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1 利用 Auto Blend Plus 技术简化 SEC 方法开发流程 沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司郭天应用工程师 tian_guo@waters.com 1

2 内容摘要 体积排阻色谱技术 (SEC) 原理介绍 Auto Blend Plus 技术介绍 利用 Auto Blend Plus 技术辅助的 SEC 方法开发过程 SEC 方法开发过程中的考虑因素 SEC 方法开发流程 SEC 系统和色谱柱维护 2

3 内容摘要 体积排阻色谱技术 (SEC) 原理介绍 Auto Blend Plus 技术介绍 利用 Auto Blend Plus 技术辅助的 SEC 方法开发过程 SEC 方法开发过程中的考虑因素 SEC 方法开发流程 SEC 系统和色谱柱维护 3

4 SEC 技术简介 近 50 年历史的技术, 从淀粉作为固定相到合成树脂, 现在常用硅胶基质或杂化颗粒为固定相 根据分子在溶液中的大小 (Stokes radius 半径 ) 来进行分离 ; 通常分子的大小与分子量相关, 故常用分子量来表征分离能力 分离过程是等度过程 分离过程发生在少于 1 个 CV(column volumn) 的条件下 ; 故谱带展宽 (band broadening) 在 SEC 中是重要影响因素 方法开发的影响因素包括 : 离子强度, 流动相添加剂, 流动相 ph 值, 流速, 载样量, 色谱柱柱长和内径 4

5 SEC 分离过程 5

6 SEC 分离过程 分离过程发生在少于 1 个 CV(column volumn) 的条件下 6

7 影响 SEC 分离的硬件因素 谱带展宽 使用合适的色谱柱和仪器可以减少谱带展宽 HPLC Broad Band Broad Peak Less Sensitivity Less Resolving Power Waters UPLC Technology Narrow Peak Increased Sensitivity Increased Resolving Power 7

8 AU AU UPLC-SEC vs HPLC-SEC 比较 HPLC 100% Silica-Diol SEC 250Å 5µm 7.8 x 300 mm ACQUITY BEH200 SEC, 1.7 µm 4.6 x 300mm % Aggregate % Aggregate Minutes Minutes 8

9 内容摘要 体积排阻色谱技术 (SEC) 原理介绍 Auto Blend Plus 技术介绍 利用 Auto Blend Plus 技术辅助的 SEC 方法开发过程 SEC 方法开发过程中的考虑因素 SEC 方法开发流程 SEC 系统和色谱柱维护 9

10 Auto Blend Plus 技术简介 Auto Blend Plus 是 ACQUITY UPLC H-Class ACQUITY UPLC H- Class Bio 和 ACQUITY Arc 系统的标准功能 Auto Blend Plus 技术技术通过软件自动控制纯溶剂或浓溶液的比例来在线配制所需要的流动相 该技术能自动配制不同 ph 值和离子强度的流动相 10

11 Auto Blend Plus 技术自动调节不同 PH 值和离子强度 缓冲盐浓度值 按照要求配置流动相母液 在梯度表中输入需要的 ph 值和盐浓度 11

12 Auto Blend Plus ph 设置界面 体积配制法, 可高度重现! 点击 %: - 可得 ph 配制比例 - 可确保实验室间的高度可重现性 12

13 Auto Blend Plus 现有体系 13

14 Auto Blend Plus 现有体系 14

15 内容摘要 体积排阻色谱技术 (SEC) 原理介绍 Auto Blend Plus 技术介绍 利用 Auto Blend Plus 技术辅助的 SEC 方法开发过程 SEC 方法开发过程中的考虑因素 SEC 方法开发流程 SEC 系统和色谱柱维护 15

16 常见的 SEC 方法开发考察因素 考察内容考察范围目的 盐 (NaCl) 浓度值 10,100,200,300mM ph 值 6.0, 6.8, 7.6 盐的种类 NaCl 和 KCl 样品浓度 1,2,5,10 mg/ml 考察盐浓度对蛋白样品和填料相互作用的影响 ph 值对聚集体含量, 分离情况的影响 考察两种盐对分离及聚体含量影响 样品浓度会应影响峰形, 考察聚体含量变化 进样量 1,2,5,10 µl 进样量对聚体含量影响 流动相添加剂 10% IPA 一般认为加入 IPA 能改善峰形 / 当蛋白样品更加松散时, 加精氨酸改善 16

17 SEC 方法开发影响因素 - 离子强度 蛋白样品可以与固定相之间发生吸附作用过程 这些过程会导致样品保留规律的不规则变化 ( 例如 : 样品并不是按分子量大小来实现分离过程 ) SEC 色谱柱常用二醇 (diol) 键合来减小蛋白与固定相之间相互作用 即使在高比率键合二醇 (diol) 的情况下, 蛋白仍可能与固定相表面残余的硅醇羟基发生相互作用, 故需要加入高浓度盐溶液来减小样品与硅醇羟基之间的离子相互作用 17

18 BEH SEC 颗粒简介 在专利的 BEH 颗粒 ( 亚乙基桥杂化颗粒 ) 基础上键合二醇基, 提供了良好的化学稳定性和最小化的二级相互作用 18

19 二醇基键合有效减少样品与固定相的离子相互作用 固定相表面带负电的硅醇羟基与蛋白样品带正电的部分可发生相互作用 Diol 键合有效减少了暴露在固定相表面带负电荷的硅醇羟基 19

20 流动相中加入盐 ( 如 NaCl) 可以有效减少蛋白样品与固定相相互作用 通过加入 NaCl 带来的离子竞争 / 抑制作用过程 20

21 SEC 方法开发影响因素 - ph 值 SEC 是非变性的分析技术, 决定了流动相 ph 值应与正常生理环境 ph 相近 (ph 6.8) 通过小范围改变流动相 ph 值, 可改变蛋白样品的空间结构, 从而影响样品与固定相间的离子相互作用 ph 的作用可通过流动相 ph 值和蛋白样品等电点 (pi) 来预测 21

22 SEC 方法开发影响因素 - 流动相添加剂 常用的添加剂为 IPA, 精氨酸 大部分情况下加入 IPA( 不超过 10%) 来改善峰形 精氨酸的加入可与蛋白样品 ( 空间结构较为松散的蛋白样品 ) 结合, 减少样品与固定相相互作用, 改善峰形, 并提高样品回收率 22

23 SEC 方法开发影响因素 - 流速 流速变化是影响分离度的重要因素 在较低的流速条件下, 会得到较高的分离度 低流速会带来较长分析时间, 降低灵敏度及峰宽的增加 23

24 SEC 方法开发影响因素 - 载样量 进样体积和样品量均会影响色谱的灵敏度和分离度 理想的进样体积为柱容量 (column volume) 的 5-10% 之间 当进样体积超过上述范围时, 会带来峰变形 ( 如脱尾 ), 从而降低分离度 24

25 方法开发流程 在一根色谱柱上, 筛选不同的 NaCl 盐浓度值 : 如 150,200,350mM 可通过 Auto Blend Plus 功能快速实现 在确定 NaCl 盐浓度值条件下, 筛选不同的 ph 值 :ph 6.0,6.8,7.6 在初步确定盐浓度和 ph 值条件下, 筛选不同的流速 : 0.2,0.4mL/min 在确定盐浓度,pH 值和流速后, 考察进样量和进样浓度 * 固定色谱条件, 进行重现性考察, 确定最终方法 * 此处可根据实际情况, 考察是否需要加入 IPA 或精氨酸 25

26 现状 : 蛋白质分子筛分析方法开发 - ph 值筛选 1 st 流动相准备 : 筛选合适的 ph 1 配制 25mM ph6.0 的磷酸盐缓冲溶液, 含 200 mm 氯化钠 1 需要 : 3 次称量 1 次量体积 3 点校准的 ph 计 测量 ph 值和滴定 2 配制 25mM ph6.8 的磷酸盐缓冲溶液, 含 200 mm 氯化钠 3 配制 25mM ph7.6 的磷酸盐缓冲溶液, 含 200 mm 氯化钠 共需要 : 9 次称量 3 次量体积 3 点校准的 ph 计 多次测量 ph 值和滴定 26

27 现状 : 蛋白质分子筛分析方法开发 - 盐浓度筛选 2nd 配制含不同浓度氯化钠的溶液 (ph 6.8) 1 配制 25mM ph6.8 的磷酸盐缓冲溶液, 含 50 mm 氯化钠 2 配制 25mM ph6.8 的磷酸盐缓冲溶液, 含 200 mm 氯化钠 3 配制 25mM ph6.8 的磷酸盐缓冲溶液, 含 250 mm 氯化钠 共需要 : 5 次称量 1 次量体积 3 点校准的 ph 计 测量 ph 值和滴定 27

28 如果使用 Auto Blend Plus 技术, 是这样配制溶液和运行 NaCl 盐梯度的 Buffer: 20mM sodium phosphate, ph6.0 to 7.6, 0 to 500 mm NaCl Buffer A Weigh, mix and stir until completely dissolved gm NaH 2 PO 4 ~900mL water Bring to 1.0L in volumetric flask Vacuum filter into solvent reservoir Buffer B Weigh, mix and stir until completely dissolved gm Na 2 HPO 4 ~900mL water Bring to 1.0L in volumetric flack Vacuum filter into solvent reservoir Buffer C Weigh, mix and stir until completely dissolved 58.44gm NaCl ~900mL water Bring to 1.0L in volumetric flask Vacuum filter into solvent reservoir Buffer D 4L MilliQ or HPLC grade water 28

29 方法开发流程 通过一个 Sequence 即可完成所有的考察项目 盐浓度考察 ph 值考察 流速考察 进样量考察样品浓度考察 29

30 第一步 : 考察 NaCl 浓度的影响 初始方法 ACQUIITY BEH 200 SEC,4.6 x 150mm, 1.7 µm Auto Blend Plus, 完成 NaCl 浓度筛选 流动相 ph 值 : 6.8 柱温 :30 度 柱流速 :0.4 ml/min 仪器 :ACQUITY UPLC H-Class Bio 样品 : 阿达木单抗 目标 : 确定合适的盐浓度 30

31 AU AU 第一步 : 考察 NaCl 浓度的影响 Minutes Minutes NaCl 浓度分别为 :10mM,100mM,200mM,300mM 31

32 AU AU Dimer Monomer AU AU Dimer Monomer 第一步 : 考察 NaCl 浓度的影响 mM Minutes Minutes mM Minutes Minutes 32

33 AU AU Dimer Monomer AU AU Dimer Monomer 第一步 : 考察 NaCl 浓度的影响 mM Minutes Minutes mM Minutes Minutes 33

34 第一步 : 考察 NaCl 浓度的影响 当 NaCl 浓度从 10mM 上升到 100mM 时, 观察到分离度的提高和单体保留时间, 聚集体含量的变化 当 NaCl 浓度从 100mM 上升到 300mM 时, 上述变化不再明显 盐浓度影响蛋白质与色谱柱固定相的次级相互作用, 通过增加缓盐的离子强度可以将这些作用降到最小 当盐浓度达到一定值时, 蛋白质与固定相之间相互作用已达到最小 34

35 第二步 : 考察 ph 值的影响 初始方法 ACQUIITY BEH 200 SEC,4.6 x 150mm, 1.7 µm Auto Blend Plus, 完成 ph 值筛选 NaCl 浓度 : 200mM 柱温 :30 度 柱流速 :0.4 ml/min 仪器 :ACQUITY UPLC H-Class Bio 样品 : 阿达木单抗 目标 : 确定合适的 ph 值 35

36 AU AU 第二步 : 考察 ph 值的影响 Minutes ph 6.0 USP 分离度 = 2.25 聚集体 = 1.4 ph 6.8 USP 分离度 = 2.15 聚集体 = 1.6 ph 7.6 USP 分离度 = 2.13 聚集体 = Minutes 随着 ph 升高, 聚集体含量和分离度并没有明显变化单体的出峰时间相同 36

37 第三步 : 考察流速的影响 初始方法 ACQUIITY BEH 200 SEC,4.6 x 150mm, 1.7 µm 流动相 ph 值 6.8,NaCl 盐浓度 200mM 柱温 :30 度 柱流速 :0.2mL/min, 0.4 ml/min 仪器 :ACQUITY UPLC H-Class Bio 样品 : 阿达木单抗 目标 : 确定合适的流速 37

38 AU AU 第三步 : 考察流速的影响 流速 :0.2mL/min 流速降低分离度提高, 并未影响聚集体含量 Minutes * 此时分离度变化, 需要重新定义积分参数来保持统一的积分标准 流速 :0.4mL/min Minutes 38

39 系统维护 - 溶剂管理器的保存 39

40 色谱柱使用规范 对色谱柱建立良好的使用规范 : 新柱到位先测柱效, 柱效保存在柱盒内, 供今后柱效状态程度的检查 色谱柱加配 VanGuard 保护柱, 有效延长柱寿命 色谱柱清洗 : 定期用纯甲醇 (0.1~0.2mL/min) 低流速过夜 ( 先确保彻底清除柱内残留盐分 ) 40

41 使用保护柱能有效延长柱寿命 同时, 不影响灵敏度和分离度! 在多次进样中, 使用保护柱能改善峰形 保护柱也需要定期更换 ( 推荐每 200 针进样后更换保护柱 ) 41

42 使用蛋白标准品来测试柱效 使用蛋白标准品来测试柱效 通过不同分子量蛋白相对于尿嘧啶的相对保留时间 (RRT) 来评判孔径 通过尿嘧啶的理论踏板数, 拖尾 因子等参数评判柱效 42

43 参考资料 Application Notes 应用纪要 Published Reviews 43

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