1. 前言目前, 人们对以免疫球蛋白 (IgG) 为主的抗体药物的需求日益高涨在抗体药物的研发以及制备工艺建设中, 由于 IgG 表达需进行筛选, 所以必须快速及准确地定量细胞培养液中的 IgG 而且, 即使在工业制备过程中,IgG 的定量也是重要的质量控制项目之一为此, 本研究采用了以 Pro

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高性能亲和色谱柱 TSKgel Protein A-5PW 目录页码 1. 前言 - 1-2.

流动相中盐浓度和添加剂的影响 - 2-2-4. 流动相 ph 的影响 - 3-2-5. 校准曲线 - 4-2-6. 色谱柱的耐用性 - 5-2-7.

1 高性能亲和色谱柱 TSKgel Protein A-5PW 目录页码 1. 前言 TSKgel Protein A-5PW 色谱柱的基本特性柱填料的特点标准分离条件流动相中盐浓度和添加剂的影响流动相 ph 的影响校准曲线色谱柱的耐用性碱性溶液清洗填料的批间差异分离实例快速分析 IgG 单克隆抗体的定量 ( 加标回收试验 ) 总结东曹株式会社

2 1. 前言目前, 人们对以免疫球蛋白 (IgG) 为主的抗体药物的需求日益高涨在抗体药物的研发以及制备工艺建设中, 由于 IgG 表达需进行筛选, 所以必须快速及准确地定量细胞培养液中的 IgG 而且, 即使在工业制备过程中,IgG 的定量也是重要的质量控制项目之一为此, 本研究采用了以 Protein A 为键合官能团的亲和层析法 (AFC), 主要介绍了旨在快速及准确分析 IgG 的 AFC 色谱柱 TSKgel Protein A-5PW 的基本性质特点和分离实例等 2. 色谱柱的基本特性 2-1. 填料的性质 TSKgel Protein A-5PW 是一款亲和 (AFC) 色谱柱, 该色谱柱是在多孔亲水性聚合物基质的 TSKgel G5000PW 填料表面导入重组 Protein A 官能团, 并充填到 PEEK 柱管内由于 Protein A 可与 IgG 的 Fc 区域发生特异性结合, 所以 Protein A 可以从含有 IgG 和杂质的细胞培养上清液等样品中特异性吸附分离 IgG 此外, 通过已知浓度的 IgG 制作校准曲线, 可以定量浓度未知样品中的 IgG TSKgel Protein A-5PW 色谱柱的基质官能团和官能团键合方法与散装填料 TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F 相同因此, 这款色谱柱与 TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F 具有相似的分离选择性能由于基质的粒径大机械强度高, 该色谱柱可在高流速条件下使用, 也可以用于 IgG 的高通量分析而且, 由于溶剂变化引起的填料溶胀效应比较小, 所以可以在流动相中添加有机溶剂此外, 该色谱柱还采用了化学稳定性高耐碱性的官能团, 所以可使用 NaOH 水溶液进行清洗使用 NaOH 水溶液清洗色谱柱时, 请从进样阀注入 0.1 mol/l NaOH 水溶液 ml 表 1 所示为 TSKgel Protein A-5PW 色谱柱的规格表 1 TSKgel Protein A-5PW 色谱柱的规格品名 TSKgel Protein A-5PW 产品货号基质多孔亲水性聚合物平均粒径 20 µm 填料平均孔径 100 nm 官能团重组 Protein A 尺寸 4.6 mm I.D. x 3.5 cm 色谱柱材质 PEEK 出货溶剂 20 % 乙醇水溶液 2-2. 标准分离条件多数 IgG 在中性条件下 (ph ) 被 Protein A 吸附, 在酸性条件下 (ph ) 洗脱, 因此使用 TSKgel Protein A-5PW 分离抗体时, 通常采用两种 ph 不同溶液的阶梯式梯度洗脱法吸附和洗脱的流动相一般使用, 但流动相也可以使用低 ph 值的柠檬酸盐缓冲液采用吸附缓冲液预先平衡色谱柱后 ( 使用 5 倍以上柱体积的缓冲液平衡 ), 进样后, 仅 IgG 被吸附在柱子上之后, 更换成洗脱用流动相, 洗脱出 IgG 可以在流动相内添加高浓度盐 ( 比如 0.15 mol/l NaCl 等 ), 不过疏水性高的 IgG 在色谱柱上容易发生非特异性吸附, 对此需多加留意此外, 分析疏水性高的 IgG 时, 在平衡液和洗脱液中添加乙醇等水溶性有机溶剂或精氨酸 (0.2mol/L) 可以有效抑制非特异性吸附但是, 上述情况可能会因更换流动相导致基线波动, 因此在进样前, 就请更换流动相, 并进行确认表 2 为具有代表性的洗脱液示例, 不同 IgG 其最佳条件也不同, 建议对不同的样品进行条件优化图 1 为 IgG 单克隆抗体的分离示例

3 UV 280nm 表 2 流动相示例例 1 例 2 例 3 流动相 A:20 mmol/l 磷酸钠缓冲液,pH 7.4 流动相 B:20 mmol/l 磷酸钠缓冲液,pH 2.5 流动相 A:20 mmol/l 磷酸钠缓冲液,pH 7.4/ 乙醇 =90/10(v/v) 流动相 B:20 mmol/l 磷酸钠缓冲液,pH 2.5/ 乙醇 =90/10(v/v) 流动相 A:20 mmol/l 磷酸钠缓冲液,pH 7.4 流动相 B:50 mmol/l 柠檬酸钠缓冲液,pH 2.5 CHO 细胞培养液中的杂质分析条件色谱柱 : TSKgel Protein A-5PW (4.6 mm I.D. 3.5 cm) 流动相 A: 20 mmol/l 磷酸钠缓冲液,pH 7.4 B: 20 mmol/l 磷酸钠缓冲液,pH 2.5 图 1 IgG 单克隆抗体的分离 min 阶梯梯度 : 分钟流动相 A 分钟流动相 B 分钟流动相 A( 再平衡 ) ( 在进样泵和注射器之间安装静态混合器 ( 容量 10 µl)) 流速 : 2.0 ml/min 检测 : UV 280nm 温度 : 25 进样量 : 20 µl 样品 : (I) 含 0.5g/L IgG 单克隆抗体的 CHO 细胞培养上清液 (II)0.5g/L IgG 单克隆抗体 ( 溶于流动相 A) 2-3. 流动相中盐浓度和添加剂的影响图 2 所示为采用各种流动相分离含有 IgG 单克隆抗体的中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞培养上清液时的色谱图已知任一流动相都可以洗脱出 IgG, 但其洗脱时间和峰的形状不同本研究采用的 IgG 单克隆抗体, 在含 0.15 mol/l NaCl 的流动相 ( 色谱图 (3)) 中其色谱峰洗脱最慢, 且拖尾另一方面,IgG 单克隆抗体在含 0.2 mol/l 精氨酸的流动相 ( 色谱图 (5)) 中洗脱最快, 不过其色谱峰与在 0.15 mol/l NaCl 中相同, 峰形拖尾但是, 该 IgG 单克隆抗体在吸附组分的相对峰面积上无显著差异, 表明精氨酸对结合能力及回收率的影响较小如上所述, 流动相成分不同,IgG 的出峰结果也不同, 但可以预计 IgG 的特性不同, 其出峰结果也不同如前所述, 由于最佳洗脱条件因 IgG 而异, 所以建议对分析条件进行优化

4 UV 280nm UV 280nm 分析条件除了流动相和样品外, 其他条件与图 1 相同 20 mmol/l ( 吸附组分的相对峰面积 :41%) 50 mmol/l (41 %) 20 mmol/l mol/l NaCl (39 %) 20 mmol/l + 10 % 乙醇 (40 %) 20 mmol/l mol/l Arg (40 %) min 图 2 流动相盐浓度及添加剂对 IgG 单克隆抗体分离的影响流动相 (1) A: 20 mmol/l 磷酸钠缓冲液,pH 7.4 B: 20 mmol/l 磷酸钠缓冲液,pH 2.5 (2) A: 50 mmol/l 磷酸钠缓冲液,pH 7.4 B: 50 mmol/l 磷酸钠缓冲液,pH 2.5 (3) A: 20 mmol/l 磷酸钠缓冲液 mol/l NaCl,pH 7.4 B: 20 mmol/l 磷酸钠缓冲液 mol/l NaCl,pH 2.5 (4) A: 20 mmol/l 磷酸钠缓冲液,pH 7.4 / 乙醇 = 90/10(v/v) B: 20 mmol/l 磷酸钠缓冲液,pH 2.5 / 乙醇 = 90/10(v/v) (5) A: 20 mmol/l 磷酸钠缓冲液 +0.2 mol/l 精氨酸,pH 7.4 B: 20 mmol/l 磷酸钠缓冲液 +0.2 mol/l 精氨酸,pH 2.5 样品 : 含 0.5g/L IgG 单克隆抗体的 CHO 细胞培养上清液 IgG 溶出 ph 2.2( 吸附组分的相对面积 :38%) 2-4. 流动相 ph 的影响 IgG 溶出 ph 2.5(38%) IgG 溶出 ph 3.0(38%) 图 3 所示为在各种 ph 值的流动相 B 条件下, 含有 0.5 g/l IgG 单克隆抗体的 CHO 细胞培养上清液的色谱图随着 ph 值升高, 出峰会变慢 ( 色谱图 (1) (3)), 但对 IgG 单克隆抗体的峰形状和吸附组分相对峰面积基本没有影响而且, 在使用柠檬酸钠缓冲液时 ( 色谱图 (4)) 其出峰结果也相同此外,pH 2.5 的柠檬酸钠缓冲液与 ph 2.2 的磷酸钠缓冲液的出峰时间几乎相同, 这是因为本研究使用的柠檬酸钠缓冲液浓度高于磷酸钠缓冲液浓度, 所以 ph 更易快速发生变化分析条件 IgG 溶出 ph 2.5(39%) 图 3 流动相 ph 对 IgG 单克隆抗体分离的影响 min 除流动相以外, 其他条件与图 2 相同流动相 A: 20 mmol/l 磷酸钠缓冲液,pH 7.4 B: (1) 20 mmol/l 磷酸钠缓冲液,pH 2.2 (2) 20 mmol/l 磷酸钠缓冲液,pH 2.5 (3) 20 mmol/l 磷酸钠缓冲液,pH 3.0 (4) 50 mmol/l 柠檬酸钠缓冲液,pH 2.5

5 峰面积峰面积 2-5. 校准曲线取用 TSKgel Protein A-5PW 色谱柱与其他公司的 Protein A 色谱柱, 在不同载量下对市售 IgG 单克隆抗体样品进行分离, 绘制吸附成分峰面积 -IgG 载量线性关系图, 并计算近似直线 ( 校准曲线 ) 和判定系数, 计算结果如图 4 所示其他公司的 Protein A 色谱柱在高浓度范围下呈线性下降, 而 TSKgel Protein A-5PW 色谱柱在宽范围的载量下与峰面积之间呈良好线性关系 ( g/l (2 200 μg), R 2 =0.9996), 这表明 IgG 的定量范围很广, 可以用来测定培养初期的低浓度样品至高浓度样品此时的色谱图如图 5 所示低载量到高载量组分均可制得良好的色谱图如图 6 所示, 即使采用含 10% 乙醇的流动相, 校准曲线的线性关系也很良好 TSKgel Protein A-5PW 色谱柱 A 公司色谱柱 IgG 载量 (µg) 图 4 IgG 的校准曲线分析条件 (1) TSKgel Protein A-5PW(4.6 mm I.D. 3.5 cm) 除样品以外, 其他条件与图 1 相同图 5 样品载量不同 IgG 的色谱图分析条件与图 4(1) 相同样品 : g/l IgG 多克隆抗体 ( 溶于洗脱液 A) (2) 其他色谱柱 (4.0 mm I.D. 3.5 cm, PEEK) 除流动相和流动相更换条件, 其他条件与 (1) 相同流动相 A: 50 mmol/l 磷酸钠缓冲液 mol/l NaCl, ph 7.4 B: 50 mmol/l 磷酸钠缓冲液 mol/l NaCl, ph 2.5 流动相更换 :0 0.2 分钟流动相 A 分钟流动相 B 分钟流动相 A( 再平衡 ) IgG 载量 (µg) 图 6 IgG 的校准曲线 ( 含 10% 乙醇的洗脱液 ) 分析条件除流动相外, 其他条件与图 4(1) 相同流动相 A:20 mmol/l 磷酸钠缓冲液,pH 7.4/ 乙醇 =90/10 (v/v) B:20 mmol/l 磷酸钠缓冲液,pH 2.5/ 乙醇 =90/10 (v/v)

6 相对峰面积 (%) 峰面积 2-6. 色谱柱的耐用性取用含 IgG 单克隆抗体的 CHO 细胞培养上清液作为样品, 连续进样 2000 针以上进行稳定性测试每进样约 400 针时的色谱图如图 7 所示, 峰形未见显著变化而且, 在第 2009 次进样后, 采用市售 IgG 单克隆抗体制作校准曲线时, 如图 8 所示, 测试前后未见线性有差异但是, 如果样品中含有难溶物质, 则容易在色谱柱入口积蓄, 可能导致色谱柱性能下降因此在进样前, 需过滤样品, 或在注射器和色谱柱之间安装管路过滤器 ( 品名 : 管路过滤器 PEEK 产品编号: ), 通过适当更换该过滤器, 可以防止分析柱老化以便长时间稳定地进行测定进样次数测试前测试后样品载量 (μg) 图 7 连续进样测试时的色谱图分析条件与图 1 相同样品 : 含 10 g/l IgG 多克隆抗体的 CHO 细胞培养上清液图 8 连续进样测试前后的 IgG 校准曲线分析条件与图 1 相同样品 : g/l IgG 多克隆抗体 ( 溶于流动相 A) 2-7. 碱性溶液清洗一般情况下, 为了去除被强烈吸附在色谱柱上的成分时, 选用 NaOH 溶液进行清洗是非常有效的, 但也可能对色谱柱造成损伤因此, 我们对碱性溶液清洗前后的色谱柱性能进行了确认使用进样阀进样 0.1 mol/l NaOH 溶液 500 μl 后, 再进行清洗反复该操作 5 次后, 进样 IgG 单克隆抗体, 测定吸附组分的峰面积然后, 再进样 5 次 ( 合计进样 10 次 ) 后测定 IgG 吸附组分的峰面积碱性溶液清洗前后的峰面积 ( 相对值 ) 如图 9 所示进样 5 次后 10 次后的峰面积与清洗前的峰面积几乎相同, 色谱柱的吸附性能未见变化清洗前 500 µlx5 次后 500 µlx10 次后图 9 碱性溶液清洗前后的相对峰面积分析条件除样品以外, 其他条件与图 1 相同样品 :10 g/l IgG 多克隆抗体 ( 溶于洗脱液 A) ( 采用进样阀注入 0.1 mol/l NaOH 溶液 500 μl 每进样 5 次需分离 IgG 单克隆抗体 )

7 峰面积 2-8. 填料的批间差异图 10 所示为采用 3 个批次的填料分离 IgG 单克隆抗体的色谱图已知 IgG 的峰形未见显著性差异, 填料批间差异较小此外, 如图 11 所示, 批间未见校准曲线的线性有显著性差异 A 批次 C 批次 B 批次 B 批次 C 批次 A 批次 IgG 载量 (µg) 图 10 3 个批次填料测得的 IgG 色谱图分析条件除样品以外, 其他条件与图 1 相同样品 :5 g/l IgG 多克隆抗体 ( 溶于流动相 A) 图 11 3 个批次填料的 IgG 校准曲线分析条件与图 1 相同样品 : g/l IgG 多克隆抗体 ( 溶于流动相 A) 3. 分离实例 3-1. 快速分析图 12 所示为不同流速下分离含有 IgG 单克隆抗体的 CHO 细胞培养上清液时的色谱图流速在 1.0 ml/min 至 4.0 ml/min 范围内, 吸附组分的相对峰面积几乎无差异此外, 采用 IgG 单克隆抗体, 在流速 1.0 ml/min 及 4.0 ml/min 条件下制成的校准曲线如图 13 所示在任一流速下均得到良好线性分析条件 4.0 ml/min ( 吸附组分峰的相对面积 :41%) 流速和流动相更换条件流速流动相 A 流动相 B 流动相 A 1.0 ml/min 分钟分钟分钟 2.0 ml/min 分钟分钟分钟 3.0 ml/min 分钟分钟分钟 4.0 ml/min 分钟分钟分钟样品 : 含 IgG 单克隆抗体 (0.5g/L) 的 CHO 细胞培养上清液 ( 其他分析条件与图 1 相同 ) 图 12 流速对分离效果的影响

8 峰面积 IgG 载量 (µg) 图 13 流速对校准曲线的影响分析条件除样品以外, 其他条件与图 12 相同样品 : g/l IgG 多克隆抗体 ( 溶于流动相 A) 3-2. IgG 单克隆抗体的定量 ( 加标回收试验 ) 采用已知浓度的 IgG 单克隆抗体制成校准曲线然后, 对添加了相同 IgG 单克隆抗体的 CHO 细胞培养上清液进行分离, 并计算 IgG 单克隆抗体的回收率色谱图和校准曲线如图 14 所示, 加标回收率如表 3 所示在任一浓度下均制得 % 的回收率, 在很宽的浓度范围下可以定量 IgG 表 3 加标回收率 IgG(g/L) 回收率 (%) 添加浓度定量结果 ( 分离条件参照图 14) 4. 总结上述报告内容对高性能亲和色谱柱 TSKgel Protein A-5PW 进行了详细介绍这款色谱柱耐用性良好, 可使用碱性溶液来清洗, 适用于对含有较多杂质的细胞培养液中的图 14 IgG 单克隆抗体的分离检测条件除样品以外, 其他条件与图 1 相同样品 : g/ligg 单克隆抗体 (20 mmol/l 磷酸钠缓冲 IgG 进行快速和高精度定量此外,IgG 的定量范围广, 可用于分析培养初期的低浓度样品至高浓度样品液 mol/l NaCl,pH 7.4 下溶解 ) 含 g/l IgG 单克隆抗体的 CHO 细胞培养上清液

9 TSKgel TOYOPEARL 系东曹株式会社的注册商标东曹 ( 上海 ) 生物科技有限公司地址 : 上海市徐汇区虹梅路 1801 号 A 区凯科国际大厦 1001 室电话 : 传真 : 电子邮箱 :info@tosoh.com.cn 网址 :

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~ 1 ~ ~ 2 ~ 1-1 UHPLC-SEC 法对治疗性抗体的分析 TSKgel UP-SW3 UHPLC HPLC A TSKgel UP-SW3 2 μm (4.6 mm ID. 15 cm B UHPLC-SEC 1.7 μm (4.6 mm ID. 15 cm mmol/l (ph 6.7 + 2SO4 mmol/l Na +.5 % NaN3.35 ml/ 25 UV 28 nm 5