infinity 多检测器 GPC/SEC 系统 牛血清白蛋白 单体 669 Da,88.5% 二聚体 1349 Da(2.2 x 单体分子量 ),9.8% 三聚体 197 Da(2.94 x 单体分子量 ),1.2% 四聚体 2793 Da(5.17 x 单体分子量 ),.5% 响应 RI 15 Deg 9 Deg 二聚体三聚体四聚体聚集体保留时间 ( 分钟 ) 14 BovineSerAlb 示差折光和双角度光散射检测样品结果的叠加 11

113 聚集体和片段分析 用 UV 和 9 角光散射检测 γ- 球蛋白样品的叠加图, 显示了单体 二聚体和三聚体峰色谱柱 : ProSEC 3S PL x 3 mm, 5 µm 流动相 : 1 mm 磷酸钾,3 mm 氯化钠,pH 8. 流速 : 柱温 : 5 C 检测器 : 1. ml/min UV,31 nm Infinity 多检测器 GPC/SEC 系统 响应 (mv) UV LS 9 样品 : 蛋白质 保留时间 ( 分钟 ) UV_Overlay 用 UV 和 9 光散射检测 BSA 样品的叠加图, 显示了单体 二聚体 三聚体和聚集体峰色谱柱 : ProSEC 3S PL x 3 mm, 5 µm 流动相 : 1 mm 磷酸钾,3 mm 氯化钠,pH 8. 流速 : 柱温 : 5 C 检测器 : 1. ml/min UV,31 nm Infinity 多检测器 GPC/SEC 系统 响应 (mv) UV LS 9 样品 : 蛋白质 保留时间 ( 分钟 ) UV_Overlay_BSA 提示与工具 更多信息可参考 : ProSEC 3S Protein Characterization Columns(ProSEC 3S 蛋白表征色谱柱 ), 出版号 EN Analysis of Globulins using Agilent ProSEC 3S Columns( 用 Agilent ProSEC 3S 柱分析球蛋白 ), 出版号 EN Static Light Scattering Analysis of Globular Proteins with Agilent ProSEC 3S Columns( 用 Agilent ProSEC 3S 柱以及静态光散射对球蛋白进行分析 ), 出版号 EN UHPLC/HPLC 111

114 聚集体和片段分析 ZORBAX GF-25 和 GF-45 凝胶过滤柱 采用需使用 USP 指定产品 L35 的方案时需要使用的传统产品 提供半制备和制备柱规格 GF-25 凝胶过滤柱 与有机改性剂和变性剂兼容 可耐受的 ph 范围广泛 (ph 3-8) Agilent ZORBAX GF-25 和 GF-45 体积排阻 ( 凝胶过滤 ) 色谱柱特别适用于蛋白质和其他生物大分子的尺寸分离 GF-25 和 GF-45 色谱柱串联使用时, 可分离的球状蛋白质分子量范围为 4-9 GF-25/GF-45 体积排阻色谱柱具有亲水性二醇键合固定相, 可实现蛋白质的高回收率 ( 通常 >9%), 还具有独特的经过氧化锆改性的硅胶, 从而使可操作 ph 范围达到 3-8 GF-25 和 GF-45 柱填充尺寸精确的多孔硅胶微球, 孔径和粒径分布窄 从而得到高效 耐用和高重现性的体积排阻色谱柱, 可在流速高达 3 ml/min 条件下进行蛋白质的分析型分离和制备分离 这些色谱柱可与流动相中的有机改性剂 (<25%) 和变性剂兼容, 可降低蛋白质聚合 一些常见的应用包括蛋白质单体的分离 二聚体和聚合体的分离 脱盐 蛋白质分子量估算以及改性蛋白质的分离等 UHPLC 色谱柱性能指标键合相 孔径 填料粒径 分子量范围 比表面积 ph 范围 流速 最高压力 ZORBAX GF-25 15Å 4 µm m 2 /g <3. ml/min 35 bar ZORBAX GF-45 3Å 6 µm m 2 /g <3. ml/min 35 bar 指标只代表一般意义上的典型值 112

115 聚集体和片段分析 用安捷伦 ZORBAX GF-25 柱分离 Bio-Rad 标准 品, 以保留体积对 log(mw) 作图 色谱柱 : ZORBAX GF x 25 mm, 4 µm 流动相 : 2 mm 磷酸钠,pH 7. 柱温 : 检测器 : 室温 UV,254 nm Log (MW) 甲状腺球蛋白 (67 KDa) γ 球蛋白 (158 KDa) 卵清蛋白 (44 KDa) 肌球蛋白 (17 KDa) 维生素 B 12 (1.35 KDa) (ml) 用制备柱分离蛋白质 色谱柱 : 色谱柱 : ZORBAX GF x 25 mm, 4 µm ZORBAX GF x 25 mm, 6 µm 流动相 : 2 mm 磷酸钠,pH 7. 流速 : 5. ml/min ZORBAX GF 甲状腺球蛋白 2. 过氧化氢酶 3. 牛血清白蛋白 4. ß- 乳球蛋白 B 5. 肌红蛋白 6. Tyr-Gly-Gly 检测器 : UV,28 nm 样品 : 2 µl ZORBAX GF 保留时间 ( 分钟 ) UHPLC/HPLC 113

116 聚集体和片段分析 ZORBAX GF-25 (USP L35) 和 GF-45 (USP L35) 凝胶过滤柱 填料粒径 标志 说明 规格 (mm) (µm) 部件号 GF-25, 15Å 9.4 x 保护柱 ( 需要配卡套 ) PrepHT 柱 GF-25, 15Å 4.6 x GF-45, 3Å 9.4 x GF-45 Diol, 保护柱芯,2/ 包 9.4 x GF-25 Diol, 保护柱芯,4/ 包 4.6 x GF-45 Diol, 保护柱芯,2/ 包 9.4 x 制备保护柱卡套 保护柱卡套 PrepHT GF-25, 15Å 21.2 x PrepHT GF-45, 3Å 21.2 x PrepHT 柱端接头,2/ 包 PrepHT 保护柱芯,2/ 包 17. x 保护柱卡套

117 糖基化表征 糖基化表征 一级氨基酸序列的翻译后修饰 ( 括糖基化 ) 具有多种功能并且可影响生物制药产品的有效性和致免疫性 多糖的结构也会影响血浆中蛋白质的半衰期, 以及单克隆抗体触发免疫反应以发挥其功效的能力 监管部门认为糖基化是一项关键质量属性, 因此我们需要对其进行表征和定量以确定其是否在可接受的范围内, 将糖基化作为糖蛋白创新药物 生物仿制药或改良型生物相似药开发过程中的一个重要指标进行监测 现在我们可以通过多种分析方法获得关于蛋白质糖基化之后的结构和存在形式的信息 进行结构鉴定时 ( 包括糖基化位点的鉴定 ), 我们通常将质谱检测与反相及亲水相互作用色谱 (HILIC) 结合使用 含有唾液酸的多糖也会给蛋白质增加额外的电荷, 并可通过离子交换色谱进行表征 通过表征糖蛋白和糖肽片段获取有关糖基化位点的数目和位置的信息之后, 接下来我们需要对每种多糖进行鉴定和定量 要进行上述分析, 必须将多糖从蛋白质上裂解下来, 然后使用 HILIC 色谱柱进行分析 由于多糖不含发色团, 我们需要采用衍生化处理使其带上荧光基团之后才能通过 FLD 检测对其进行分析和定量 亲水相互作用色谱柱的选择 应用安捷伦色谱柱说明 由糖蛋白 ( 包括单克隆抗体 ) 裂解所得的多糖 AdvanceBio 多糖分析色谱柱 采用酰胺键合相, 可实现快速平衡并提高多糖选择性 AdvanceBio 1.8 µm 基于全多孔颗粒, 可实现高速分离, 适用于高通量应用 在高达 12 bar 的压力下仍可保持稳定, 可用于 Agilent 129 Infinity 液相色谱仪 2.7 µm 基于 Poroshell 技术, 具有表面多孔的填料颗粒, 可减少扩散距离, 从而能在较低压力下实现高分离度的分离, 且可使用更长的色谱柱以提高分离效率 亲水性多肽及糖肽 ZORBAX RRHD 3Å, 1.8 µm AdvanceBio 多糖分析色谱柱 3Å 裸硅胶颗粒能提供与 ZORBAX RRHD 3Å,1.8 µm 反相色谱柱相互正交的分离选择性酰胺键合相可实现小分子亲水性多肽和糖肽的 HILIC 分析 AdvanceBio UHPLC/HPLC 115

118 糖基化表征 N- 糖链分析 AdvanceBio 糖谱分析色谱柱 标准品及样品前处理产品, 用于选择性地去除糖蛋白 ( 包 括单克隆抗体 ) 中的 N- 糖链 分析速度 当您的样品数量较多或需要快速获得数据时, 采用 1.8 µm 色谱柱可实现高通量的 N- 糖链分析 分离度 采用装填有 2.7 µm 颗粒的 25 mm 色谱柱可实现高分离度的分离 通过分离度的提高可对目标多糖及表达过程中可能发生的蛋白质糖基化进行精确定量 全面的方法 方法中囊括了样品前处理 色谱分析及数据解析方法, 以确保鉴定及定量分析的高重现性及高精密度 订购方便 只需一个部件号即可订购从蛋白质溶解到纯化所需的全套样品前处理工作流程产品, 包括 2-AB 标记的多糖以及用于样品前处理各个步骤的试剂盒, 灵活性极高 色谱柱性能指标键合相 内径 (mm) 填料粒径 (µm) 封端 ph 稳定性 运行温度 压力限 酰胺 HILIC 2.1 和 , 全多孔 否 C 12 bar 酰胺 HILIC 2.1 和 , 表面多孔 否 C 6 bar 要分析糖蛋白 ( 包括单克隆抗体 ) 的 N- 连接糖链组分, 必须利用 PNGase F 将 N- 糖链从蛋白质的氨基酸骨架上裂解下来 裂解所得 N- 糖链可使用亲水相互作用色谱通过质谱检测进行分析, 或采用带荧光基团的 2- 氨基苯甲酰胺 (2-AB) 对其进行衍生化后, 使用 HPLC/UHPLC 通过 FLD 或 MS 进行分析 针对裂解所得多糖的鉴定和定量分析,AdvanceBio 糖谱分析色谱柱提供 1.8 µm 和 2.7 µm 两种规格, 分别能够为分析提供出色的分析速度 (1.8 µm) 和分离度 (2.7 µm) 116

119 糖基化表征 分析速度 如果您需要缩短分析时间, 我们推荐您使用可实现高通量分析的 AdvanceBio 糖谱分析 1.8 µm 色谱柱 出众的结果 与业内同类型产品相比, 缩短 4% 的分析时间 A 柱 : B 柱 : AdvanceBio 糖谱分析色谱柱 x 15 mm, 1.8 µm 非安捷伦亚 2 µm 糖谱分析色谱柱 仪器 : Agilent 129 Infinity 液相色谱, 配备 126 Infinity 荧光检测器 (FLD) 柱温 : 55 C 样品恒温箱 : 1 C 流动相 : A:1 mm 甲酸铵,pH 4.5 B:ACN FLD: 激发 = 26 发射 = 43 进样量 : 样品 : 2 µl, 溶于 7:3 ACN:1 mm 甲酸铵 安捷伦 2-AB 标记的人类 IgG N- 连接糖链文库 ( 部件号 ) LU AdvanceBio 糖谱.6 分析色谱柱,1.8 µm LU 非安捷伦亚 2 µm 糖谱分析色谱柱 min 时间 %A %B 流速, ml/min 与非安捷伦的 2.1 x 15 mm 亚 2 µm 色谱柱相比, 同等规格 Agilent AdvanceBio 糖谱分析色谱柱可提供更高的分离度 更窄的色谱峰以及更大的峰容量 min UHPLC/HPLC 117

120 糖基化表征 分离度 如果您需要进行高分离度的分析, 我们推荐您使用柱长更长的 AdvanceBio 糖谱分析 2.7 µm 介质色谱柱 含 NeuAc 的复杂非岩藻糖基化二分支和三分支多糖 色谱柱 : 仪器 : AdvanceBio 糖谱分析色谱柱 x 15 mm, 1.8 µm Agilent 129 Infinity 二元液相色谱 缓冲液 : A:1 mm 甲酸铵的水溶液,pH 4.5 B: 乙腈 MS 条件 : 气体温度 : 25 C 鞘气温度 : 25 C 气体流速 : 8 L/min 鞘气流速 : 8 L/min 雾化器压力 : 25 psi Vcap: 35 V 喷嘴电压 : 1 V 碎裂电压 : 2 V 锥孔电压 : 45 V Oct 1 RF Vpp: 55 碰撞能量 : 15 和 3 V 模式 : MS 和目标 MS/MS 峰峰面积 % 采用 UHPLC-FLD 分析 PNGase F 裂解胎球蛋白所得且经过 2-AB 衍生化反应的 N- 糖链 质谱所得的峰归属结果显示, 胎球蛋白裂解所得的 N- 糖链为复杂的二分支和三分支多糖, 其含有 N- 乙酰神经氨酸 (NeuAc), 但不含岩藻糖 采用 HILIC-UHPLC 分析胎球蛋白 2-AB 标记的 N- 糖链, 使用质谱执行峰归属 仪器条件 抗体标准梯度胎球蛋白梯度卵清蛋白梯度 初始流速 :.5 ml/min.5 ml/min.5 ml/min 梯度 : min 85% B min 75% B -6 min 85% B 5 min 75% B 45 min 5% B B 在 1 min 时为 8% 35 min 64% B 47 min 4% B, 流速.5 ml/min 6 min 7% B 4 min 5% B 47.1 min, 流速.25 ml/min 42 min, 流速.5 ml/min 42.1 min, 流速.25 ml/min 65 min 5% B, 流速.5 ml/min 49 min % B 65.1 min, 流速.25 ml/min 43 min, % B 51 min % B 68 min % B 48 min % B 51.1 min 75% B, 73 min % B 流速.25 ml/min 5 min 85% B 5.1 min, 流速.25 ml/min 52. min, 流速.5 ml/min 74 min 85% B, 流速.25 ml/min 51 min, 流速.5 ml/min 75. min, 流速.5 ml/min 停止时间 : 51 min 52 min 75 min 后运行时间 : 2 min 2 min 2 min 进样量 : 5 µl 1 µl 1 µl 温控自动 5 C 进样器 : 柱温 : 6 C FLD: 激发 = 26 nm, 发射 = 43 nm 峰宽 : >.13 min(.25 s 响应时间 )(37.4 Hz) N- 糖链卵清蛋白的详细信息 峰 Oxford 结构 1 A2G2S1 2 3 A2G2S2 4 A3GGS2 5 A3G3S3 A3G3S2( 痕量 ) 6 A3G3S3 A3G3S2( 痕量 ) 7 A3G3S3 A3G3S4( 痕量 ) 8 A3G3S4 A3G3S3 9 A3G3S4 岩藻糖半乳糖甘露糖 N- 乙酰氨基葡萄糖胺 N- 乙酰神经氨酸 118

121 糖基化表征 N- 糖链标准品安捷伦提供在工作流程中确保样品前处理及液相色谱系统最佳性能所必须的参比材料 IgG N- 连接糖链标准品及阶梯葡聚糖标准品 这两种标准品均有 2-AB 标记形式和未标记形式, 其中未标记 2-AB 的标准品可作为样品前处理的参比材料 IgG N- 连接糖链标准品用于每批次 AdvanceBio 糖谱分析填料的 QA 测试, 以确保每根色谱柱均可满足分析所需的严格重现性要求 阶梯葡聚糖标准品用于基于葡萄糖单元 (GU) 在同系列化合物中的洗脱时间对系统进行校正, 还用于报告 GU 的相对保留数据 分离 2-AB 标记的阶梯葡聚糖标准品 色谱柱 : AdvanceBio 糖谱分析色谱柱 x 15 mm, 1.8 µm 流动相 : A:1 mm 甲酸铵,pH 4.5 B:ACN FLD: 激发 = 26 nm, 发射 = 43 nm 进样量 : 2 µl(1 pmol 总多糖 /1 µl 75:25 ACN: 水 ) 样品 : 安捷伦 2-AB( 部件号 ) 标记的阶梯葡聚糖标准品 时间 %A %B 流速 (ml/min) 该分析采用安捷伦阶梯葡聚糖标准品以及 AdvanceBio 糖谱分析色谱 柱进行未知多糖的保留时间校正 min UHPLC/HPLC 119

122 糖基化表征 N- 糖链样品前处理产品 N- 连接糖链分析的样品前处理过程包括多个步骤, 必须仔细控制处理方法, 才能获得准确 精密的多糖鉴定和定量结果 安捷伦提供一套完整的流程, 其囊括了样品前处理工作流程中的各个要素, 有效简化了整个处理过程 变性和去糖基化 可处理 24 个样品 : 可处理 96 个样品 : 用于去除蛋白质的纯化小柱 可处理 24 个样品 : 可处理 96 个样品 : 裂解多糖的 2-AB 标记 可处理 24 个样品 : 可处理 96 个样品 : 用于去除多余的试剂的纯化小柱 可处理 24 个样品 : 可处理 96 个样品 : 完整的样品前处理工作流程 可处理 24 个样品 :519-8 可处理 96 个样品 : 可处理 24 或 96 个样品的样品前处理产品 12

123 糖基化表征 AdvanceBio 糖谱分析色谱柱,1.8 µm, 最高耐压 12 bar 粒径 (mm) 部件号 2.1 x x µm, 快速保护柱 AdvanceBio 糖谱分析色谱柱,2.7 µm, 表面多孔, 最高耐压 12 bar 粒径 (mm) 部件号 4.6 x x x x x x µm, 快速保护柱 N- 糖链标准品 说明 部件号 阶梯葡聚糖标准品,1 µg,.5 ml 样品瓶装 AB 标记的阶梯葡聚糖标准品,2 pmol IgG N- 连接糖链文库,2 µg,.5 ml AB 标记的 IgG N- 连接糖链文库,2 pmol UHPLC/HPLC 121

124 糖基化表征 N- 糖链样品前处理产品 说明 AdvanceBio N- 糖链样品前处理试剂盒, 可处理 24 个样品 包括部件号为 和 的产品, 可对 24 个糖蛋白样品进行完全去糖基化, 并对其裂解所得的 N- 糖链进行 2-AB 标记 部件号 AdvanceBio N- 糖链去糖基化试剂盒, 可处理 24 个样品 AdvanceBio N- 糖链去糖基化纯化小柱, 可处理 24 个样品 AdvanceBio 2-AB 糖链标记试剂盒, 可处理 24 个样品 AdvanceBio 2-AB 糖链标记纯化小柱, 可处理 24 个样品 AdvanceBio N- 糖链样品前处理试剂盒, 可处理 96 个样品 包括部件号为 和 的产品, 可对 96 个糖蛋白样品进行完全去糖基化, 并对其裂解所得的 N- 糖链进行 2-AB 标记 AdvanceBio N- 糖链去糖基化试剂盒, 可处理 96 个样品 AdvanceBio N- 糖链去糖基化纯化小柱, 可处理 96 个样品 AdvanceBio 2-AB 糖链标记试剂盒, 可处理 96 个样品 AdvanceBio 2-AB 糖链标记纯化小柱, 可处理 96 个样品 去糖基化和标记用 96 孔板

125 糖基化表征 亲水性多肽及糖肽分析 多肽分析需要反相色谱才能实现的高选择性及分析间重现性 但是, 反相色谱柱对于亲水性多肽 ( 包括糖肽 ) 的保留性和选择性均有限 与反相色谱柱相比,ZORBAX RRHD 3-HILIC,1.8 µm 色谱柱可提高亲水性多肽和糖肽的保留性, 因此使用它进行肽谱分析不会丢失重要信息 这两种技术是正交的, 可为蛋白质的一级结构分析提供互补信息 ZORBAX 3Å 填料可用于分析各种大小的多肽 1.8 µm 粒径填料可实现 UHPLC 性能, 在 12 bar 下仍具有稳定性 配合 ZORBAX RRHD 3Å 反相色谱柱使用可提供 UHPLC 正交性 色谱柱性能指标 键合相内径 (mm) 填料粒径 (µm) 封端 ph 稳定性运行温度压力限 硅胶 , 全多孔否 C 12 bar 肽谱分析常用于蛋白质生物治疗药物的表征和杂质分析 通常采用反相 UHPLC/HPLC, 但当酶解物含有亲水性多肽 ( 例如糖肽 ) 时, 采用该分析方法可能会丢失一些重要信息 ZORBAX RRHD 3-HILIC 色谱柱可保留亲水性多肽, 与质谱联用时还可对这类重要的蛋白质片段进行鉴定 UHPLC/HPLC 123

126 糖基化表征 蛋白质胰酶酶解物中的糖肽鉴定 色谱柱 : 流动相 : 流速 : ZORBAX RRHD 3-HILIC x 1 mm, 1.8 µm A:1% ACN B:5 mm 甲酸铵,pH ml/min 进样 : 5 µg 检测器 : 仪器 : 样品 : UV,28 nm Agilent 129 Infinity 液相色谱 Agilent 6224 精确质量数 TOF-MS 安捷伦双 ESI 源 ( 正离子模式 ) 来自 EPO 蛋白酶解物的糖肽 (1 mg/ml) 图 UV 示出了使用 ZorBAX rrhd 3-HIlIC 2.1 x 1 mm 色谱柱分离红细胞生成素 (EPO) 的肽谱, 图 质谱 示出了匹配 EPO 的提取化合物色谱图 HIlIC-MS 数据鉴定出了 RP-MS 未能鉴定出来的七种多肽 HIlIC 是 RP 的正交技术, 可为蛋白酶解物中的亲水性多肽提供额外的分离度 UV 质谱 mau 梯度时间 %A %B x min Agilent ZORBAX RRHD 3-HILIC 1.8 µm 色谱柱 说明 内径 (mm) 填料粒径 (µm) 部件号 ZORBAX RRHD 3-HILIC 2.1 x ZORBAX RRHD 3-HILIC 2.1 x

127 滴度测定 滴度测定 亲和色谱是一种利用特定蛋白之间 ( 如抗原 / 抗体 ) 高度特异性分子间相互作用的强大分离技术 安捷伦提供几种专门的亲和产品, 适用于对 IgG 进行分离和定量的整体 Protein A 柱, 以及用于去除生物样品中高丰度蛋白的一系列多重亲和去除系统产品 安捷伦 Bio-Monolith Protein A 液相柱 专为除 3 型 IgG 以外的所有 IgG( 人和鼠 ) 的分析型分离而设计 Bio-Monolith 蛋白 A 柱, 分离不依赖于流速离 ; 无扩散 无孔隙 无死体积, 使得流动相和固定相之间的传质非常迅速 极快的分离速度加速了方法开发, 降低了成本 锁定方法开发参数明显缩短了时间, 减少了缓冲液用量 Agilent Bio-Monolith Protein A HPLC 色谱柱是安捷伦 Bio-Monolith 色谱柱系列产品之一 Protein A Bio-Monolith 色谱柱可兼容 HPLC 系统和制备型液相色谱系统 ( 包括 Agilent 和 126 生物惰性四元液相色谱系统 ) 提示与工具有关 mab 结合的耐盐性以及 Agilent Bio-Monolith Protein A 色谱柱 mab 洗脱酸性缓冲液兼容性的更多信息, 请参阅出版物 CHCN UHPLC/HPLC 125

128 滴度测定 色谱柱性能指标 尺寸 5.2 mm x 4.95 mm 柱体积 1 µl 最高耐压 15 bar (15 MPa, 22 psi) 最低 / 最高温度 工作温度 :2-4 贮存温度 :2-8 推荐 ph 工作范围 :2-13 冲洗顺序 :1-14 柱管材料 硬件 : 不锈钢 填料 : 聚 ( 甲基丙烯酸甘油酯 - 二甲基丙烯酸乙二醇酯 ) 高孔隙率整体柱 色环识别标记 Bio-Monolith 蛋白质 A: 白色 保存期 / 有效期 Protein A 亲和色谱柱 :12 个月 Bio-Monolith Protein A 色谱柱 说明 主要应用 部件号 Bio-Monolith Protein A Protein A 亲和色谱柱适用于 IgG1 和 IgG2( 人和鼠 ) 的分析分离 IgG 的定量测定 ( 发酵单位效价的计算 ) 提示与工具 更多信息可参考 : mab Titer Analysis with the Agilent Bio-Monolith Protein A Column( 使用 Agilent Bio-Monolith Protein A 色谱柱进行单克隆抗体滴度分析 ), 出版号 EN Agilent Bio-Monolith Protein A Monitors Monoclonal Antibody Titer from Cell Cultures ( 采用 Agilent Bio-Monolith Protein A 色谱柱监测细胞培养液中的单克隆抗体滴度 ), 出版号 EN Cell Clone Selection Using the Agilent Bio-Monoltih Protein A Column and LC/MS ( 使用 Agilent Bio-Monolith Protein A 色谱柱和 LC/MS 进行细胞克隆选择 ), 出版号 EN Cell Culture Optimization Using an Agilent Bio-Monolith Protein A Column and LC/MS ( 使用 Agilent Bio-Monolith Protein A 色谱柱和 LC/MS 优化细胞培养 ), 出版号 EN

129 滴度测定 人源化单克隆抗体的快速测定 色谱柱 : Bio-Monolith Protein A x 4.95 mm, µm 流动相 : A:5 mm 磷酸盐,pH 7.4 B:1 mm 柠檬酸,pH 2.8 流速 : 1 ml/min 进样量 : 可变 (5 µl 针对含 IgG1 的 CHO 细胞培养物上清液的优化进样体积 ) 梯度 : 时间 (min) %A %B 柱温 : 检测器 : 馏分收集 : 样品 : 室温 UV,28 nm 基于时间 IgG1 (1-2 mg/ml) 和含 IgG1( 总蛋白浓度最高可达 2 mg/ml) 的 CHO 细胞上清液 结合 洗脱 再平衡 精度保留时间 (min) 峰面积 峰面积 9 8 A R 2 = 浓度 (mg/ml) B 平均值 S %RSD R 2 =.999 峰面积 1 8 IgG1 改性人源化赫赛汀的校准曲线 ( 图 A:-2 mg/ml, 图 B:25-2 mg/ml) 浓度 (mg/ml) 关键点 : 第 1 道 : 分离之前的全血清第 2 道 :IgG 标准品第 3 道 : 峰 1( 流通组分 ) 第 4 道 : 峰 2(Protein A 结合组分, 即 IgG1) 分离组分的 SDS PAGE 分析 UHPLC/HPLC 127

130 滴度测定 高流速对结合效率没有影响 色谱柱 : Bio-Monolith Protein A x 4.95 mm, µm 流动相 : A:2 mm 磷酸钠缓冲液,pH 7.4 B:.1 M 柠檬酸,pH 2.8 流速 : 和 2. ml/min 梯度 : % B 保持.5 min, min 内 B 从 % 升至 1%, min 内 B 降至 % 柱温 : 25 C 进样 : 4 µl(2.5 mg/ml 的 IgG1 加标 2 mg/ml E.coli 的上清液 ) 检测器 : 样品 : 仪器 : UV,28 nm 人源化 IgG1 和 E.coli 裂解液 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱 吸光度 (UV,28 nm) mau E. coli 蛋白质 ( 未结合 ) 8 6 IgG1 2. ml/min 4 IgG1 1.5 ml/min 2 IgG1 1. ml/min 在多种流速条件下评估 IgG1 与 Agilent Bio-Monolith Protein A 色谱柱的结合度 本实验增加了上样量以便更容易地观察色谱图和信号积分的变化 流速与未结合蛋白质和 IgG1 相对峰面积的关系 流速 (ml/min) 未结合的峰面积 (mau/s) IgG1 峰面积 (mau/s) 未结合蛋白质的 相对峰面积 (%) IgG1 的相对峰面积 (%) 压力 (bar)

131 蛋白质去除 蛋白质去除 为了更方便地对生物样品 ( 如血清 血浆和脑脊液 (CSF)) 中的蛋白质进行分离和鉴定, 安捷伦的多重亲和去除系统 (MARS) 特别采用了能够通过色谱方法去除生物样品中干扰性高丰度蛋白质的设计 去除这些高丰度蛋白质有助于改善样品的后续 LC/MS 分析和电泳分析, 有效地扩展了动态范围 安捷伦蛋白质分级分离系统和蛋白质组学试剂 生物样品的 LC/MS 分析 电泳分析的准备 生物标志物研究的样品制备 仪器和工作流程验证 经济实惠的免疫去除 样品脱盐 浓缩和分馏针对样品的分馏和脱盐, 安捷伦设计了 mrp-c18 高回收蛋白柱, 仅通过一个简单的步骤即可同时完成脱盐 浓缩和分馏, 与完全兼容 LC/MS 分析的常规 RP-HPLC 相比, 具有极高的样品回收率 另外, 安捷伦还提供生物标志物研究中样品制备和其他蛋白质组学应用的验证试剂, 包括复杂标准品和蛋白质组学级胰蛋白酶 为便于使用, 这些试剂均与安捷伦 LC/MS 方法完全兼容, 无需任何额外的样品预处理 我们的定制配置还可以满足您的大体积进样需求和定制其他色谱柱规格 UHPLC/HPLC 129

132 蛋白质去除 多重亲和去除系统 利用安捷伦的多重亲和去除系统, 可以对血清 血浆和其他生物液体中高价值 低丰度的蛋白质和生物标志物进行鉴定和表征 多重亲和去除系统能够可重现且特异性地去除人的生理体液中多达 14 种高丰度蛋白质, 以及小鼠生理体液中的 3 种高丰度蛋白质 多重亲和去除系统 多重亲和去除系统可以使用各种规格的液相柱和离心小柱 安捷伦多重亲和去除系统与安捷伦优化的缓冲液 方便的离心过滤膜和浓缩器结合在一起, 形成了一个自动化的一体式蛋白质去除解决方案, 可以与大多数液相色谱仪 ( 色谱柱 ) 和台式离心机 ( 离心小柱 ) 兼容 使用多重亲和去除系统纯化的样品可直接用于各种下游分析, 如二维凝胶电泳 LC/MS 以及其他分析技术 提示与工具 有关如何缩短亲和色谱分析周期的详细信息, 请参阅 : Reducing Cycle Time for Affinity Removal of High-Abundant Proteins in Human Plasma ( 缩短人血浆中高丰度蛋白质亲和去除的分析周期 ) Alternating Column Regeneration Using an Agilent 12 Infinity Series Quick-Change Bio-inert 2-position/1-port Valve and an Agilent 129 Infinity Flexible Cube( 采用 Agilent 12 Infinity 系列快速切换生物惰性 2 位 /1 通阀和 Agilent 129 Infinity Flexible Cube 进行交互柱再生 ), 出版号 EN

133 蛋白质去除 多重亲和去除系统选择指南 产品去除的蛋白质去除的总蛋白规格载样量部件号 MARS Human-14 白蛋白 IgG 抗胰蛋白酶 IgA 转铁蛋白 结合珠蛋白 纤维蛋白原 α2- 巨球蛋白 α1- 酸糖蛋白 IgM 载脂蛋白 Al 载脂蛋白 All 补体蛋白 C3 甲状腺运载蛋白 MARS Human-7 MARS Human-6 MARS Human-6 高容量 白蛋白 IgG IgA 转铁蛋白 触珠蛋白 抗胰蛋白酶和纤维蛋白原 白蛋白 IgG IgA 转铁蛋白 触珠蛋白 抗胰蛋白酶 白蛋白 IgG IgA 转铁蛋白 触珠蛋白 抗胰蛋白酶 94% 离心小柱 8-1 µl x 5 mm 2 µl x 1 mm 4 µl x 1 mm 25 µl % 离心小柱 µl x 5 mm 3-35 µl x 1 mm 6-7 µl x 1 mm 25-3 µl % 离心小柱 7-1 µl x 5 mm 15-2 µl x 1 mm 3-4 µl % 离心小柱 µl x 5 mm 3-4 µl x 1 mm 6-8 µl x 1 mm 最多 34 µl MARS Human-2 白蛋白,IgG 69% 离心小柱 5 µl x 5 mm 1 µl MARS Human-1 白蛋白 5-55% 离心小柱 65 µl x 5 mm 13 µl MARS Mouse-3 白蛋白 IgG 转铁蛋白 8% 离心小柱 25-3 µl x 5 mm 37-5 µl x 1 mm 75-1 µl UHPLC/HPLC 131

134 蛋白质去除 用安捷伦多重亲和去除色谱柱和离心小柱去除高丰度蛋白 转铁蛋白纤维蛋白原 IgA 触珠蛋白 α1- 抗胰蛋白酶 补体蛋白 C3 α1- 酸糖蛋白 IgG α2- 巨球蛋白 白蛋白 15% 载脂蛋白 AI 剩余 6% 用于分析 载脂蛋白 AII IgM 转甲状腺素蛋白 提示与工具 请访问 了解安捷伦完整的服务系列产品的更多信息 132

135 蛋白质去除 多重亲和去除系统启始试剂盒 液相色谱柱和离心小柱试剂启始工具包包括多重亲和去除系统所需要的所有备件 这些 缓冲液为实现较长的色谱柱使用寿命和样品重现性提供了最佳条件 液相柱启始试剂盒, 该工具包提供足够的缓冲液 A 和缓冲液 B, 能满足使用 4.6 x 5 mm 液相色谱柱时约 2 个样品的消耗量 使用 4.6 x 1 mm 液相色谱柱时约 1 个样品的消耗量, 以及 使用 2 个离心小柱的缓冲液消耗量 缓冲液 A( 上样缓冲液 ) 能够最大限度减少蛋白质与蛋白质之间的相互作用, 使得与高丰度蛋白质相结合的低丰度蛋白质能够穿过色谱柱, 同时目标高丰度蛋白质可结合到其相应的抗体上 缓冲液 B( 洗脱缓冲液 ) 能够破坏抗体与蛋白质之间的相互作用, 将高丰度蛋白质从色谱柱上洗脱下来 Luer-Lok 注射器, 多重亲和去除系统启始试剂盒说明液相柱启始试剂盒包括 : 部件号 Luer-Lok 接头, 缓冲液 A, 用于载样 冲洗和平衡,1 L 缓冲液 B, 用于洗脱,1 L µm 醋酸纤维素,25/ 包,1 L 离心浓缩器 (concentrators),5k MWCO,4 ml,25 / 包 多重亲和去除离心小柱试剂盒 包括 : 缓冲液 A, 用于载样 冲洗和平衡,1 L 缓冲液 B, 用于洗脱,1 L 离心滤膜,.22 µm 醋酸纤维素,25/ 包,2 个 离心浓缩器 (concentrators),5k MWCO,4 ml,25 / 包 Luer- 锁定接头,2/ 包 塑料注射器,5 ml,luer-lok,2/ 包 微量管,1.5 ml, 螺纹口,1 / 包,6 个 盖和塞,6 / 包 PTFE 针头,Luer-Lok,1/ 包 高浓度样品稀释缓冲液,5 ml Luer-Lok 针头, UHPLC/HPLC 133

136 特殊规格色谱柱 特殊规格色谱柱 毛细管柱和纳流柱 用最少的样品量获得最高灵敏度 纳流柱 可兼容各种 LC/MS 接口 提供 和.75 mm 内径供您选择 3Å 孔径, 适用于生物分子分析 一维和二维 ( 蛋白质组学 ) 应用的理想选择 Agilent ZORBAX 毛细管柱 (.5 和.3 mm 内径 ) 和纳流柱 (.1 和.75 mm 内径 ) 有多种固定相和色谱柱尺寸可选 这些色谱柱对于样品量非常有限的应用是非常理想的选择, 因为它们通过减少柱上样品的稀释提高了灵敏度 如果您将安捷伦色谱柱与 Agilent 129 Infinity LC 等低扩散 HPLC 仪器结合使用, 不仅可以实现高灵敏度, 同时还能获得优异的重现性 毛细管柱和纳流柱发展最快的应用是用二维 LC/MS 分析复杂蛋白质组学样品 安捷伦提供二维分离所需的各种色谱柱和仪器 用于一维分离的 SCX 色谱柱 反相捕集柱, 以及用于二维分离的反相色谱柱 提示与工具安捷伦提供各种网上在线讲座和现场培训, 有助于您了解如何成为更出色的色谱分析工作者 如需更多信息, 请访问

137 特殊规格色谱柱 蛋白质酶解物的高灵敏度 LC/MS 分析 色谱柱 : 流动相 : 流速 : 梯度 : 检测器 : 样品 : ZORBAX 3SB-C x 15 mm, 3.5 µm A: 水 +.1% 甲酸 B: 乙腈 +.1% 甲酸 6 nl/min 25 min 内 2% B 到 52% B 正离子纳流电喷雾 MS 1 fm (1 µl) 8 种蛋白质的酶解物 Intens 采用 ZORBAX 纳流 HPLC 色谱柱 ( 内径.75 mm) 对蛋白质酶解样品进行高灵敏度的 LC/MS 分析 (min) LCSB8 毛细管柱的高灵敏度分析色谱柱 : ZORBAX SB-C x 15 mm, 5 µm 色谱柱 : 色谱柱 : 色谱柱 : 样品 : ZORBAX SB-C x 15 mm, 5 µm ZORBAX SB-C x 15 mm, 3.5 µm ZORBAX SB-C x 15 mm, 5 µm 2 ng 联苯 mau 14.3 mm mm mm 4.6 mm (min) LCCN2 对于样品量有限的应用, 为最大限度减少柱上样品稀释 提高灵敏度, 需要使用毛细管色谱柱 在这个例子中,.3 mm 的毛细管色谱柱与标准的 4.6 mm 色谱柱相比, 灵敏度提高了 1 倍 在样品量极为有限的应用中, 使用安捷伦纳径柱 (.1 mm 到.75 mm 内径 ) 可将灵敏度提高达 2 倍 UHPLC/HPLC 135

138 特殊规格色谱柱 人血清 : 利用 LC/MS 分离和鉴定一维凝胶条带上的低丰度蛋白 色谱柱 : 流动相 : 流速 : 梯度 : ZORBAX 3SB-C18 富集柱 :.3 x 5 mm, 5 µm, 分析柱 :.3 x 15 mm, 5 µm, A: 水 +.1% 甲酸 B: 乙腈 +.1% 甲酸 6 µl/min min 3% B 5 min 3% B( 进样 ) 5 min 45% B 52 min 8% B 57 min 8% B 6 min 3% B 基峰色谱图强度 x 鉴定出的蛋白 1. α-1- 抗胰蛋白酶 2. 抗凝血酶 -III 前体 3. 补体因子 B 前体 样品 : 一维凝胶条带酶解物 1 人血清样品前处理 : 使用多重亲和去除柱除去主要的血清蛋白质 : 4.6 x 1 mm, 部件号 然后进行一维凝胶消解 (min) LCBP14 利用毛细管液相色谱柱进行多肽磷酸化位点的 LC 和 LC/MS 分析 色谱柱 : 流动相 : 流速 : ZORBAX 3SB-C x 15 mm, 3.5 µm A: 水 +.1% 甲酸 B: 乙腈 +.1% 甲酸 5.5 µl/min 梯度 : B 在 5 分钟内由 6% 升至 8%, B 在 分钟内保持 85% 检测器 : UV,26 nm MS 条件 : LC/MS: 正离子化模式 ESI 和 LC/MSD 离子阱 电压 : 4, V 干燥气流速 : 7 L/min 干燥气温度 : 25 C 雾化器压力 : 15 psi 毛细管出口电压 : 5 V 最大累加时间 : 3 ms 总平均值 : 3 分离峰宽 : 3 m/z 裂解电压振幅 : 1. V 样品 : 1 nl (4 pmol) β- 酪蛋白酶解物 % 相对丰度 UV 26 nm MS x UV 磷酸肽 Time (min) Time (min) % 相对丰度 % 相对丰度 全扫描 MS x m/z 132 处 [M+2H] 2+ 的 MS/MS 结果 x [MH 2-H 2PO 4] 2+ [MH 2-H 2] m/z m/z LCBP

139 特殊规格色谱柱 适用于 HPLC 分析配合 UV 和 MS 检测的毛细 管柱 色谱柱 : ZORBAX 3SB-C x 15 mm, 5 µm 流动相 : 5 min 内 B 从 5% 升至 55%, min 内 B 升至 85% A: 水 +.1% 甲酸 B: 乙腈 +.1% 甲酸 流速 : 5.5 µl/min UV 26 nm UV 检测器 : UV,26 nm MS 条件 : LC/MS: 正离子化模式 ESI 和 LC/MSD 离子阱, 电压 4 V 干燥气流速 : 7 L/min 干燥气温度 : 25 C 雾化器压力 : 15 psi 毛细管出口电压 : 5 V 最大累加时间 : 3 ms 总平均值 : 3 分离峰宽 : 3 m/z 裂解电压振幅 : 1. V % 相对丰度 2 x MS (min) 样品 : 1 nl (4 pmol) β- 酪蛋白酶解物.2 用 ZORBAX 3SB-C18 毛细管柱 (.3 mm 内径 ) 分离蛋白裂解液可以采用 UV 和电喷雾质谱检测 质谱检测可以用于多肽片段的鉴定 (min) LCSB7 UHPLC/HPLC 137

140 特殊规格色谱柱 用纳流液相色谱柱和二维 HPLC 系统分离复杂样 品中的蛋白质 色谱柱 : 色谱柱 : ZORBAX 3SB-C x 5 mm, 5 µm ZORBAX 3SB-C x 15 mm, 3.5 µm 流动相 : 四元泵 :3% 乙腈 :.1% 甲酸纳流泵 : A: 水,.1% 甲酸,B: 乙腈,.1% 甲酸 流速 : 梯度 : MS 条件 : 四元泵 :3 µl/min 纳流泵 :3 nl/min 四元泵 : 等梯度纳流泵 : 6 min = 3% B;12 min = 6% B;125 min = 8% B; 13 min = 8% B;131 min = 3% B;14 min = 3% B 离子源 : 纳升 ESI, 干燥气流速 :5 L/min, 干燥气温度 :225 C 离子阱 : 锥孔电压 :1:35 V, 毛细管出口补偿 :115 V, 八极杆 1:12 V, 八极杆 2:3.5 V, 离子阱驱动电压 : 8 V. ICC: 开启, 平均 :4, 最大累加时间 :15 ms; 靶标 6., 正离子模式,MS/MS 模式 样品 : 牛血清白蛋白的胰蛋白酶酶解物体积 :1-8 µl 盐浓度梯度洗脱 :8 ml 1 mm-1 mm KCl (1 mm 递增 ),125 mm 15 mm 2 mm 3 mm 5 mm 1 M x x x x (min) 3 mm KCl 6 mm KCl 75 mm KCl 12 mm KCl LCCN4 牛血清白蛋白 (BSA) 的胰蛋白酶酶解物 基峰色谱图显示了从二维 HPLC 分离结果中挑选出的一部分组分 单个色谱图展示了采用一定的盐浓度洗脱 BSA 酶解产物 ( 多肽 ), 然后进行富集和反相色谱分析的结果 138

141 特殊规格色谱柱 ZORBAX Bio-SCX 系列 II 纳流柱 ZORBAX Bio-SCX 系列 II 色谱柱适用于多肽和蛋白质的优化 LC/MS 分离 此填料基于超纯 3.5 µm ZORBAX 硅胶颗粒, 键合具有磺酸基团的生物友好聚合物 因此, 在多肽和蛋白质 二维分析的离子交换步骤中, 该填料能够提供更强的保留性和良好的峰形 HPlC Column Specifications 键合相孔径比表面积 ph 范围官能团最高压力 ZORBAX Bio-SCX 系列 II 3Å 9 m 2 /g 磺酸 35 bar 对小分子肽的保留性能更强 色谱柱 : 流动相 : 流速 : 检测器 : 样品 : ZORBAX Bio-SCX 系列 II x 35 mm, 3.5 µm 95% 4 mm NaCl:5% 乙腈,.3% 甲酸 5 µl/min UV,23 nm 合成二肽 ZORBAX Bio-SCX 系列 II 色谱柱与其他 SCX 柱相比, 对小分子肽的保留性能更强 因此其对更亲水的多肽片段具有更强的分离性能, 并且此类色谱柱用于二维 HPLC 分析时可得到更准确的鉴定结果 mau 4 2 mau (min) Trp - Tyr 2. Mct - Trp (min) LCIE2 UHPLC/HPLC 139

142 特殊规格色谱柱 ZORBAX HPLC 毛细管柱 ( 玻璃内衬不锈钢 ) 说明 规格 (mm) 填料粒径 (µm) 3SB-C18 3SB-C8 Poroshell 3SB-C8 3Extend-C18 Bio-SCX 系列 II 毛细管柱.8 x 毛细管柱.5 x 毛细管柱.5 x 快速分离毛细管柱.5 x 毛细管柱.5 x 毛细管柱.5 x 快速分离毛细管柱.5 x 毛细管柱.3 x 毛细管柱.3 x 毛细管柱.3 x 毛细管柱.3 x 快速分离毛细管柱.3 x 快速分离毛细管柱.3 x 快速分离毛细管柱.3 x 快速分离毛细管柱.3 x 可更换的筛网,1/ 包 ZORBAX 纳流液相柱 (PEEK) 说明 规格 (mm) 填料粒径 (µm) 3SB-C18 USP L1 3SB-C8 USP L7 快速分离纳流柱.1 x 快速分离纳流柱.75 x 快速分离纳流柱.75 x 富集 / 保护柱,5/ 包.3 x 富集 / 保护柱卡套 ZORBAX 3SB-C18 富集 / 保护柱,

143 特殊规格色谱柱 微径 (1. mm 内径 ) 柱 对于样品量很少的分析具有高灵敏度 与 LC/MS 接口兼容 空间位阻的 3StableBond 键合固定相 各种各样的键合相 硅胶和聚合物填料 当样品量有限时, 安捷伦 ZORBAX 微径 (1. mm 内径 ) 色谱柱常常是很好的选择 与 2.1 mm 内径色谱柱相比, 如果使用相同的样品量, 这种色谱柱可将检测限降低 5 倍 这一灵敏度的增加至关重要 微径色谱柱使用低流速 ( 通常约 5 µl/min) 所以, 对于诸如质谱以及毛细管液相色谱系统这样需要低流速的检测器来说, 这些色谱柱是其理想选择 微径色谱柱与微径 UHPLC/HPLC 系统配套使用时可获得最佳性能 提供多种可在高达 4 bar 条件下使用的键合相, 包括 StableBond 3SB-C18 3SB-C8 和 Poroshell 柱 聚合物型反相柱 PLRP-S 以及离子交换型 PL-SAX 和 PL-SCX 也适用于需要极其稳定的大孔径填料的应用 现在还提供具有可调管深度接头的保护柱, 从而保证每次连接时死体积都为零 胰蛋白酶酶解物的分离 色谱柱 : ZORBAX 3SB-C x 15 mm, 3.5 µm 流动相 : 梯度 :6 min 内 B 从 2% 升至 6% A:.1% TFA B:.75% TFA:8% ACN 流速 : 5 µl/min 柱温 : 5 C 检测器 : 样品 : UV,215 nm 2 µl rhgh 的胰蛋白酶酶解物 这个用微径柱分离胰酶裂解产物的实例表明,1. mm 内径柱可以实现高灵敏度和高分离度 (min) LCMB1 UHPLC/HPLC 141

144 特殊规格色谱柱 用微径 HPLC 实现高灵敏度多肽分析 色谱柱 : PLRP-S 1Å 5 µm, 15 mm x 各种内径 流动相 : A:.1 M tris HCl,pH 8 B:A +.35 M NaCl,pH 8 流速 : 1 ml/min 色谱峰鉴别 梯度 : 15 分钟内 2% ACN,.1% TFA 到 5% ACN,.1% TFA 线性梯度洗脱 进样量 :.5 µl 样品浓度 : 检测器 :.25 mg/ml UV,22 nm 用安捷伦 PLRP-S 1Å 5 µm 柱进行多肽分离 A. 1. mm 内径 ( 流速 47 µl/min) B. 2.1 mm 内径 ( 流速 2 µl/min) C. 4.6 mm 内径 ( 流速 1 ml/min) 1. 催产素 2. 血管紧张素 II 3. 血管紧张素 I 4. 胰岛素 色谱峰鉴别 1. mm 2.1 mm 4.6 mm A B C min 8 胰岛素 催产素 血管紧张素 II 血管紧张素 I 峰面积 峰面积 峰面积 峰面积 浓度 (ng) 浓度 (ng) 浓度 (ng) 浓度 (ng) Agilent PLRP-S 柱的标准曲线数据点折线图 色谱柱内径的减小可使检测限降低, 并能实现更少量样品的定量 142

145 特殊规格色谱柱 微径柱 (1. mm 内径 ) 说明 规格 (mm) 填料粒径 (µm) 3SB-C18 USP L1 3SB-C8 USP L7 微径柱 1. x 快速分离微径柱 1. x 快速分离微径柱 1. x 微径保护柱,3/ 包 1. x 说明 规格 (mm) 填料粒径 (µm) Poroshell 3SB-C18 Poroshell 3SB-C8 Poroshell 3SB-C3 Poroshell 3Extend-C18 微径柱 1. x 微径保护柱,3/ 包 1. x 说明 规格 (mm) 填料粒径 (µm) PLRP-S 1Å USP L21 PLRP-S 3Å USP L21 PLRP-S 1Å USP L21 PLRP-S 4Å USP L21 微径柱 1. x 15 3 PL 微径柱 1. x 5 8 PL PL 微径柱 1. x 5 5 PL PL PL PL 微径柱 1. x 5 3 PL PL PL-SAX PL-SAX PL-SCX PL-SCX 说明 规格 (mm) 填料粒径 (µm) 1Å 4Å 1Å 4Å 微径柱 1. x 5 5 PL PL PL PL UHPLC/HPLC 143

146 特殊规格色谱柱 二维液相色谱 将两种正交的液相色谱技术结合到一种分析方法中 即使与 UHPLC 方法相比也可提供更出色的峰容量 将体积排阻与离子交换方法结合到 MS 中生物分子的异质性和复杂性使目标生物药物的鉴定和表征需要应用多种 LC 技术 在一种分析方法中结合两种正交的技术 ( 如亲水相互作用色谱和反相色谱, 或阳离子交换色谱和反相色谱 ), 可以获得出色的分离能力, 帮助您鉴定和分析关键质量属性 二维液相色谱的应用范围包括 Protein A 色谱柱捕获的单克隆抗体馏分的简单在线脱盐, 以及通过连接亲水相互作用与反相肽谱分析方法对亲水性 糖基化和疏水性多肽片段进行全谱表征 采用二维液相色谱能够缩短分析时间并最大化数据生成 / 解析效率, 从而提高分析效率 : 方法筛查与应用切换 离线色谱柱再生 在线杂质分析 中心切割二维液相色谱 全二维液相色谱 离线色谱柱再生 要通过离子交换液相色谱实现稳定的电荷异构体分析, 就必须进行充分的色谱柱净化与平衡 然而这一过程会增加分析的总时间, 因此我们需要采取措施缩短色谱柱净化与平衡时间以提高样品通量 其中一种方法是采用离线色谱柱再生, 该方法已被证实最多可缩短 4% 的分析周期 144

147 特殊规格色谱柱 色谱柱 1 Agilent 126 四元泵 1 检测器 Agilent 126 四元泵 2 自动进样器 色谱柱 2 废液口 上面的示意图展示了采用 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元梯度液相色谱以及 2 根 Agilent Bio MAb PEEK,2.1 x 25 mm 色谱柱进行 mab 电荷异构体分析时离线色谱柱再生所需的阀排列情况 保留时间和峰面积的柱内 (n = 6) 和柱间 (n = 12) 精确度 柱内保留时间 % RSD 柱内峰面积 % RSD 柱间保留时间 % RSD 柱间峰面积 % RSD CV CV CV CV CV CV Agilent Bio MAb PEEK 色谱柱的离线再生获得了良好的保留时间和峰面积柱内和柱间精确度 柱内 (n = 6) 和柱间 (n = 12) UHPLC/HPLC 145

148 特殊规格色谱柱 全二维液相色谱 废液口 二维泵 Agilent 129 Infinity 二元泵 Agilent 129 Infinity 柱温箱 Agilent 129 Infinity 自动进样器 一维色谱柱 Agilent ZORBAX RRHD 3-HILIC 二维色谱柱 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 Agilent 653 精确质量 Q-TOF LC/MS 系统 一维泵 Agilent 129 Infinity 二元泵 一维 DAD Agilent 129 Infinity 二极管阵列检测器 1 一维泵到自动进样器 校准毛细管 (G ) 2 自动进样器到一维色谱柱 (1.6 µl 热交换器 ) 不锈钢,.17 mm 3 三通 1 到二维液相色谱阀 不锈钢,.12 x 2 mm 4 三通 1 到一维 DAD 不锈钢,.12 x 14 mm 5 二维泵到二维液相色谱阀 不锈钢,.17 mm 6 二维液相色谱阀到二维色谱柱 (1.6 µl 热交换器 ) 不锈钢,.12 x 27 mm 7 三通 2 到废液口 不锈钢,.12 x 34 mm 8 三通 2 到检测器 (AJS 离子源或二维 DAD) 不锈钢,.75 x 34 mm ( ) 采用 HILIC 和 RPLC-MS 进行单克隆抗体酶解物的全二维液相色谱分析以及肽谱分析的系 统配置 146

149 特殊规格色谱柱 2 D,RPLC,15 s T5 T62 T11 T46 T1 T32 T7 T58 T57 T33 T25 T15 T21 T3 T56 T34 T43 T22 T1 T54 T41 T23 T31 T5 T18 T13 T29 T26 T18 T2 T27 T59 T16 T45 T47 T13 T14 T35 T42 T4 D,HILIC,58 min 由 MS 总离子计数数据生成的曲妥单抗胰蛋白酶酶解物分析的 LCxLC 等高线图 此分析中第一维 (HILIC) 和第二维 (RP) 具有良好的正交性 用于二维液相色谱的色谱柱尺寸通常定义为毛细管 纳流或微径 (.75-1 mm 内径 ) 安捷伦提供多种匹配以上色谱柱尺寸的固定相 如果您无法找到所需的孔径 填料粒径 固定相和色谱柱尺寸的组合, 请联系我们专业的定制色谱柱团队, 他们将为您制造出符合特定性能标准的色谱柱 提示与工具如需了解有关二维液相色谱基本原理的更多信息, 请订购二维液相色谱基础导论的副本 : Principles, Practical Implementation and Applications of Two-Dimensional Liquid Chromatography( 二维液相色谱原理 实践与应用 ), 出版号 EN UHPLC/HPLC 147

150 特殊规格色谱柱 纯化 制备液相色谱 安捷伦提供专为生物分子纯化而设计的一系列硅胶和聚合物型 HPLC 色谱柱与填料 包括为纯化微克和毫克级生物制药候选药物而优化的高效小粒径制备柱, 以及填充能纯化克级 千克级以及数千克级 API 的开发和生产柱的全多孔散装填料 聚合物型制备液相柱 某些色谱柱是针对高效纯化的需求而特别设计的, 而其他产品则易于从小粒径分析柱放 大到全规模 API 生产 表 1 展示了制备柱 / 填料的选择, 以及它们可以纯化的产品量 生物药物生命周期 发现 开发 生产 µg mg g kg 几千克 高效 高通量 反相色谱柱 mrp-c18 提示与工具 如需了解不同制备色谱类型的信息, 请参阅 : ZORBAX Prep HT 3Å StableBond VariTide RPC PLRP-S 1Å, 3Å, 1Å, 4Å 制备型液相色谱原理与实践基础导论 ( 出版号 CHCN) 离子交换 Agilent Bio MAb Agilent Bio IEX PL-SAX PL-SCX 体积排阻 Agilent Bio SEC-3 Agilent Bio SEC-5 表 1: 用于生物分子纯化的安捷伦色谱柱和填料 色谱类型 产品系列和纯化规模 148

151 特殊规格色谱柱 纯化柱的选择 应用技术说明安捷伦色谱柱 蛋白质组学 反相色谱柱 适用于蛋白质组学应用的专用高回收色谱柱 专为最大回收率 µg 级纯化而 设计 mrp-c18 所有生物分子反相色谱柱高效 3Å 硅胶型填料 ZORBAX PrepHT 3SB 合成多肽 反相色谱柱 为合成多肽的纯化而设计的聚合物型填料 这是一款高效的单柱解决方案, 适用于所有种类的合成多肽 ( 包括酸性 碱性 疏水性和亲水性多肽 ), 并且覆盖液相和固相合成生产的全部多肽大小范围 所有生物分子 反相色谱柱 提供各种孔径和粒度的优级聚合物型反相系列柱, 其中小粒径制备柱可进行 高效的实验室级纯化, 大粒径生产级色谱柱可用于放大到大量生产型纯化 当纯化将被放大用于生产 API, 并需要经过合规性批准时, 可以使用 PLRP-S 3 µm 和 5 µm 填料适用于高效纯化 8 µm 1 µm 1-15 µm 15-2 µm 3 µm 和 5 µm 填料适用于较大规模纯化和低压纯化 VariTide RPC 单克隆抗体离子交换无孔弱阳离子交换剂 Agilent Bio MAb 所有生物分子离子交换无孔离子交换剂 Agilent Bio IEX SAX WAX SCX 和 WCX 官能团, 为您的酸性和碱性分子纯化提供多种选择 5 µm 无孔颗粒, 提供最高的实验室制备效率 PLRP-S 所有生物分子离子交换全多孔强阴离子交换剂 PL-SAX 5 µm 填料适用于高效纯化 8 µm 1 µm 和 3 µm 填料适用于较大规模纯化和低压纯化 全多孔强阳离子交换剂 5 µm 填料适用于高效纯化 8 µm 1 µm 和 3 µm 填料适用于较大规模纯化和低压纯化 所有生物分子体积排阻具有多种孔径的硅胶基 SEC 填料 Agilent Bio SEC-3 和 5 提供 3 µm 和 5 µm 粒径的填料, 可实现高分析效率 提供 1Å 到 2Å 的多种孔径, 覆盖宽泛的样品分子大小 PL-SCX 提示与工具更多信息可参考 : Biomolecule Purification( 生物分子纯化 ), 出版号 EN UHPLC/HPLC 149

152 特殊规格色谱柱 mrp-c18 高回收蛋白柱 mrp( 大孔反相 )C18 高回收蛋白柱专为复杂蛋白质样品 ( 如去免疫的血清或血浆蛋白 ) 的高回收率 高分离度分离 纯化以及同步脱盐而设计 使用安捷伦多重亲和去除系统 ( 液相柱 ), 去免疫的血清蛋白样品回收率可达 95-99% 以上 最多可上样总蛋白质 38 µg, 而不会降低蛋白质的色谱分离度 mrp-c18 高回收蛋白柱, 4.6 x 5mm, 色谱柱装填了专为减少或消除蛋白质的强吸附而设计的大孔径 C18 键合超纯 5 µm 粒径硅胶颗粒 最大操作压力可达 25 bar (4 psi) 与水和所有常用有机溶剂兼容 mrp-c18 高回收蛋白柱说明 蛋白载样容量 部件号 mrp-c18,.5 x 1 mm 1 ng-5 µg mrp-c18, 2.1 x 75 mm 8-85 µg mrp-c18, 4.6 x 5 mm 4-38 µg

153 特殊规格色谱柱 用 mrp 柱分离复杂样品中的蛋白质 mrp-c18,4.6 x 5 mm mau Time (min) mau Time (min) Hela 膜制备样品 最高回收率 HeLa 细胞裂解物 (352 µg) mau Time (min) mau 脂筏 Time (min) MRPC18 "Top-6" 去除的人血清 人脑膜脂筏制备 (5 µg) UHPLC/HPLC 151

154 特殊规格色谱柱 ZORBAX PrepHT 制备柱 采用 ZORBAX 固定相轻松实现分析级到制备级的工艺放大 最高可实现达 2 mg 的快速制备级分离 5-7 µm 粒径可实现高柱效和高产量 易于安装的手拧式连接密封, 耐压高达 5 psi/35 bar 制备级分离维持和分析型固定相同样的选择性利用 Agilent ZORBAX PrepHT 色谱柱可以轻松实现高纯度 高回收率和高通量的分析 提供 StableBond 3Å C18 C8 C3 和 CN 等多种键合相 用于在各种条件下获得最佳分离度和载样量 ZORBAX 3Å StableBond Prep HT 卡套柱 ZORBAX PrepHT 色谱柱填充 5 µm 和 7 µm 填料, 可实现非常高的分离度 高分离度意味着高载样量 高产率和高纯度 较大内径色谱柱和机械强度更高的 ZORBAX 填料允许使用高达 1 ml/min 的流速, 因而增加了分析通量 ZORBAX PrepHT 柱可以在不损失分离度的情况下实现从分析级到制备级的快速放大 针对采用较大尺寸色谱柱 ( 内径 21.2 mm, 长度 15 mm 及以上 ) 的复杂分离, 安捷伦精心选择了 7 µm 粒径填料以实现高柱效和高载样量之间的平衡 ZORBAX 3Å StableBond 标志 说明 规格 (mm) 填料粒径 (µm) 3SB-C18 USP L1 3SB-C8 USP L7 3SB-CN USP L1 3SB-C3 USP L56 PrepHT 卡套柱 ( 需要柱接头 ) PrepHT 卡套柱 21.2 x PrepHT 卡套柱 21.2 x PrepHT 卡套柱 21.2 x PrepHT 卡套柱 21.2 x PrepHT 卡套柱 21.2 x PrepHT 柱端接头,2/ 包 PrepHT 保护柱芯,2/ 包 17. x 7, 保护柱卡套

155 特殊规格色谱柱 PEG 溶菌酶反应混合物的半制备型 RP-HPLC 分析 色谱柱 : ZORBAX SB-C x 25 mm, 5 µm A: 采用 Agilent ZORBAX 半制备型 3 SB-C18 色谱柱对 PEG 溶菌酶反应混合物进行半制备型 RP-HPLC 分析 B: 馏分收集放大图 mau 2, A 1,5 1, 5 DAD1 B,Sig = 溶菌酶 ( 峰 1) 聚乙二醇化溶菌酶 ( 峰 2) min mau B 1,5 1, min UHPLC/HPLC 153

156 特殊规格色谱柱 适用于 Prep to Process 的 PLRP-S 柱 适用于从研发阶段到几公斤级的 cgmp 生产, 缩短了方法开发时间 分离 冲洗和再生的化学稳定性很高, 提高了选择性和柱寿命 具有多柱单批包装, 缩短了系统停机时间并减少了验证成本 PLRP-S 填料为聚 ( 苯乙烯 / 二乙烯苯 ) 硬质填料, 可提供各种孔径, 适用于小分子 合成生物分子和大分子的纯化 其具有出色的热稳定性和化学稳定性, 尤为适合极端条件下的样品前处理 化合物洗脱和色谱柱再生 柱容量和分离度是提升纯化通量的两个最主要参数 由于能够对填料的孔径和操作条件进行广泛的选择,PLRP-S 能够为最优化的分离操作提供更多选择 填料粒径范围从 3 µm 到 5 µm, 适用于从研发阶段的 µg/mg 水平, 放大到 cgmp 生产的几公斤级水平的应用 卓越的化学稳定性, 可用浓度高达 1M NaOH 冲洗和再生, 延长色谱柱寿命 一批成品规模可高达 6 L, 具有多柱单批包装 为保证产品质量和持续供应品质的一致性, 我们的所有生产过程都有记录, 且还会定期进行设施审计工作 154

157 特殊规格色谱柱 PLRP-S Prep to Process 应用指南 应用 合成生物分子 多肽和寡核苷酸 重组生物分子 多肽和蛋白质 PLRP-S 填料孔径 1Å 3Å 1Å 4Å 生物大分子 抗体 DNA 片段 小分子 不稳定化合物, 包括金属敏感性 色谱柱性能指标 ph 范围 1-14 缓冲液成分 无限制 有机改性剂 1-1% 温度上限 2 C 最大压力 5-8 µm:3 psi (21 bar) 3 µm:4 psi (3 bar) UHPLC/HPLC 155

158 特殊规格色谱柱 用 PLRP-S 1Å 4.6 x 5 mm 柱纯化 25 mer 去三苯甲基寡核苷酸, 并对馏分进行定量分析 色谱柱 : 流动相 : PLRP-S 1Å PL x 5 mm, 3 µm A:1 mm 醋酸三乙胺 (TEAA) B:1 mm TEAA 溶于 25:75 乙腈 : 水 2 mv 纯度 (CE):9.54% 回收率 :83.2% 流速 : 1 ml/min 梯度 : 25% B min,35% B 2 min, 45% B 22.5 min,45% B 23 min, 25% B 23.5 min,25% B 26 min 8 min 25 柱温 : 8 C mv min 12.5 VLC53 缓激肽粗品制备上样 色谱柱 : 样品 : PLRP-S 1Å PL x 25 mm, 1 µm 3 µl 含 1.5 mg 粗品肽 流动相 : 含.1% TFA 的乙腈 : 水 = 21:79 流速 : 1 ml/min (36 cm/h) min 3 VLCbradykinin 馏分分析 - 浓度超载纯化 对峰收集的馏分进行 HPLC 分析显示, 馏分 1 到 4 仅含目标多肽, 而主要杂质的含量随着馏分数量的增大而增加 使用高效 PLRP-S 柱, 可以将粗品提纯 91.7%, 回收率 97%, 纯度 1% 如需更多信息, 请参见应用简报 EN 1 % HPLC 纯度 % HPLC 纯度 % 纯度 ( 缓激肽 ) % 纯度 ( 杂质 ) 馏分数量 156

159 特殊规格色谱柱 Prep to Process PLRP-S 规格 (mm) 填料粒径 (µm) PLRP-S 1Å PLRP-S 3Å PLRP-S 1Å PLRP-S 4Å 1 x 3 3 PL PL x PL PL x PL PL x 3 1 PL PL x 3 8 PL PL x 3 8 PL PL x 15 3 PL PL x PL PL x PL PL x 15 1 PL PL PL PL x 15 8 PL PL x PL PL x PL PL x 3 1 PL PL x 3 8 PL PL x 15 3 PL PL x 15 1 PL PL PL PL x 15 8 PL PL x 5 1 PL PL PLRP-S 方法开发柱 4.6 x 25 3 PL PL x PL PL x PL PL x 25 1 PL PL PL PL x 25 8 PL PL x 15 3 PL PL x PL PL x PL x 15 1 PL PL PL PL x 15 8 PL PL UHPLC/HPLC 157

160 特殊规格色谱柱 PLRP-S 散装填料 填料粒径 (µm) 单位 PLRP-S 1Å PLRP-S 3Å PLRP-S 1Å PLRP-S 4Å 5 1 kg PL1412-6K PL1412-6K1 PL1412-6K2 1 g PL1412-4K PL1412-4K1 PL1412-4K2 3 1 g PL PL kg PL PL g PL PL kg PL PL g PL PL kg PL PL g PL PL PL PL kg PL PL 定制色谱柱和散装填料的订购 如果您在以上表格中没有找到所需的孔径 / 填料粒径和色谱柱规格的组合或所需的散装填料量, 请联系您当地的安捷伦客户服务中心, 他们将帮助您进行定制订购 158

161 特殊规格色谱柱 Bio mab 填料 Agilent Bio MAb 和 Agilent Bio IEX 从分析型方法放大到高效的制备型方法 无孔填料可消除扩散传质 并且能对结构极为相似的杂质进行高效纯化 五种不同的功官能团 SAX WAX SCX WCX 以及专门针对 mab 分析进行了优化的 CX 在高样品载量下也可实现最高分离度 采用相同的 5 µm 颗粒即可从分析型方法轻松放大至半制备及制备型方法 这些填料的外部亲水层可降低非特异性相互作用 并提高样品回收率 分析型 半制备和制备型色谱柱均装填了相同的 5 µm 填料 因此生物制药工艺开发过程 中出现的任何非预期电荷异构体均可实现快速纯化 以便进行进一步表征和鉴定 Bio IEX 填料 离子交换基团 SCX WCX SAX WAX 亲水层 不同 通过馏分收集分离杂质 相似 无需进一步处理 基于 LC/MS 进行表征 利用 LC 获取电荷谱图 UHPLC/HPLC 159

162 特殊规格色谱柱 Agilent Bio MAb 液相柱规格 (mm) 填料粒径 (µm) 部件号 21.2 x x Agilent Bio IEX 液相柱, 不锈钢 规格 (mm) 填料粒径 (µm) Bio SCX 部件号 Bio WCX 部件号 Bio SAX 部件号 Bio WAX 部件号 21.2 x x

163 特殊规格色谱柱 适用于 Prep to Process 的 PL-SAX 和 PL-SCX 柱 较宽 ph 范围的离子交换纯化, 扩展了应用范围 HPLC 流速和快速平衡缩短了纯化周期 大孔径改善了传质性能, 可提供高速 高分离度的纯化这些刚性 强阳离子交换填料亲水性极强, 专为生物分子的纯化而设计 PL-SAX 和 PL-SCX 采用全聚合物材料制成, 在任何 HPLC 条件下都具有化学稳定性和热稳定性 强阳离子交换官能团与化学稳定的聚合物共价连接, 可在更宽的 ph 范围内进行离子交换纯化 其稳定性好, 可耐受柱清洗和净化 其热稳定性还可以使用变性条件和稳定剂 / 溶解剂, 以纯化在纯化条件下可能降解的目标化合物, 如带自补序列合成寡核苷酸的纯化 两款大孔径填料 (1Å 和 4Å) 均具有机械稳定性强且耐用的特点, 可以在较广的线性流速范围内运行, 能够快速加载稀释溶液和进行清洗循环 HPLC 流速和快速平衡缩短了纯化周期 通过动态轴向压缩 (DAC) 装柱设备进行色谱柱装填, 操作简单直接, 所获得的色谱柱柱效高 重现性良好且使用寿命长 1Å 孔径适用于高容量纯化,4Å 超大孔径填料改善了传质性能, 适用于生物大分子的分离以及高速 高分离度的纯化 UHPLC/HPLC 161

164 特殊规格色谱柱 色谱柱性能指标 PL-SAX PL-SCX 基质完全聚合完全聚合 孔径 1Å, 4Å 1Å, 4Å 填料粒径 1 µm, 3 µm 1 µm, 3 µm 微球形状刚性球形刚性球形 官能团季铵磺酸 压力稳定性 3 psi 3 psi 温度稳定性 8 C 8 C ph 范围 洗脱液兼容性 所有阴离子交换缓冲液 所有阳离子交换缓冲液 填充柱床密度.39 g/ml.39 g/ml 大分子寡核苷酸的纯化 色谱柱 : PL-SAX 1Å,8 µm 流动相 : 梯度 : 流速 : A:93% 1 mm TEAA,pH 7:7% ACN B:93% 1 mm TEAA,3.24 M 醋酸铵, ph 7:7% ACN -1% B /2 分钟 1.5 ml/min 柱温 : 6 C 检测器 : UV,29 nm 8 %B 91 mer min 35 VLC54 对含淀粉葡萄糖苷酶的培养液滤液进行制备性分离 色谱柱 : PL-SAX PL x 5 mm, 8 µm 流动相 : A:1 mm tris HCl,pH 8 B:A + 5 mm NaCl,pH 8 流速 : 4. ml/min 梯度 : 2 min 内 B 由 % 线性变化至 1% 制备性分离 检测器 : UV,28 nm min

165 特殊规格色谱柱 Prep to Process PL-SAX 和 PL-SCX 柱 Prep to Process PL-SAX 和 PL-SCX 柱和散装填料 规格 (mm) 填料粒径 (µm) PL-SAX 1Å PL-SAX 4Å PL-SCX 1Å PL-SCX 4Å 5 x 15 3 PL PL PL PL x 15 1 PL PL PL PL x 15 3 PL PL PL PL x 15 1 PL PL PL PL x 5 1 PL PL PL PL x 15 8 PL PL x 5 8 PL PL PL PL PL-SAX 和 PL-SCX 方法开发色谱柱 4.6 x 25 3 PL PL PL PL x 25 1 PL PL PL PL x 15 3 PL PL PL PL x 15 1 PL PL PL PL PL-SAX 和 PL-SCX 散装填料 填料粒径 (µm) 单位 PL-SAX 1Å PL-SAX 4Å PL-SCX 1Å PL-SCX 4Å 3 1 g PL PL PL PL g PL PL PL PL 定制色谱柱和散装填料的订购 如果您在以上表格中没有找到所需的孔径 / 填料粒径和色谱柱规格的组合或所需的散装填料量, 请联系您当地的安捷伦客户服务中心, 他们将帮助您进行定制订购 UHPLC/HPLC 163

166 特殊规格色谱柱 多肽纯化 VariTide RPC 柱 VariTide 是针对合成多肽生产的高性价比分离解决方案 用该色谱柱可以经济而有效地纯 化大量合成多肽产品, 规模从 µg 级到 g 级 VariTide 为以生产时间为经济驱动力, 生产 成百上千种小量多肽的生产商提供解决方案 适用于合成多肽分析的 VariTide RPC 柱 只需一根色谱柱即可涵盖整个合成多肽分子量范围 小粒径填料实现了最大的柱效率, 甚至使用 1 英寸和 2 英寸制备柱也可获得高效率 散装填料填充的 1 英寸和 2 英寸制备柱, 可以纯化毫克到克级的分析物 VariTide RPC 柱和填料都是 VariPep 多肽解决方案的一部分 这是使用通用方法对合成多肽进行高性价比分离和纯化的推荐选择 适用于合成多肽分析的 VariTide RPC 柱 规格 (mm) 部件号 21.2 x 25 PL1E12-5A5 1. x 25 PL112-5A5 4.6 x 25 PL1512-5A5 VariTide RPC 散装填料 说明 部件号 1 g PL1412-4A5 1 kg PL1412-6A

167 特殊规格色谱柱 粗肽筛查 色谱柱 : 流动相 : 流速 : VariTide RPC PL1512-5A5 4.6 x 25 mm 酸性 A:.1% TFA 溶于水 :ACN (95%:5%) B:.1% TFA 溶于水 :ACN (95%:5%) 碱性 A:5% ACN,95% 2 mm 碳酸铵,pH 9.5 B:5% ACN,5% 2 mm 碳酸铵,pH ml/min(36 cm/h) 梯度 : B 在 3 分钟内由 变至 1% 酸性 碱性 在酸性 ph 条件下主要杂质没有得到分离 检测器 : UV,22 nm min 3 VLC52 VariPure IPE 易于装填 可去除离子对试剂以提高分析效率 高性能 低成本, 可达到最佳柱效 VariPure IPE 是带碳酸氢根反离子的聚合物支载季铵树脂, 专为去除酸性离子对试剂如三氟乙酸 (TFA) 甲酸或乙酸而设计 VariPure IPE 是一种高性能的经济型酸性物质去除材料, 可方便地装填于 SPE 类型的装置中 其粒径 容量和装置的形状相匹配, 能在重力驱动的流速下提供足够有效提取离子对的停留时间 对于酸不稳定多肽, 去除离子对试剂可以防止在 HPLC 柱后分析过程发生多肽的酸降解, 提高纯化产物的产量 VariPure IPE 上样量 反离子去除容量 单位 部件号 每 3 ml 管 1 mg 约 5 ml.1% TFA 5/ 包 PL354-D63VP 每 6 ml 管 5 mg 约 25 ml.1% TFA 5/ 包 PL354-C63VP 每 2 ml 管 1 g 约 5 ml.1% TFA 25/ 包 PL354-P63VP 25 g PL VP UHPLC/HPLC 165

168 特殊规格色谱柱 Load & Lock 制备柱装柱系统 安捷伦提供品种齐全的轴向压缩柱和装柱机 (Load & Lock) 系统用于实验室制备液型相色谱柱的装填 其设计让您可以根据自己的需要轻松快速地装填制备型高效色谱柱 这一解决方案适用于药物化合物 多肽和天然产物的开发应用 我们的 Load & Lock 色谱柱具有独特的流体 / 样品分布系统, 可实现生产率最大化 该系统可提供动态轴向压缩 (DAC) 装填方式和静态 锁定 轴向压缩 (SAC) 装填方式, 旨在通过简单的操作提供更大的便利 实验室 Load & Lock 柱 流动填充工作站支持三种不同柱规格 用压缩空气驱动, 不需要电源 几分钟内快速而轻松地填充并取出安捷伦实验室规模的 Load & Lock 色谱柱改善了流量分布, 且具有良好的填充柱床稳定性, 让您能够以最快的速度 最大的灵活性和操作简便性进行最高质量的纯化 支持三种不同内径规格的色谱柱 :1 英寸 2 英寸和 3 英寸 该工作站由压缩空气驱动, 是危险环境下的最佳解决方案 使用可快速释放的单螺栓夹, 在几分钟内即可轻松完成装卸 Load & Lock 制备柱装柱系统说明 水套 规格 (mm) 部件号 Load & Lock 41 柱 无 27. x 5 PCG93LL5X25 有 27. x 5 PCG93LL5X25WJ 备件工具包 PCG931AAKIT Load & Lock 42 柱 无 5. x 5 PCG93LL5X5 有 5. x 5 PCG93LL5X5WJ 备件工具包 PCG932AAKIT Load & Lock 43 柱 无 75. x 5 PCG93LL5X75 有 75. x 5 PCG93LL5X75WJ 备件工具包 PCG933AAKIT 流动填充工作站 ( 空气驱动 ) PCG93LLSTAND

169 特殊规格色谱柱 Agilent Bio SEC 基于分子大小进行纯化 提供 6 种孔径, 满足不同分子量生物药物分离需求 3 µm 或 5 µm 分析柱方法可用相同颗粒填料放大至制备级方法 亲水聚合物薄层可最大限度减少非特异性相互作用, 从而提供良好的峰形并增加样品容量 硅胶基质填料具有优化的孔径和孔容量, 可在 HPLC 的压力和流速条件下进行高分离度的分离 具有 1Å 15Å 和 3Å 孔径的 3 µm 填料可提供最高的实验室制备效率,5 µm 填料则为更大的生物分子和偶联物的分离提供多种孔径 哪一种体积排阻色谱柱适合您的应用? 您可以基于分析物和方法参数, 从安捷伦的多种体积排阻色谱柱中, 选出可助您实现完美分离的产品 本图为您提供了要获得常见分子类型的最佳分离结果所需的孔径范围概览 我们建议您使用 Agilent Bio SEC-3 和 Bio SEC-5 色谱柱进行初次方法开发 胰岛素 肌红蛋白 卵清蛋白 BSA IgG 甲状腺球蛋白 Agilent Bio SEC 1Å Agilent Bio SEC 15Å Agilent Bio SEC 3Å Agilent Bio SEC 5Å 从这里开始进行您的 mab 方法开发 Agilent Bio SEC 1Å Agilent Bio SEC 2Å 1 Da 1 kda 1 kda 1 kda 1, kda 1, kda 1, kda 多肽球蛋白蛋白偶联物和生物大分子 UHPLC/HPLC 167

170 特殊规格色谱柱 适用于多肽和蛋白质快速分离的 Agilent Bio SEC-3 HPLC 色谱柱 规格 (mm) 填料粒径 (µm) Bio SEC-3 1Å USP L33 Bio SEC-3 15Å USP L33 Bio SEC-3 3Å USP L x 制备保护柱 21.2 x Agilent Bio SEC-5 HPLC 色谱柱适用于基于尺寸的生物分子分离 Bio SEC-5 1Å Bio SEC-5 15Å Bio SEC-5 3Å Bio SEC-5 5Å Bio SEC-5 1Å Bio SEC-5 2Å 规格 (mm) 填料粒径 (µm) USP L33 USP L33 USP L33 USP L33 USP L33 USP L x 制备保护柱 21.2 x

171 BioHPLC 资源 卡套柱系统 卡套柱选择指南 标志 * 柱芯类型特点优点 ZORBAX 卡套型保护柱 : 独立式 ZORBAX 半制备保护柱的卡套 : 独立式 ZORBAX 和 Agilent Prep 卡套型制备柱和保护柱 : 独立式和内置式选件 聚合物型分析柱和保护卡套柱 高效 独立 低死体积柱芯设计独特的高聚物柱芯, 在与金属表面连接时无渗漏接头可重复使用简单 低死体积组件设计独特的聚亚苯基砜管线, 在与金属表面连接时无渗漏接头可重复使用简单 低死体积组件接头可重复使用用于内部和外部保护柱的硬件选件高效低死体积可重复使用的柱套 可在高达 4 bar 的压力下密封 无需密封垫抗溶剂性强于 PEEK 适合连接 1/16 英寸 LC 接头可在高达 2 psi(135 bar,13.5 MPa) 的压力下密封无需密封垫适合连接 1/16 英寸 LC 接头柱寿命延长可快速更换柱可以与 21.2 mm 和 3 mm 内径柱一起使用价格低廉快速柱芯更换延长柱寿命 * 查找这些图标, 帮助您选择正确的保护卡套柱和色谱柱 BioHPLC 色谱柱 169

172 BioHPLC 资源 柱芯 / 保护柱芯系统兼容性指南 * 标志柱型保护卡套柱卡套内径 (mm) 固定相 标准接头 保护柱 ( 独立 ) 卡套 ZORBAX 半制备柱 半制备保护柱 ( 独立 ) 卡套 ZORBAX PrepHT 保护柱芯 ZORBAX Agilent Prep 分析柱 保护柱卡套 (PL131-16) 和 PLRP-S 保护柱芯,2/ 包 (PL ) 3. PLRP-S 保护柱卡套 (PL131-16) 和 PL-SAX 保护柱芯,2/ 包 (PL ) 3. PL-SAX 保护柱卡套 (PL131-16) 和 PL-SCX 保护柱芯,2/ 包 (PL ) 3. PL-SCX * 独立保护柱芯可用于安捷伦提供的所有卡套柱和标准接头柱 无图标的所有色谱柱均为标准接头柱 17

173 BioHPLC 资源 USP 指定产品 仅针对 BIOHPLC 柱 如需了解安捷伦的所有 USP 指定 HPLC 色谱柱产品列表, 请参考安捷伦产品目录或访问 美国药典 (USP) 中包含了许多药物分析的标准方法, 其中指定的色谱柱只是规定了填料类型而没有限制厂商 下列推荐的安捷伦科技 液相柱适用于 USP 所列的大多数 LC 方法 USP 方法 USP 填料色谱柱粒径 (µm) L1 十八烷基硅烷化学键合到多孔硅胶或陶瓷微粒上, 直径 1.5 到 1 µm Poroshell 12 EC-C L7 辛基硅烷化学键合到全多孔或表面多孔硅胶颗粒 ( 粒径 1.5 µm 到 1 µm), 或者硅胶基质的整体柱 Poroshell 12 SB-C ZORBAX 3SB-C18 1.8, 3.5, 5, 7 ZORBAX 3 Extend C18 3.5, 5 Poroshell 12 EC-C8 2.7 ZORBAX 3SB-C8 1.8, 3.5, 5, 7 AdvanceBio RP-mAb SB-C8 3.5 L1 腈基化学键合到多孔硅胶颗粒上, 直径 3 到 1 µm ZORBAX 3 SB-CN 3.5, 5, 7 L14 化学键合了强碱性季铵阴离子涂层的 1 µm 硅胶颗粒 ZORBAX SAX 5 L17 由磺酸化交联苯乙烯 - 二乙烯基苯共聚物 ( 氢型 ) 组成的强阳离子交换树脂, 直径 7 到 11 µm Hi-Plex H 8 Bio SCX NP1 1 L21 实心球形苯乙烯 - 二乙烯基苯共聚物, 直径 5 到 1 µm PLRP-S 1Å 3, 5, 8, 1 L25 能分离分子量范围 1 到 5 Da 的化合物 ( 经聚氧化乙烯测定 ) 的填料, 适用于分离中性 离子化和阳离子型水溶性聚合物 PLRP-S 3Å 3, 5, 8, 1 PLRP-S 1Å 5, 8, 1 PLRP-S 4Å 5, 8, 1 PL aquagel-oh 5, 8 L26 丁基硅烷化学键合到全多孔或表面多孔硅胶颗粒, 粒径 1.5 到 1 µm AdvanceBio RP-mAb C4 3.5 L33 能够分离分子量范围 4 到 4 Da 的蛋白质的填料 该填料为球形硅胶颗粒, 经处理后具有 ph 稳定性 ZORBAX GF-25 4 Bio SEC-3 3 Bio SEC-5 5 ProSEC 3S 5 L35 带亲水 ( 二醇类 ) 分子单层键合相的锆稳定球形硅胶填料 ZORBAX GF-25 4 ZORBAX GF-45 6 L5 由带丙烷磺酸基的多孔硅胶制成的强阳离子交换树脂, 直径 5 到 1 µm ZORBAX 3SCX 5 L56 丙基硅烷化学键合到多孔硅胶颗粒上, 直径 3 到 1 µm ZORBAX SB-C3 1.5, 3, 5 L68 直径 1 µm 或以下的球形多孔硅胶, 表面经烷基酰胺基团共价键合改性, 未封端, 用于 AdvanceBio 糖谱分析色谱柱 AdvanceBio 糖谱分析 1.7 BioHPLC 色谱柱 171

174 BioHPLC 资源 BioHPLC 色谱柱文献 标题色谱柱 / 产品应用出版号出版物类型 参考文献 使用 Agilent AdvanceBio 反相色谱柱优化生物分子的表征 生物色谱柱生物分子 EN 白皮书 生物制药开发和 QA/QC 领域的安捷伦应用生物色谱柱生物分子分析 CHCN 应用文集 Agilent SD-1 纯化系统 生物色谱柱 制备 半制备 EN 产品样本 重组蛋白表征 基础导论 参考文献 蛋白质分析 CHCN 基础导论 液相色谱手册 : 液相色谱柱和方法开发指南参考文献方法开发 CHCN 基础导论 生物制药实验室法规认证 基础导论参考文献蛋白质 CHCN 基础导论 安捷伦液相色谱柱选择指南小分子色谱柱很多 CHCN 选择指南 Agilent BioHPLC 色谱柱全景浏览图 分析级生物分子的分离 生物色谱柱生物分子 CHCN 挂图 在方法开发过程中控制 ph 以获得更好的色谱条件生物色谱柱方法开发 EN 技术概述 用于单克隆抗体表征的 Agilent BioHPLC 色谱柱生物色谱柱 mab EN 宣传彩页 无限卓越的生物分子分析 通过采用 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统的肽谱分析 SEC 分析和 IEX 分析对药用蛋白质进行理化表征 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元系统 Bio MAb Bio SEC ZORBAX Eclipse Plus Poroshell 12 快速安捷伦 HPLC 在生物大分子分离中的应用 PLRP-S PL-SAX PL-SCX 蛋白质 CHCN 产品样本 蛋白质分析 CHCN 应用简报 蛋白质 EN 技术概述 ( 接转下页 ) 172

175 BioHPLC 资源 BioHPLC 色谱柱文献 标题 色谱柱 / 产品 应用 出版号 出版物类型 亲和性 Protein A 使用安捷伦 Bio-Monolith Protein A 色谱柱进行单克隆抗体滴度分析使用 Agilent Bio-Monolith Protein A 色谱柱和 LC/MS 优化细胞培养使用 Agilent Bio-Monolith Protein A 色谱柱和 LC/MS 进行细胞克隆选择使用 Agilent Bio-Monolith Protein A HPLC 色谱柱降低人 IgG 定量分析的循环时间采用 Agilent Bio-Monolith Protein A 色谱柱监测细胞培养液中的单克隆抗体滴度用 Agilent Bio-Monolith Protein A HPLC 色谱柱快速定量人多克隆 IgG 氨基酸分析使用柱前衍生 HPLC 分离两种含硫氨基酸与其他 17 种氨基酸将 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱用于多种安捷伦液相色谱仪和多种分离目标的改良氨基酸分析方法使用带自动衍生化的 HPLC 结合吸光度检测快速精确地测定细胞氨基酸流通率使用 1.8 µm 反相 (RP) 色谱柱进行高速氨基酸分析 (AAA) 快速 准确 灵敏 重复的 HPLC 氨基酸分析方法 HILIC 糖谱分析使用 UHPLC 和荧光检测对单克隆抗体和其他糖蛋白的 N- 糖链进行分析 Bio-Monolith Protein A mab EN 应用简报 Bio-Monolith mab EN 应用简报 Protein A Bio-Monolith mab EN 应用简报 Protein A Bio-Monolith mab EN 应用简报 Protein A Bio-Monolith mab CHCN 应用简报 Protein A Bio-Monolith IgG CHCN 应用简报 Eclipse Plus-C18 氨基酸分析 EN 应用简报 ZORBAX Eclipse Plus 氨基酸分析 EN 应用简报 ZORBAX Eclipse Plus 氨基酸分析 EN 应用简报 ZORBAX Eclipse Plus 氨基酸分析 CHCN 应用简报 ZORBAX Eclipse AAA 氨基酸分析 CHCN 应用简报 AdvanceBio 糖谱分析 mab CHCN 应用简报 以更高的速度和分离度进行糖谱分析 AdvanceBio 糖谱分析 糖谱分析 EN 宣传彩页 人免疫球蛋白 G 糖基化的高灵敏度高重现性 AdvanceBio 糖谱分析 糖谱分析 EN 应用简报 分析 采用新型 HILIC 色谱柱实现快速 N 连接糖基化分析 AdvanceBio 糖谱分析 糖谱分析 CHCN 应用简报 使用快速高效的 HILIC 方法提高对复杂多糖结 AdvanceBio 糖谱分析 糖基化 EN 应用简报 构的分析能力 比较 HILIC-LC/MS 和 RP-LC/MS 对 IgG 糖肽的 AdvanceBio 糖谱分析 肽谱分析 EN 应用简报 分离效果 AdvanceBio 肽谱分析 ( 接转下页 ) BioHPLC 色谱柱 173

176 BioHPLC 资源 BioHPLC 色谱柱文献 标题色谱柱 / 产品应用出版号出版物类型 用于蛋白质和单克隆抗体分离的离子交换色谱柱 Bio MAb Bio IEX Bio Monolith PL-SAX 和 PL-SCX 使用阳离子交换色谱对单克隆抗体电荷异构体进行表征分析 Bio MAb 单克隆抗体分析 EN 应用简报 使用阳离子交换色谱表征 Fab 和 Fc 片段 Bio MAb 单克隆抗体分析 EN 应用简报 用安捷伦弱阳离子交换柱提高分离速度 Bio WCX 蛋白质分析 EN 应用简报 利用安捷伦弱阳离子交换柱优化蛋白质分离 Bio WCX 蛋白质分析 CHCN 应用简报 通过阴离子交换色谱法进行蛋白质分析 Bio WAX 蛋白质分析 CHCN 应用简报 使用安捷伦 3 µm 阳离子交换色谱柱分离蛋白质标样 Bio WCX Bio SCX Bio MAb 蛋白质分析 EN 应用简报 2AB 标记 N- 连接糖链的电荷分析 Bio SAX 电荷异构体 EN 应用简报 使用 DAD 和 Q-TOF LC/MS 通过 Agilent 129 Infinity 2D-LC 解决方案进行自上而下和自下而上蛋白质组学分析 Bio SCX 蛋白质组学 EN 应用简报 用离子交换色谱分析生物分子 : 操作指南 Bio IEX 生物分子 EN 用户指南 通过阳离子交换色谱柱上的 ph 梯度分离来分析单克隆抗体的电荷异构体 ph 梯度洗脱用于改善单克隆抗体电荷异构体的分离 采用 Agilent Bio MAb NP5 色谱柱分析完整和羧基末端消解的 IgG1 使用 ph 梯度阳离子交换色谱对单克隆抗体进行高分离度电荷异质性分析 Bio MAb 电荷异构体 EN 技术海报 Bio MAb 电荷异构体 CHCN 应用简报 Bio MAb mab CHCN 应用简报 Bio MAb 电荷异构体 EN 应用简报 满怀信心地快速表征蛋白质电荷异构体所有 IEX 色谱柱电荷异构体 CHCN 产品样本 利用安捷伦弱阳离子交换柱优化蛋白质分离 Bio MAb 蛋白质分离 CHCN 技术概述 降低单克隆抗体电荷异构体分析的循环时间 Bio MAb 电荷异构体 EN 应用简报 优化弱阳离子交换柱的蛋白分离 粒径 缓冲盐和梯度的研究 用于蛋白质分离的安捷伦阴离子交换填料 上样量 vs 分离度 流速的影响及蛋白质分离实例 适用于生物大分子分析的 Agilent PL-SCX 阳离子交换填料 Bio IEX mab EN 技术海报 PL-SAX 蛋白质 EN 技术概述 PL-SCX 蛋白质 EN 技术概述 ( 接转下页 ) 174

177 BioHPLC 资源 BioHPLC 色谱柱文献 标题色谱柱 / 产品应用出版号出版物类型 用于蛋白质和单克隆抗体分离的离子交换色谱柱 Bio MAb Bio IEX Bio Monolith PL-SAX 和 PL-SCX 用于淀粉葡萄糖苷酶纯化和分析的安捷伦 PL- PL-SAX 蛋白质纯化 EN 技术概述 SAX 阴离子交换填料 亲和分离后的纯度评价 PL-SAX 蛋白质 EN 技术概述 通过 Bio-Monolith 阴离子交换 HPLC 色谱柱对 5 型腺病毒颗粒进行快速分析, 用以支持高滴度生产平台的开发 用 Agilent Bio-Monolith QA 柱快速测定细胞培养液中的 IgM 并监测纯化过程 Bio-Monolith QA 腺病毒 CHCN 应用简报 Bio-Monolith QA IgM CHCN 应用简报 用于蛋白质分离的安捷伦阴离子交换填料 PL-SAX 蛋白质分析 EN 技术概述 用 Agilent Bio-Monolith HPLC 色谱柱快速监测发酵过程中的噬菌体生产 用于寡核苷酸分析的 IEX 使用 PL-SAX 强阴离子交换 HPLC 色谱柱对寡核苷酸进行高分离度分离 Bio-Monolith 噬菌体生产, 过程监测 Agilent PL-SAX 1Å HPLC 色谱柱和填料 PL-SAX 分析 / 制备 - 寡核苷酸 极性改性固定相是核苷酸分析的理想选择 PL-SAX Pursuit XRs Ultra Pursuit PFP Polaris C18-A CHCN 应用简报 PL-SAX 寡核苷酸 EN 应用简报 EN 宣传彩页 寡核苷酸 EN 应用简报 Agilent TOP-DNA 和 TOP-RNA TOP-RNA 寡核苷酸 EN 宣传彩页 用于核苷酸和寡核苷酸分析的 Agilent PL-SAX PL-SAX 寡核苷酸 EN 技术概述 阴离子交换填料 反相色谱 AdvanceBio RP-mAb Poroshell 3 和 ZORBAX 3 更快更好地分离 mab AdvanceBio RP-mAb mab CHCN 产品样本 质量源于设计方法在利拉利汀药品稳定性方法开发中的应用 在 Agilent 649 LC/MS 系统上进行标准化 MRM 定量血浆蛋白质组学工作流程的应用套装 使用 ZORBAX RRHD 亚 2 µm C3 C8 和二苯基等不同选择性色谱柱快速分离还原态单克隆抗体的 UHPLC 方法优化 使用 ZORBAX RRHD 3Å,1.8 µm 色谱柱通过超快速反相 UHPLC 分离对完整单克隆抗体和还原单克隆抗体进行高分离度分析 对治疗性重组单克隆抗体 Fc 区中的糖基化进行表征 ZORBAX RRHD PLRP-S 药物开发 EN 应用简报 ZORBAX RRHD 蛋白质组学 EN 应用简报 ZORBAX RRHD mab EN 技术海报 ZORBAX RRHD mab EN 技术海报 Poroshell 3 mab EN 应用简报 ( 接转下页 ) BioHPLC 色谱柱 175

178 BioHPLC 资源 BioHPLC 色谱柱文献 标题色谱柱 / 产品应用出版号出版物类型 反相色谱 AdvanceBio RP-mAb Poroshell 3 和 ZORBAX 3 使用 Agilent 655 Q-TOF 质谱仪进行完整蛋白 Poroshell 3 mab EN 应用简报 分析 ZORBAX RRHD 使用反相 HPLC/UHPLC 进行蛋白质鉴定和杂质 所有 RPLC 蛋白质分析 CHCN 产品样本 分析 应用 Agilent MassHunter Easy Access 软件对模式治疗性蛋白进行批次间纯化分析 使用 Agilent 129 Infinity LC 系统及 Agilent 653 精确质量四极杆飞行时间 (Q-TOF) 质谱分析单克隆抗体 (mab) 利用 Agilent 126 Infinity 生物惰性液相色谱系统及 Agilent ZORBAX RRHD Diphenyl 亚 2 µm 色谱柱分析 IgG1 中的二硫键 用 Agilent ZORBAX RRHD 3SB-C8 色谱柱对完整单克隆抗体 (MAb) 进行反相分离使用大孔亚 2 µm 颗粒和 UHPLC 分析蛋白质一级结构使用 Agilent ZORBAX RRHD 3SB-C18 分析胰酶消化单克隆抗体和 BSA 使用 Agilent ZORBAX RRHD 3Å 1.8 µm 色谱柱提高分析效率用于蛋白质分析的安捷伦 ZORBAX 3SB-C µm 超高压快速高分离度色谱柱用反相 Agilent ZORBAX RRHD 3SB-C18 色谱柱分析氧化胰岛素链使用亚 2 µm 色谱柱进行高分离度的快速肽谱分析 用 Poroshell 3SB-C18 C8 和 C3 色谱柱对人单克隆抗体 IgG 进行高速和超高速肽谱分析 利用温度提高 ZORBAX Poroshell 3SB-C8 HPLC 柱用于蛋白质超快速液相色谱分离时的分离度 Poroshell 3 蛋白质纯化 CHCN 应用简报 Poroshell 3 mab EN 应用简报 ZORBAX RRHD mab CHCN 应用简报 ZORBAX RRHD 3SB-C8 mab CHCN 应用简报 ZORBAX RRHD 纯化 / 制备 EN 技术海报 3SB-C18 ZORBAX RRHD 肽谱分析 EN 应用简报 3SB-C18 ZORBAX RRHD 蛋白质 多肽 CHCN 宣传彩页 3SB-C18 C8 ZORBAX 3SB-C18 蛋白质分析 EN 技术概述 ZORBAX RRHD 蛋白质分析 EN 应用简报 3SB-C18 ZORBAX 3SB-C18 肽谱分析 EN 应用简报 用 Agilent Poroshell 3 柱快速分离蛋白质 Poroshell 3 蛋白质分离 EN 应用简报 不同 ZORBAX StableBond 3 Å LC 色谱柱优 ZORBAX 3SB mab EN 应用简报 化抗体 HPLC 和 LC/MS 分离选择性的比较 利用 ZORBAX Poroshell 3Extend-C18 色谱柱的高 ph 稳定性提高液质联用分析时的信噪比 Poroshell 3Extend-C18 优化仪器性能 EN 应用简报 Poroshell 3 mab EN 应用简报 Poroshell 3-C8 蛋白质分离 EN 应用简报 ( 接转下页 ) 176

179 BioHPLC 资源 BioHPLC 色谱柱文献 标题色谱柱 / 产品应用出版号出版物类型 反相色谱 AdvanceBio RP-mAb Poroshell 3 和 ZORBAX 3 单克隆抗体快速分离中 ZORBAX Poroshell 固定相 (C3 C8 或 C18) 的选择 Poroshell 3 mab EN 应用简报 采用 ZORBAX Poroshell 3SB-C8 色谱柱进行单克隆抗体 IgG1 重链的快速 HPLC 分析 使用 ZORBAX Poroshell C18 C8 和 C3 固定相快速分离大分子蛋白和异质性蛋白 优化 Agilent 11 HPLC 系统以获得卓越的 ZORBAX Poroshell 色谱柱分析结果使用 Poroshell 3SB-C18 色谱柱在安捷伦 LC/MSD 上实现高灵敏度和高通量蛋白质分析使用 Poroshell 3SB-C18 色谱柱缩短蛋白质消化物的分析时间 Poroshell 3SB-C18 用于蛋白样品的快速高分辨分离分析 将胰岛素分析的 CHP 方法转换为使用 Agilent Poroshell 12 色谱柱的方法硅胶孔径和粒径对蛋白小分子胰岛素分离的影响 用 Agilent ZORBAX RRHD 3SB-C8 色谱柱对完整单克隆抗体 (mab) 进行反相分离 使用大孔亚 2 µm 颗粒和 UHPLC 分析蛋白质一级结构 Poroshell 3 mab EN 应用简报 Poroshell 3 蛋白质分离 EN 应用简报 Poroshell 3 蛋白质分析 EN 应用简报 Poroshell 3-C18 蛋白质分析 EN 应用简报 Poroshell 3 肽谱分析 EN 应用简报 Poroshell 3 蛋白质 ENUS 产品样本 Poroshell 12 Eclipse Plus 胰岛素 CHCN 应用简报 Poroshell 12 Eclipse Plus 胰岛素 CHCN 应用简报 ZORBAX 3SB ZORBAX RRHD 3SB-C8 mab CHCN 应用简报 ZORBAX RRHD 3SB-C18 纯化 / 制备 EN 技术海报 反相色谱 用于蛋白质和多肽分析的 PLRP-S 用于多肽 HPLC 分析的 Agilent PLRP-S 填料 PLRP-S 多肽 EN 技术概述 用安捷伦微径聚合物型 HPLC 色谱柱提高灵敏度 PLRP-S( 微径柱 ) 多肽类激素 小分子蛋白 小分子 EN 技术概述 高分子量纤维状蛋白的分离 PLRP-S 蛋白质分离 EN 应用简报 ACP 片段的无乙腈 HPLC 分析和制备级纯化 PLRP-S 蛋白质纯化 EN 应用简报 采用 PLRP-S 1Å 1 µm 色谱柱和 ELS 检测以及无乙腈洗脱分析多肽 PLRP-S 多肽 EN 应用简报 通过浓度超载对达菲林进行制备规模纯化 PLRP-S 多肽纯化 EN 应用简报 通过体积超载对缓激肽进行制备规模纯化 PLRP-S 多肽纯化 EN 应用简报 多肽分析中乙腈替代物的研究 PLRP-S 多肽 EN 应用简报 ( 接转下页 ) BioHPLC 色谱柱 177

180 BioHPLC 资源 BioHPLC 色谱柱文献 标题色谱柱 / 产品应用出版号出版物类型 反相色谱 用于蛋白质和多肽分析的 PLRP-S 合成酰基载体蛋白片段 的梯度纯化 PLRP-S 蛋白质 EN 应用简报 合成酰基载体蛋白片段 的等度纯化 PLRP-S 蛋白质纯化 EN 应用简报 通过浓度超载对缓激肽进行制备规模纯化 PLRP-S 多肽纯化 EN 应用简报 通过浓度超载对亮丙瑞林进行制备规模纯化 PLRP-S 多肽纯化 EN 应用简报 PLRP-S 聚合物填料的优势 PLRP-S 多肽 EN 技术概述 反相色谱 寡核苷酸 PLRP-S Agilent PLRP-S 5 µm HPLC 填料 PLRP-S 寡核苷酸 多肽 小分子激素 EN 宣传彩页 Agilent PLRP-S 1Å HPLC 色谱柱和填料 PLRP-S 寡核苷酸 EN 宣传彩页 通过改变温度来增强寡核苷酸传质并改善离子 PLRP-S 寡核苷酸 EN 应用简报 对反相 HPLC 的分离度 将热稳定聚合物型色谱柱用于寡核苷酸离子对的反相 HPLC 分析, 从而延长色谱柱寿命 脱保护寡核苷酸的离子对反相纯化 孔径的选择 PLRP-S 寡核苷酸 EN 应用简报 PLRP-S 寡核苷酸 EN 应用简报 基因表达双标签 26-bp 系列分析的 HPLC 纯化 PLRP-S 寡核苷酸 EN 应用简报 采用 Agilent TOP-DNA 进行高性能 DNA 寡核苷酸纯化 采用 Agilent TOP-RNA 进行的高性能 RNA 寡核苷酸纯化 PLRP-S TOP-DNA 寡核苷酸 EN 应用简报 PLRP-S TOP-RNA 寡核苷酸 EN 应用简报 反相色谱 mrp 利用 HPLC 及 Q-TOF 质谱仪分析聚乙二醇 mrp-c18 生物制剂 CHCN 应用简报 (PEG) 及单 二 -PEG 化的治疗性蛋白 安捷伦蛋白去除系统和蛋白质组学试剂 mrp-c18 MARS 蛋白质组学 EN 产品说明 大孔径反相 C18 高蛋白回收 HPLC 色谱柱 mrp-c18 人血清, 生物标志物 EN 产品样本 ( 接转下页 ) 178

181 BioHPLC 资源 BioHPLC 色谱柱文献 标题 色谱柱 / 产品 应用 出版号 出版物类型 反相色谱 肽谱分析 最优化肽段表征的关键 : 肽谱分析指南 AdvanceBio 肽谱分析 多肽表征 CHCN 用户指南 MARS Bio SEC ZORBAX RRHD Polaris 缩短肽谱分析时间但不减损分离度 AdvanceBio 肽谱分析 肽谱分析 EN 宣传彩页 使用 Agilent 129 Infinity UHPLC 和 Agilent 655 ifunnel Q-TOF LC/MS 系统对单克隆抗体进行高分离度的快速肽谱分析 快速高效的单克隆抗体 (mab) 肽谱分析 : UHPLC 性能与表面多孔颗粒相结合使用 Agilent 126 Infinity 生物惰性液相色谱系统和安捷伦 OpenLAB Match Compare 软件比较单克隆抗体药物利妥昔单抗的生物类似药和原创药自动化液质联用样品前处理 : 通过安捷伦 AssayMAP Bravo 平台实现高通量溶液内酶解和多肽纯化自动化液质联用工作流程 : 采用 AssayMAP 技术进行溶液内蛋白酶解 肽段纯化以及肽段的强阳离子交换分馏使用 Agilent AssayMAP Bravo 平台进行自动样品制备, 实现生物治疗蛋白质准确 可扩展的定量和表征分析体积排阻色谱 Bio SEC ProSEC AdvanceBio 肽谱分析 mab EN 应用简报 AdvanceBio 肽谱分析 mab CHCN 应用简报 AdvanceBio 肽谱分析 Poroshell 12 Bio SEC AdvanceBio 肽谱分析 AssayMAP Bravo AdvanceBio 肽谱分析 AssayMAP Bravo AdvanceBio 肽谱分析 AssayMAP Bravo mab EN 应用简报 蛋白质样品制备 CHCN 应用简报 蛋白质样品制备 CHCN 应用简报 蛋白质样品制备 EN 应用简报 快速可靠地分离蛋白质聚集体和降解产物 SEC 色谱柱 蛋白质分析 CHCN 产品样本 用于生物分子分析的体积排阻色谱 : 操作指南 所有 SEC 生物分子表征 CHCN 用户指南 生物治疗药物的分子表征 Bio SEC mab EN 应用简报 使用 Agilent 126 Infinity 多检测器 Bio-SEC 解决方案和先进的光散射检测方法测定蛋白质的分子量和分子大小 Bio SEC 蛋白质表征 EN 应用简报 使用 Agilent 126 Infinity 多检测器 Bio-SEC 解 Bio SEC mab EN 应用简报 决方案和先进的光散射检测方法对单克隆抗体 的聚集体进行详细的表征分析 ( 接转下页 ) BioHPLC 色谱柱 179

182 BioHPLC 资源 BioHPLC 色谱柱文献 标题色谱柱 / 产品应用出版号出版物类型 体积排阻色谱 Bio SEC ProSEC 吐温 2 是否会影响单克隆抗体分离? Bio SEC mab EN 应用简报 为 Agilent Bio SEC-3 色谱柱选择适合的校准 Bio SEC 生物分子表征 EN 应用简报 通过体积排阻色谱和多检测器方法分析蛋白质聚集 Bio SEC 蛋白质聚集 EN 应用简报 为生物样品过滤选择最佳的过滤器 Bio SEC ZORBAX RRHD 生物分子分析 EN 应用简报 单克隆抗体高分离度分离和定量 SEC 方法的开发和部分验证 Bio SEC mab CHCN 应用简报 如何根据蛋白质大小进行分离 Bio SEC 蛋白质表征 EN 技术海报 Agilent Bio SEC 柱用于生物分子表征的孔径优化 采用 Agilent Bio SEC-3 色谱柱分离重组人促红细胞生成素 (repo) PEG 溶菌酶的 N 端定点聚乙二醇化修饰和分析型纯化 聚乙二醇 / 聚氧化乙烯标准品及 Agilent ProSEC 3S 柱的校正使用 Agilent 126 Infinity 多检测器 GPC/SEC 系统精确测定蛋白质分子量 Bio SEC 生物分子表征 CHCN 应用简报 Bio SEC 生物治疗药物分离 CHCN 应用简报 Bio SEC Poroshell 12 蛋白质纯化 EN 应用简报 ProSEC 3S 蛋白质分析 EN 应用简报 Bio SEC 蛋白质分析 EN 应用简报 蛋白质高效体积分离的最佳参数优化 Bio SEC 蛋白质 EN 应用简报 蛋白质高效体积分离的最佳参数优化 Bio SEC 蛋白质 EN 技术海报 使用 Agilent Bio SEC 对单克隆抗体和二聚体进行快速 SEC 分离 聚乙二醇 / 聚氧化乙烯标准品及 Agilent ProSEC 3S 柱的校正用体积排阻色谱 (SEC) 分析复杂的细菌细胞分裂蛋白质 使用体积排阻色谱 (SEC) 分析 Hsp47( 一种骨胶原侣伴蛋白 ) Bio SEC mab EN 应用简报 ProSEC 3S SEC EN 应用简报 ProSEC 3S 蛋白质分析 EN 应用简报 ProSEC 3S 蛋白质分析 EN 应用简报 球蛋白在尿素中的逐渐变性 ProSEC 3S 蛋白质 EN 应用简报 温度对蛋白质体积排阻色谱的影响 ProSEC 3S 蛋白质分离 EN 应用简报 ( 接转下页 ) 18

183 BioHPLC 资源 BioHPLC 色谱柱文献 标题色谱柱 / 产品应用出版号出版物类型 体积排阻色谱 Bio SEC ProSEC NaCl 浓度对蛋白质体积排阻色谱的影响 ProSEC 3S 蛋白质分离 EN 应用简报 ph 对蛋白质体积排阻色谱的影响 ProSEC 3S 蛋白质分析 EN 应用简报 用安捷伦 ProSEC 3S 柱对球蛋白进行静态光散射分析 ProSEC 3S 蛋白质表征色谱柱 ProSEC 3S 蛋白质 EN 宣传彩页 使用 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱和 Agilent BioSEC 色谱柱, 通过体积排阻色谱法对单克隆抗体进行表征 Bio SEC mab CHCN 应用简报 其他 减小管路体积以优化色谱柱性能小内径色谱柱优化仪器性能 CHCN 应用简报 生物分子纯化 多肽 寡核苷酸和蛋白质纯化柱和填料 高纯度 高回收率 高通量 安捷伦科技公司提供两种新型制备 HPLC 柱系列产品 ProSEC 3S 蛋白质 EN 应用简报 用 ProSEC 3S 柱分析白蛋白 ProSEC 3S 蛋白质分析 EN 应用简报 用 ProSEC 3S 柱分析球蛋白 ProSEC 3S 蛋白质分析 EN 应用简报 用 ProSEC 3S 柱分析各种球蛋白 ProSEC 3S 蛋白质分析 EN 应用简报 球蛋白和 ProSEC 3S 色谱柱的校正 ProSEC 3S 蛋白质分析 EN 应用简报 用 ProSEC 3S 柱进行 BSA 的光散射分析 ProSEC 3S 蛋白质分析 EN 应用简报 PLRP-S PL-SAX PL-SCX 纯化 / 制备 EN 产品样本 Agilent Prep HT 纯化 / 制备 EN 产品样本 提示与工具 有关上述内容的详细信息, 以及其他有助于您的表征分析的指南, 请访问 : BioHPLC 色谱柱 181